吳國(guó)杰，林學(xué)貴，陳 琳，劉 永

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，廣州 510225；2.肇慶學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院，廣東肇慶 526061）

0 引言

硒是人體內(nèi)重要的微量元素之一，對(duì)于人體的新陳代謝以及免疫功能起到很重要的作用。世界衛(wèi)生組織建議人們每天補(bǔ)充適量的硒，提高免疫力和預(yù)防許多種疾?。?］。適當(dāng)補(bǔ)充硒元素對(duì)于人體的代謝和免疫有很大的好處，人們生活中通過(guò)水果、青菜等綠色食品攝取硒低，難以滿足人們對(duì)硒的需求［2］。所以生物活性高、易吸收、低毒性硒的制備顯得非常重要。

納米硒粒徑小、表面活性中心多、生物活性高、毒性低、易吸收利用、穩(wěn)定性高，是目前最有效最安全硒源［3］。研究表明，納米硒具有良好抗癌、提高免疫力、抗氧化、促進(jìn)生長(zhǎng)以及提高生殖能力作用［4-7］。研究如何更快捷便利制備有效的納米硒是目前重要的研究?jī)?nèi)容之一。Oremland等發(fā)現(xiàn)可以利用生物轉(zhuǎn)化合成有機(jī)納米硒［8］，F(xiàn)esharaki等通過(guò)肺炎克雷伯氏菌將硒化物轉(zhuǎn)化形成有機(jī)納米硒［9］。

乳酸菌是益生菌，對(duì)促進(jìn)消化、腸胃健康等有很大幫助，廣泛應(yīng)用于食品、制藥、生物技術(shù)等領(lǐng)域［10-11］。劉文群等［12］利用保加利亞乳桿菌新陳代謝將無(wú)機(jī)鉻轉(zhuǎn)化成細(xì)胞內(nèi)的有機(jī)鉻，有機(jī)態(tài)鉻吸收迅速，且安全性和利用率高。保加利亞乳桿菌自身的生物轉(zhuǎn)化作用能將乳酸菌以及其產(chǎn)生的乳酸菌素和微量元素的益處結(jié)合于一起。本研究采用保加利亞乳桿菌為載體，通過(guò)其自身的新陳代謝吸收亞硒酸鈉，制備有機(jī)納米硒，對(duì)制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，并利用掃描電子顯微電鏡對(duì)制備的有機(jī)納米硒進(jìn)行形貌分析，為有機(jī)納米硒的生物制備提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛肉浸膏、酵母提取粉、細(xì)菌學(xué)蛋白胨購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；葡萄糖、磷酸氫二鉀、檸檬酸三鈉、七水合硫酸鎂、硫酸錳、乙酸鈉、吐溫-80、瓊脂粉購(gòu)于天津市福晨化學(xué)試劑廠；亞硒酸鈉購(gòu)于山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；硒代甲硫氨酸購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司，其他試劑均為分析純。

XSP-5CA生物顯微鏡（上海光學(xué)儀器六廠）、AFS-2000雙道原子熒光光度計(jì)（北京科創(chuàng)海光儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 MRS培養(yǎng)基的制備

將牛肉浸膏10 g、酵母提取粉10 g、葡萄糖10 g、細(xì)菌學(xué)蛋白胨10 g、磷酸氫二鉀2 g、檸檬酸三鈉5 g、七水合硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.05 g、乙酸鈉5 g、吐溫-80 1mL（固體培養(yǎng)基加入2%的瓊脂粉加熱至沸騰），溶解于1 000 mL蒸餾水。使用HCl溶液調(diào)pH值至6.2～6.4，培養(yǎng)基分裝入250 mL錐形瓶，包裝標(biāo)記后放入高壓蒸汽鍋。121 ℃高壓滅菌25 min后，冷卻備用（或冷卻至45 ℃左右倒平板，培養(yǎng)皿倒置備用）。

1.2.2 保加利亞乳桿菌菌種的提純

將1 g酸奶發(fā)酵粉加入MRS液體培養(yǎng)基，放置于37 ℃培養(yǎng)箱24 h。取0.2 mL菌液均勻滴加于固體培養(yǎng)基表面，用涂布器涂勻，于37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)2～3天。接種針挑取單個(gè)菌落，在固體培養(yǎng)基表面平板劃線，37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)2～3天。接種針挑取單菌落，將其接種于液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，制成菌液備用。

1.2.3 菌種鑒定

參考周家春［13］的方法。菌種形態(tài)鑒定：采用革蘭氏染色法染色，菌種預(yù)處理后，在電子顯微鏡下觀察。生化鑒定：接種環(huán)挑取單菌落，接種于細(xì)菌微量生化鑒定管，培養(yǎng)24～48 h后觀察鑒定管的顏色變化。

1.2.4 納米硒的制備

取1 mL菌液接種于100 mL液體培養(yǎng)基中，振蕩搖勻，放置生化培養(yǎng)箱37 ℃活化24 h。取已活化的菌液接種于150 mL液體培養(yǎng)基中，振蕩搖勻，放置生化培養(yǎng)箱37 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)15 h。加入一定濃度的亞硒酸鈉溶液，搖勻后放置生化培養(yǎng)箱37 ℃反應(yīng)48 h。將上述溶液在離心機(jī)轉(zhuǎn)速為4 000 r/min條件下離心3 min，用去離子水洗滌沉淀物，上清液再離心一次，上述步驟重復(fù)3次，沉淀物烘干得到有機(jī)納米硒產(chǎn)品。

1.2.5 產(chǎn)品硒含量的測(cè)定

根據(jù)李剛［14］的方法稍作修改。準(zhǔn)確稱取0.05 g產(chǎn)品，倒入小燒杯，加入5 mL混酸溶液（HNO3：HClO4=4：1），冷消一晚上。放置電熱板上熱消4 h以上，直至有濃烈的白煙，加入5 mL 50% HCl溶液，加熱至溶液體積為1～2 mL。將消化完的產(chǎn)品倒入100 mL容量瓶，適量的高純水洗滌小燒杯中殘留的液體后，倒入容量瓶，使用高純水定容。移液槍取1 mL定容溶液于100 mL容量瓶，加入60 mL 50% HCl溶液，使用高純水定容，在原子熒光光度計(jì)上測(cè)定。根據(jù)使用亞硒酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到產(chǎn)品硒含量：

1.2.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化納米硒的制備

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以產(chǎn)品硒含量為優(yōu)化指標(biāo)，選擇亞硒酸鈉濃度、保加利亞乳桿菌接種量、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度4因素3水平進(jìn)行優(yōu)化納米硒制備工藝。

1.2.7 掃描電子顯微電鏡觀察

根據(jù)肖媛［15］的方法，將產(chǎn)品噴金后進(jìn)行掃描電鏡，觀察產(chǎn)品的形貌。

1.2.8 硒代甲硫氨酸含量的測(cè)定

稱取適量樣品，依次加入30 mmoL/LTris-HCl緩沖溶液5 mL和20 mg胃蛋白酶XIV，渦旋30 s混勻，放于37 ℃恒溫箱中孵育24 h，取出冷卻后10 000 r/min離心10 min，取上清液過(guò)0.45 μm濾膜，稀釋20倍后，以硒代甲硫氨酸為標(biāo)準(zhǔn)物，在1290-6460液相色譜儀質(zhì)譜儀（Agilent）上測(cè)定硒代甲硫氨酸含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)平行測(cè)定3次，采用SPSS20進(jìn)行差異性分析，p＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 保加利亞乳桿菌的篩選

從圖1（a）可知，保加利亞乳桿菌菌落在MRS培養(yǎng)基上，菌落顏色為淡白色或透明，形狀呈圓點(diǎn)，表面質(zhì)地光滑。保加利亞乳桿菌具有將亞硒酸鈉轉(zhuǎn)化成紅色單質(zhì)硒的能力。挑選具有保加利亞乳桿菌菌落特征的單菌落，接種劃線至添加亞硒酸鈉的MRS培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)3～5天，結(jié)果見(jiàn)圖1（b）。成型的菌落是光滑小圓點(diǎn)，顏色呈紅色，即為保加利亞乳桿菌。

2.2 保加利亞乳桿菌的鑒定

采用革蘭氏染色法染色、制片，采取生物顯微鏡觀察其形態(tài)，鏡檢結(jié)果：革蘭氏陽(yáng)性菌且細(xì)胞形狀呈現(xiàn)桿狀。為更加準(zhǔn)確確認(rèn)上述乳桿菌為保加利亞乳桿菌，避免其他桿菌影響。根據(jù)乳桿菌的生化特性，參考周家春［11］的方法進(jìn)行鑒定。將菌液接種于相應(yīng)的生化鑒定發(fā)酵管，于培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察其顏色變化，鑒定結(jié)果如表1所示。由表1可知乳糖發(fā)酵試驗(yàn)為陽(yáng)性，麥芽糖和七葉苷發(fā)酵試驗(yàn)都為陰性，即為保加利亞乳桿菌。

表1 桿菌的生化特征

2.3 亞硒酸鈉濃度對(duì)硒含量的影響

由圖2可知，隨著亞硒酸鈉濃度的上升，產(chǎn)品硒含量增加，當(dāng)亞硒酸鈉濃度為0.6 mg/mL時(shí)硒含量最大，之后呈下降趨勢(shì)。亞硒酸鈉濃度水平對(duì)硒含量差異性顯著（p＜0.05），所以制備納米硒時(shí)亞硒酸鈉濃度為0.6 mg/mL較為合適。

2.4 保加利亞乳桿菌接種量對(duì)硒含量的影響

由圖3可知，隨著保加利亞乳桿菌接種量的增加，產(chǎn)品硒含量增加并在8%處達(dá)到最大值，之后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。保加利亞乳桿菌接種量水平對(duì)硒含量差異性顯著（p＜0.05），所以制備納米硒時(shí)保加利亞乳桿菌接種量為8%比較合適。

2.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)硒含量的影響

由圖4可知，產(chǎn)品硒含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加先增加后降低，在60 h達(dá)到峰值。培養(yǎng)時(shí)間水平對(duì)硒含量差異性顯著（p＜0.05），所以制備納米硒時(shí)培養(yǎng)時(shí)間為48 h比較合適。

2.6 起始培養(yǎng)基pH值對(duì)硒含量的影響

由圖5可知，產(chǎn)品硒含量隨MRS液體培養(yǎng)基起始pH值的增加逐漸降低。這可能在酸性條件下，會(huì)促進(jìn)保加利亞乳桿菌的新陳代謝，而堿性條件促進(jìn)保加利亞乳桿菌的生長(zhǎng)與分裂。所以固定起始培養(yǎng)基pH值為6.2不變進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

2.7 培養(yǎng)溫度對(duì)硒含量的影響

由圖6可知，隨著培養(yǎng)溫度的上升，產(chǎn)品硒含量逐漸增加，當(dāng)溫度高于43 ℃，硒含量開(kāi)始下降。培養(yǎng)溫度水平對(duì)硒含量差異性顯著（p＜0.05），所以制備納米硒時(shí)培養(yǎng)溫度為43 ℃比較合適。

2.8 正交試驗(yàn)優(yōu)化制備有機(jī)納米硒

在分析A（亞硒酸鈉濃度，mg/mL）、B（培養(yǎng)溫度，℃）、C（培養(yǎng)時(shí)間，h）和D（保加利亞乳桿菌接種量，%）的單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以產(chǎn)品硒含量（mg/g）為優(yōu)化指標(biāo)，固定起始培養(yǎng)基pH值為6.2不變，對(duì)亞硒酸鈉濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間和保加利亞乳桿菌接種量采用4因素3水平正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化有機(jī)納米硒制備工藝，試驗(yàn)結(jié)果與直觀分析見(jiàn)表2。極差R值的大小，表示該列因素在試驗(yàn)范圍內(nèi)的變化對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響的大小。R值越大說(shuō)明該列因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響越顯著。從表2可知，4因素對(duì)硒含量的影響順序?yàn)榕囵B(yǎng)時(shí)間（C）＞保加利亞乳桿菌接種量（D）＞亞硒酸鈉濃度（A）＞培養(yǎng)溫度（B），有機(jī)納米硒的最優(yōu)制備工藝為A2B3C2D1。根據(jù)最優(yōu)制備工藝進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，產(chǎn)品硒含量的平均值為68.23%。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及直觀分析

2.9 納米硒形貌分析

從掃描電鏡圖（略）可看出，保加利亞乳桿菌制備的紅色有機(jī)納米硒呈現(xiàn)規(guī)則顆粒狀，表面較為光滑，制備得到的有機(jī)納米硒粒徑為300～400 nm。

2.10 硒代甲硫氨酸的含量分析

以硒代甲硫氨酸為標(biāo)準(zhǔn)物，利用液相色譜儀質(zhì)譜儀測(cè)定反應(yīng)前保加利亞乳桿菌、反應(yīng)后產(chǎn)物中硒代甲硫氨酸的含量。硒代甲硫氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=545.05x-101.03（R2=0.999 99），保加利亞乳桿菌、產(chǎn)物中硒代甲硫氨酸的含量分別0.0，6.04 mg/kg，說(shuō)明上述推理成立。

3 結(jié)語(yǔ)

在分析單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化有機(jī)納米硒的制備工藝。各因素對(duì)硒含量的影響順序?yàn)榕囵B(yǎng)時(shí)間＞保加利亞乳桿菌接種量＞亞硒酸鈉濃度＞培養(yǎng)溫度。有機(jī)納米硒的最佳制備工藝為亞硒酸鈉濃度0.6 mg/mL、培養(yǎng)溫度46 ℃、培養(yǎng)時(shí)間60 h、保加利亞乳桿菌接種量6%和起始培養(yǎng)基pH 6.2，此條件下產(chǎn)品的硒含量為68.23%。保加利亞乳桿菌制備有機(jī)納米硒呈現(xiàn)規(guī)則顆粒狀，表面較為光滑，粒徑為300～400 nm。