新疆醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院淋巴瘤乳腺科，新疆 烏魯木齊 830000

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，也是女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因［1］。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的進步及乳腺癌早期篩查理念的普及，早期乳腺癌患者的生存率已有明顯提高。然而乳腺癌的診斷和臨床管理復(fù)雜化體現(xiàn)在乳腺癌在腫瘤發(fā)展的早期階段即有惡性腫瘤細胞進入血液循環(huán)的傾向，從而形成轉(zhuǎn)移性病變。復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是影響乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)鍵因素，其涉及的病理學(xué)機制復(fù)雜，臨床上尚未開發(fā)出早期監(jiān)測的生物學(xué)標(biāo)志物?；煛⒎暖?、內(nèi)分泌治療及靶向治療是乳腺癌的主要治療方式，但腫瘤細胞的多藥耐藥性是導(dǎo)致治療失敗的主要原因。腫瘤的多藥耐藥機制尚不清楚，因此解析多藥耐藥與基因多態(tài)性的關(guān)系對于增強藥物的敏感性及改善患者的預(yù)后均具有十分重要的意義［2-4］。

乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）是體內(nèi)重要的跨膜外排轉(zhuǎn)運體，是目前研究多藥耐藥性的熱點蛋白之一。在正常人體組織中，BCRP在胎盤合胞體滋養(yǎng)層、腸上皮、肝細胞、腦微血管內(nèi)皮細胞和腎近曲小管上皮細胞的頂端膜上高度表達，有助于吸收、分布、消除藥物和內(nèi)源性化合物［5］。目前，已發(fā)現(xiàn)200多種化療藥物為BCRP的底物，如米托蒽醌或蒽環(huán)類藥物，可致化療耐藥；對多個酪氨酸激酶抑制劑，如拉帕替尼、奧拉帕尼等有較強的外排能力，可導(dǎo)致靶向耐藥［6］。目前已知BCRP的編碼基因三磷酸腺苷結(jié)合盒家族G2（adenosine triphosphate-binding cassette family G2，ABCG2）上有超過80個單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點，并且部分SNP位點與化療藥物的敏感性之間存在聯(lián)系［7-8］。本研究以新疆地區(qū)女性乳腺癌患者為對象，采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和測序技術(shù)對ABCG2基因的rs2231142、rs2231137、rs2032582和rs1045642位點進行分析，并進行組間比較，以明確該基因與新疆地區(qū)乳腺癌復(fù)發(fā)之間的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 一般資料

收集2014年12月—2015年12月首診于新疆醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院且組織樣本石蠟包埋完整和臨床資料齊全的女性乳腺癌患者。其中經(jīng)手術(shù)、化放療、內(nèi)分泌治療或靶向治療后2年內(nèi)復(fù)發(fā)的患者150例，同期2年內(nèi)未出現(xiàn)復(fù)發(fā)的患者162例。所有病例均有完整的臨床病理學(xué)資料和隨訪資料。

1.1.1 納入標(biāo)準

①經(jīng)病理學(xué)檢查確診為乳腺癌；② 根治術(shù)后輔助治療為TA C 或TA 方案：紫杉醇135 mg/m2或多西他賽75 mg/m2，靜脈滴注，第1天；吡柔比星40 mg/m2，靜脈滴注，第1天；環(huán)磷酰胺（C）500 mg/m2，靜脈滴注，第1天。每21 d為1個周期，共6個周期；③接受規(guī)范的手術(shù)、化放療、內(nèi)分泌或靶向治療。

1.1.2 排除標(biāo)準

①非新疆長期居住人群（在疆居住時間＜15年）的患者；② 無法追溯其根治術(shù)時乳腺手術(shù)組織標(biāo)本的患者。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要試劑

石蠟包埋組織DNA快速提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，瓊脂糖、DNA Marker DL2000均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，核酸染料購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2.2 主要儀器

臺式離心機購自上海安亭科學(xué)儀器廠，漩渦混合器購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司，干式恒溫器購自杭州美盛化工有限公司；核酸蛋白定量儀購自杭州奧康集團有限公司，電泳儀電源、電泳槽購自北京六一生物科技有限公司，凝膠成像系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中人ABCG2基因rs2231142、rs2231137、rs2032582和rs1045642位點采用Primer 5.0軟件設(shè)計，引物序列、長度及退火溫度見表1。所有引物自行設(shè)計后由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 實驗方法

用石蠟包埋組織DNA快速提取試劑盒提取蠟塊中DNA，在全自動分光光度計中檢測提取出的DNA純度和濃度。取2 μL DNA加入配置好的反應(yīng)液中進行PCR擴增（反應(yīng)體系見表2），擴增產(chǎn)物上樣于3%瓊脂糖凝膠孔中，120 V恒壓電泳30 min，電泳完畢后使用凝膠成像儀觀察，條帶位置正確的樣本送測序公司測序。

表1 位點引物序列Tab.1 Sequences of site primers

表2 PCR反應(yīng)體系（25 μL）Tab.2 PCR reaction system (25 μL)

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

有復(fù)發(fā)組和無復(fù)發(fā)組在關(guān)聯(lián)分析前分別進行Hardy-Weinberg檢驗。應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析。采用χ2檢驗比較基因型和等位基因頻率，并計算出95% CI。采用t檢驗、方差分析和非參數(shù)檢驗對不同基因型的臨床參數(shù)進行比較。多因素分析采用二維logistic回歸分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者各因素比較分析

比較兩組2年臨床病理學(xué)資料和隨訪資料，結(jié)果表明，年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)、雌激素受體（estrogen receptor，ER）（+）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）（+）、組織學(xué)分級這5個因素在無復(fù)發(fā)組和復(fù)發(fā)組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表3）。

表3 2年內(nèi)有復(fù)發(fā)組和無復(fù)發(fā)組患者一般資料比較Tab.3 Comparison of general data of patients with relapse group and relapse-free group within 2 years

2.2 PCR擴增與瓊脂糖凝膠電泳

對ABCG2基因的rs2231142、rs2231137、rs2032582和rs1045642位點進行PCR擴增，結(jié)果表明，擴增片段與預(yù)期一致，電泳條帶單一清晰（圖1）。

2.3 Hardy-Weinberg檢驗

表4為rs2231142、rs2231137、rs2032582和rs1045642位點的Hardy-Weinberg平衡檢驗，其中rs1045642、rs2032582、rs2231142位點在無復(fù)發(fā)組和有復(fù)發(fā)組中表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），可能是由于該研究中所有樣本均來源于患者，而非正常人群。

2.4 不同等位基因位點在不同組中分布差異及優(yōu)勢比估計

通過比較復(fù)發(fā)組和無復(fù)發(fā)組ABCG2基因4個SNP位點基因型分布及等位基因頻率，發(fā)現(xiàn)rs2032582位點在新疆地區(qū)乳腺癌患者2年內(nèi)無復(fù)發(fā)組及有復(fù)發(fā)組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表5）。

圖1 ABCG2基因4個SNP位點PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of the four SNP loci of the ABCG2 gene

表4 4個SNP位點基因型分布Hardy-Weinberg平衡檢驗Tab.4 Hardy-Weinberg equilibrium test for genotypic distribution of 4 SNP loci

表5 SNP位點不同等位基因在復(fù)發(fā)組和無復(fù)發(fā)組中的分布Tab.5 The distribution of different alleles of the SNP locus in the relapse group and relapse-free group

2.5 兩組患者一般資料及SNP位點多因素比較

在單因素分析的基礎(chǔ)上，將基因型和單因素分析P＜0.1的因素：年齡、腫塊大小、PR（+）、組織學(xué)分級、rs2032582 GG型（+）與2年復(fù)發(fā)的關(guān)系采用采用多因素logistic逐步回歸進行分析。在對其他因素進行調(diào)整后，年齡沒有納入模型，故年齡被視作影響乳腺癌2年復(fù)發(fā)的混雜因素。而腫塊大小、ER（+）、PR（+）、組織學(xué)分級和rs2032582 GG型進入模型。分析結(jié)果顯示，腫塊大小、ER（+）、組織學(xué)分級和rs2032582 GG型可能為新疆地區(qū)乳腺癌患者復(fù)發(fā)的危險因素，而PR（+）則為保護因素（表6）。

表6 影響乳腺癌患者2年內(nèi)復(fù)發(fā)的logistic多因素分析Tab.6 Logistic multivariate analysis affecting breast cancer patients’ recurrence within 2 years

2.6 COX回歸模型分析臨床多指標(biāo)對判斷預(yù)后的意義

對單因素分析中差異顯著的腫塊大小、ER（+）、組織學(xué)分級、rs2032582 GG型（+）進行多因素分析，結(jié)果顯示，組織學(xué)分級和rs2032582 GG型對患者的預(yù)后有統(tǒng)計學(xué)價值，可能是影響乳腺癌復(fù)發(fā)的獨立預(yù)后因素（表7）。

2.7 2年有復(fù)發(fā)組ABCG2基因rs2032582位點基因型與乳腺癌復(fù)發(fā)的相關(guān)性分析

2年有乳腺癌有復(fù)發(fā)組ABCG2基因rs2032582位點基因型與臨床資料的相關(guān)性分析見表8。結(jié)果表明，G/T等位基因組的年齡極顯著高于A等位基因組（P＜0.01），而A等位基因組的腫塊大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)和ER（+）顯著高于G/T等位基因組（P＜0.05）。

表7 COX回歸模型分析結(jié)果Tab.7 Analysis of COX regression model

表8 ABCG2基因rs2032582位點基因型與有復(fù)發(fā)組臨床資料相關(guān)性分析Tab.8 Correlation analysis between the genotype of the ABCG2 gene rs2032582 and the clinical data of the relapse group

3 討 論

在化療前進行耐藥基因的測定，按個體化選擇用藥，對提高臨床療效具有十分重要的意義［9-10］。與腫瘤細胞的多藥耐藥性相關(guān)的蛋白主要有P-糖蛋白、BCRP和ABCG2［11］，均屬于ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白超家族，它們是異種生物轉(zhuǎn)運蛋白，通過細胞外膜和細胞內(nèi)膜運輸各種分子，在多藥耐藥中發(fā)揮作用［12］。其中，BCRP可能是一種細胞防御機制，以應(yīng)對米托蒽醌和蒽環(huán)類藥物的暴露［13］。BCRP由ABCG2基因編碼，ABCG2位于染色體4q22.1，共有21個外顯子，已發(fā)現(xiàn)該基因的多個轉(zhuǎn)錄變體編碼不同亞型［14-15］。

本研究以新疆地區(qū)2年內(nèi)復(fù)發(fā)的乳腺癌患者150例和同期2年內(nèi)未出現(xiàn)復(fù)發(fā)的乳腺癌患者162例為研究對象，采用簡便、準確、快速的PCR技術(shù)進行基因分型，結(jié)合測序的方法檢測ABCG2基因rs2231142、rs1045642、rs2231137和rs2231142位點基因多態(tài)性。結(jié)果顯示，僅rs2032582位點在乳腺癌2年無復(fù)發(fā)組和有復(fù)發(fā)組之間存在差異，rs1045642、rs2231137和rs2231142位點在無復(fù)發(fā)組和有復(fù)發(fā)組中表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義。同時G等位攜帶者發(fā)病風(fēng)險與正常A等位基因攜帶者相比提高了3.29倍。這些均提示rs2032582與新疆人群2年內(nèi)乳腺癌復(fù)發(fā)具有相關(guān)性。Wang等［16］采用流式細胞術(shù)、實時熒光定量PCR（realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR）、蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測了多發(fā)性骨髓瘤細胞系及臨床樣本中ABCG2的表達，并對PI3K/AKT信號通路加入抑制劑或激活劑后檢測ABCG2的表達變化，發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號通路可能通過一個潛在的負反饋調(diào)節(jié)機制調(diào)控ABCG2的表達，而ABCG2也可能通過負反饋調(diào)節(jié)機制調(diào)控同源性磷酸酶-張力蛋白的表達，即PI3K/AKT信號通路調(diào)控多發(fā)性骨髓瘤中ABCG2的表達，從而對化療產(chǎn)生耐藥性。Wang等［17］構(gòu)建食管癌小鼠模型，分為高劑量青蒿素組、低劑量青蒿素組、多柔比星組、多柔比星+高劑量青蒿素組、多柔比星+低劑量青蒿素組、0.9%NaCl溶液對照組，采用流式細胞術(shù)檢測7組中ABCG2蛋白表達和多柔比星濃度，發(fā)現(xiàn)ABCG2的mRNA和蛋白含量明顯高于普通食管癌組，在多柔比星+高劑量青蒿素組和多柔比星+低劑量青蒿素組中，腫瘤細胞的凋亡率和多柔比星濃度明顯下降，ABCG2蛋白的蛋白含量也明顯下降，提示青蒿素可調(diào)節(jié)ABCG2在食管癌中的表達，從而逆轉(zhuǎn)藥物耐藥。既往的研究已表明ABCG2參與到腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥的過程，如何進一步明確耐藥點及逆轉(zhuǎn)耐藥顯得十分必要。

以往的文獻中，曾愛華等［18］用RTFQ-PCR檢測了MDR1、MRP、LRP、GST-π、TOPOⅡa和BCRP基因在術(shù)前未化療過的乳腺癌組織中的表達水平，發(fā)現(xiàn)這6個耐藥基因在乳腺癌組織中的表達水平與臨床分期、ER、PR無關(guān)，其中只有BCRP在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的表達水平顯著高于其在非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達。本研究生化指標(biāo)分析結(jié)果顯示，2年乳腺癌復(fù)發(fā)與無復(fù)發(fā)患者的腫塊大小、ER（+）、PR（+）和組織學(xué)分級差異顯著（P＜0.05）。分析ABCG2基因rs2032582位點A等位基因組和G/T等位基因組的臨床生化指標(biāo)，G/T等位基因組的年齡顯著高于A等位基因組（P＜0.01），而A等位基因組的腫塊大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)和ER（+）顯著高于G/T等位基因組（P＜0.05），該結(jié)果進一步驗證了rs2032582基因型與乳腺癌復(fù)發(fā)相關(guān)的生化指標(biāo)可能存在相關(guān)性。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)有多個耐藥基因與乳腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。Abuhaliema等［19］檢測了約旦150例乳腺癌患者和150例正常對照組中MDR1的3個等位基因位點：C3435T（rs1045642）、G2677A/T（rs2032582）和C1236T（rs1128503），結(jié)果表明，攜帶C3435T（rs1045642）、G2677A/T（rs2032582）位點的人群可能增加乳腺癌的患病風(fēng)險。Wang等［20］的一項共納入了34個病例對照研究的Meta分析發(fā)現(xiàn)，MDR1的C3435T（rs1045642）位點與腫瘤的易感性相關(guān)，攜帶該位點的人群可增加患乳腺癌和腎癌的風(fēng)險。Vulsteke等［21］對991例接受FEC序貫T方案的早期乳腺癌患者隨訪，平均隨訪時間為5.2年，結(jié)果表明，rs203258的GT型比GG/GA型有更長的乳腺癌特異性生存期（breast cancer-specific survival，BCSS）。Argalácsová等［22］對71例絕經(jīng)前ER（+）的乳腺癌患者隨訪了56個月，該類患者均接受他莫昔芬內(nèi)分泌治療，并對該類人群進行基因檢測，隨訪結(jié)果顯示，攜帶rs1045642基因位點的患者生存時間明顯延長，而攜帶rs2032582基因位點的患者并未顯示出有更好的治療效果或生存時間的延長。Kuo等［23］對414例激素受體陽性的早期乳腺癌患者進行ESR1、UGT1A1等6個基因的多態(tài)性檢測發(fā)現(xiàn)，攜帶rs2231137（T/C）位點的乳腺癌患者有較差的無遠處轉(zhuǎn)移生存期（distant disease-free survival，DDFS）、無病生存期（disease-free survival，DFS）和總生存期（overall survival，OS），攜帶rs2231142位點的絕經(jīng)前乳腺癌患者有較好的DDFS和DFS，但攜帶rs2231142位點的絕經(jīng)后女性卻無明顯聯(lián)系。本研究只檢測出rs2032582位點差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其余3個位點差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，可能原因為新疆地域差異或是樣本量小所致。

結(jié)合既往研究結(jié)果，rs2032582位點可能為乳腺癌發(fā)病的危險因素及預(yù)后不良的因素之一，與本研究的結(jié)果相一致，且本研究中復(fù)發(fā)組GG型明顯高于其他突變類型，故新疆地區(qū)乳腺癌患者中攜帶rs2032582位點的GG型突變2年后復(fù)發(fā)率較高。但對攜帶rs2032582位點的乳腺癌患者如何進行干預(yù)及改善預(yù)后，尚待進一步研究。