余金鳳 陳正啟 周 汐 吳素蕊 郭 相

云南變綠紅菇的遺傳多樣性與群體遺傳分化研究

余金鳳 陳正啟 周 汐 吳素蕊 郭 相*

（中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221）

以昆明、曲靖、楚雄、玉溪、昭通、臨滄、大理等7個變綠紅菇地理居群的30個子實體樣本為試驗材料，基于ITS序列和LSU序列，對其分子變異、遺傳多樣性、群體遺傳分化進行分析。結果：30個樣品中，基于ITS序列檢測到18個單倍型，基于LSU序列檢測到10個單倍型；基于ITS序列和LSU序列分別構建的單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹及30個樣品的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，各地理居群的遺傳距離與地理距離之間沒有形成對應關系，二者無明顯相關性?；趦蓚€序列的分析結果均顯示，各地理居群內單倍型多樣性較豐富，而核苷酸多樣性低。表明變綠紅菇在不同的地理居群中的適應能力強，遺傳多樣性較低，絕大部分遺傳分化來自于個體間的差異。

變綠紅菇；ITS；LSU；遺傳多樣性；群體遺傳分化

變綠紅菇（）又名青頭菌、綠菇，隸屬擔子菌亞門、層菌綱、紅菇目、紅菇科、紅菇屬，是云南常見野生菌之一，在全省各地州均有分布[1-5]。其富含蛋白質、氨基酸、多糖等營養(yǎng)成分，味道鮮美，深受消費者喜愛[3, 6-9]。近年來對變綠紅菇的研究多集中于化學成分、抗腫瘤抗氧化活性分析，菌種分離及分子鑒定等，對其遺傳多樣性和遺傳分化方面的研究較少。

遺傳多樣性通常指生物攜帶的遺傳信息總和。一個物種的多樣性是長期進化的結果，物種遺傳多樣性越高，遺傳變異越豐富，其對環(huán)境的適應力越強；反之，對環(huán)境的適應力越弱。精確評估物種的遺傳多樣性是物種保護的基礎，是確定優(yōu)先保護種、篩選優(yōu)良種質的關鍵[10-13]。

本研究利用核糖體DNA 中的非編碼轉錄間隔區(qū)ITS（Internal Transcribed Spacer）序列[14-17]及28s核糖體大亞基LSU序列[18-21]作為DNA分子標記，分析云南省7個地區(qū)變綠紅菇的遺傳多樣性及群體遺傳分化，探討地理分布對變綠紅菇遺傳特性的影響，為云南省變綠紅菇野生資源的保育和開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）供試菇體。30個變綠紅菇樣本分別采自云南昆明、曲靖、楚雄、玉溪、昭通、臨滄、大理（表1）。新鮮子實體采集后去除泥沙雜物，裝入干凈的自封袋中，并加入變色硅膠干燥。

表1 變綠紅菇樣本信息

（2）試劑。DNA PCR擴增所有試劑均購自TaKaRa 生物有限公司，分析用的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

（3）主要儀器設備。全自動基因擴增儀、高速冷凍離心機、Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀和核酸蛋白測定儀。

1.2 試驗方法

（1）樣品預處理。將干燥后的變綠紅菇子實體表面雜物去除，取出部分子實體封裝于1.5 mL離心管中存儲備用。

（2）基因組DNA的提取。以干燥子實體為材料，采用基因組DNA快速提取試劑盒提取總基因組DNA。

（3）保守序列的擴增及檢測。變綠紅菇ITS、LSU 基因序列的PCR 擴增采用的特異性引物序列見表2。

表2 用于PCR擴增的引物

PCR反應采用50 μL反應體系：TaKaRa Taq 0.5 μL，dNTP Mixture 4 μL，10×PCR Buffer 5 μL，10 μmol/L的上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 37.5 μL。設置以無菌水代替模板的陰性對照。

PCR反應擴增程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30次循環(huán)；再72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。PCR結束后取5 μL 擴增產物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳，觀察Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)結果。

（4）ITS和LSU片段的回收。檢測到PCR產物后，將剩下的產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，從瓊脂糖凝膠中切割下含有目的片段的凝膠，使用TIANGEN膠回收試劑盒進行DNA的回收純化。

（5）篩選陽性克隆。①將含有目的片段的膠回收產物與質粒載體pMD19-T參照使用說明進行連接，連接體系為：膠回收產物（根據濃度而定）4.0 μL，pMD19-T 1.0 μL，2×Ligation I 5.0 μL，共10 μL，16 ℃連接30 min。②重組質粒的轉化：將連接產物轉化至感受態(tài)細胞DH5α中，涂布于含Amp的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜。③克隆子的初步篩選：挑取單菌落于含Amp的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床過夜培養(yǎng)。④PCR驗證：取培養(yǎng)的菌液為模板，進行PCR擴增驗證，擴增體系與程序設置同1.2（3）所述。

（6）測序。將PCR驗證為陽性克隆的菌液送昆明碩擎生物科技有限公司測序。

1.3 序列處理

將已測得的目的片段序列和從GenBank中通過BLAST檢索獲得的參考序列進行多重對位排列，并手動去除排列結果兩端的非對位排列區(qū)。

1.4 序列變異情況

用MEGA（Version5.1）軟件計算變異位點、簡約信息位點、單一變異位點、轉換/顛換位點數比。

1.5 遺傳多樣性及遺傳變異分析

用Arlequin3.5軟件統(tǒng)計各地理居群樣品的單倍型多樣性、核苷酸多樣性、核苷酸平均差異數、計算不同地理居群間的群體遺傳差異指數，分析各地理居群的遺傳變異情況。DnaSP5軟件計算群體的核苷酸平均差異數及核苷酸歧義度，評估各地理居群的遺傳多樣性。

2 結果與分析

2.1 ITS序列及LSU序列的變異情況

本研究獲得變綠紅菇樣本的ITS序列和LSU序列各30個，經處理去掉兩端側翼序列后ITS序列長度為697 bp，多態(tài)位點24個，其中簡約信息位點5個，單一變異位點19個。4種堿基組成分別為：A=23.59%，T=27.71%，G=25.38%，C=23.33%，A+T含量（0.513）略高于G+C（0.487），轉換/顛換R值為3.01。LSU序列長度為761 bp，多態(tài)位點10個，其中簡約信息位點4個，單一變異位點6個。4種堿基組成分別為：A=22.65%，T=24.11%，G=31.17%，C=22.06%，A+T含量（0.468）低于G+C（0.532），轉換/顛換R值為2。兩個片段的測序統(tǒng)計結果均說明絕大部分核苷酸的替換方式為轉換，都驗證了親緣關系近的分類階元之間的替換主要以轉換為主[22]。

2.2 基于ITS序列的群體遺傳多樣性及遺傳變異分析

根據ITS分子標記數據，對變綠紅菇不同地理居群的遺傳多樣性的分析結果（表3）：7個地理居群的30個變綠紅菇個體樣品，共檢測到單倍型18個。樣品共享單倍型情況如表4所示。在物種水平上單倍型多樣性（Hd）為0.949±0.021，核苷酸多樣性（Pi）為0.003 69±0.000 045。可見單倍型多樣性高而核苷酸多樣性低，表明變綠紅菇在不同的環(huán)境下有相應的適應對策，生存能力較強。

用NJ法構建單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。聯系圖1和表4結果可以看出，各單倍型并未按地理分布在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚集到一起，支持率較低。說明單倍型之間的差異較小，不能形成可靠分支。且各地理居群是由多個單倍型組成，分屬于不同地理居群的個體可共享一個單倍型。說明各地理居群間存在基因交流，遺傳分化較小。說明不同地區(qū)的樣品之間差異較小，相似度較高。

對不同地理居群間的Fst值統(tǒng)計結果（表5）顯示，Fst值的變化范圍為0.023 06～0.186 05。其中，昆明和大理群體分化較小，Fst值為0.023 06；大理和臨滄群體分化較大，Fst值為0.186 05。此外，昭通與其他6個地理居群間的Fst值均≤0，說明其與各群體間基因交流頻繁，無分化；楚雄除與大理群體之間存在很小程度的分化外，與其他各地理居群間均無分化；玉溪與曲靖群體間也無分化。由表6可知，不同地理居群間核苷酸差異數Kxy變化范圍為1.781 82～4.250 00，核苷酸歧義度Dxy范圍為0.002 58～0.006 16，大理和曲靖與其他群體差異較大。說明這兩個群體相對于其他群體變異較大，遺傳距離較遠。

2.3 基于LSU序列的群體遺傳多樣性及遺傳變異分析

表3 基于ITS序列變綠紅菇不同地理居群的遺傳多樣性

表4 基于ITS序列的變綠紅菇單倍型及共享單倍型樣本信息

圖1 基于ITS序列構建的變綠紅菇單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹

依據LSU分子數據，對變綠紅菇不同地理居群的遺傳多樣性的分析結果（表7）：7個地理居群的30個變綠紅菇個體樣品中，共檢測到10個單倍型。樣品共享單倍型情況如表8所示，在物種水平上單倍型多樣性（Hd）為0.710±0.087，核苷酸多樣性（Pi）為0.001 58±0.000 37。

用NJ法構建單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。聯系樹形和表8的統(tǒng)計結果可知，各單倍型并未按地理分布在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚集到一起，支持率較低。說明單倍型之間的差異較小，不能形成可靠分支。各地理居群是由多個單倍型組成，而分屬于不同地理居群的個體可共享一個單倍型。說明各地理居群間存在基因交流，遺傳分化較小。說明不同地區(qū)的樣品之間差異較小，相似度較高。該結果與ITS序列的分析結果吻合。

不同地理居群間的Fst值范圍為0.016 22～0.055 56（表9）；大理和昭通、曲靖和大理群體分化較大，Fst值為0.055 56。楚雄除與大理群體之間存在很小程度的分化外，與其他各地理居群間均交流頻繁，無分化；曲靖與昭通、臨滄兩個群體間的Fst值均為0，說明其間基因交流頻繁，無分化；臨滄與曲靖、昭通兩群體間，大理與玉溪、臨滄兩群體間也無分化。不同地理居群間核苷酸差異數Kxy變化范圍為0～2.300 00，核苷酸歧義度Dxy范圍為0～0.003 04（表10），大理和玉溪與其他群體差異較大，說明這兩個群體相對于其他群體變異較大，遺傳距離較遠。

表5 基于ITS序列的不同地理居群間的Fst值

注：Fst＜0.05，表示群體間幾乎沒有遺傳分化； 0.05≤Fst＜0.15，表示分化程度較低；0.15≤Fst＜0.25，為中度分化；Fst≥0.25，表明分化程度較高[23-26]，表9同。

表6 基于ITS序列的不同地理居群間核苷酸平均差異數（Kxy，上三角）和核苷酸歧義度（Dxy，下三角）

表7 基于LSU序列的變綠紅菇不同地理居群的遺傳多樣性指數

表8 基于LSU序列的變綠紅菇單倍型及共享單倍型樣本信息

圖2 基于LSU序列構建的變綠紅菇單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹

表9 基于LSU序列的不同地理居群間的Fst值

表10 基于LSU序列不同地理居群間的核苷酸平均差異數（Kxy，上三角）和核苷酸歧義度（Dxy，下三角）

3 討 論

本研究基于云南7個地區(qū)野生變綠紅菇的ITS序列及LSU序列信息，研究不同地理居群變綠紅菇的遺傳變異，統(tǒng)計其單倍型數并構建單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹，解析了云南部分地區(qū)變綠紅菇群體的單倍型多樣性及遺傳多樣性。

基于ITS序列的研究結果表明，單倍型Hap-1、Hap-4、Hap-6出現的頻率較高（13.3%），而單倍型Hap-2、Hap-3、Hap-5、Hap-7、Hap-8、Hap-10、Hap-12～18均為獨享單倍型，說明變綠紅菇單倍型多樣性較高。各地理居群的遺傳多樣性指數變化不大。曲靖群體單倍型多樣性和核苷酸多樣性明顯高于其他群體，群體遺傳多樣性較高；玉溪群體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性則明顯低于其他群體，遺傳多樣性低。從單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹看，各進化分支之間的分歧度很低，沒有形成明顯的聚類分支，單倍型分布與地理居群分布之間沒有明顯的對應結構關系。同一物種不同群體間的遺傳分化程度可以用遺傳分化指數Fst來判別，以衡量群體間的遺傳距離。本研究遺傳分化結果顯示，各群體間存在著較低程度的遺傳分化[27]。

基于LSU序列的研究結果，30個樣品中檢測到10個單倍型，低于ITS序列檢測結果的18個，這可能是由于LSU序列更加保守，產生突變和新單倍型的概率更低。10個單倍型Hap-2出現頻率最高（53.3%），其可能是變綠紅菇群體的祖先單倍型，是在種群中穩(wěn)定存在、適應環(huán)境能力強的優(yōu)勢單倍型。從遺傳多樣性指數可知，曲靖和昭通的單倍型多樣性為0，可能與用于實驗的樣本數太少有關。但與ITS序列的分析結果相比，其總體上的遺傳多樣性是低的。遺傳分化指數結果與ITS序列的分析結果一致，同樣表明群體間遺傳分化較低。

綜合兩個序列片段的數據分析結果，云南地區(qū)變綠紅菇群體整體上表現出較低的遺傳多樣性。各地理居群單倍型多樣性較高，核苷酸多樣性較低，說明變綠紅菇在不同地理居群中的適應能力強，但遺傳分化程度低，絕大多數分化來自于個體間的差異，可能原因是變綠紅菇傳播歷史較短，沒有積累過多的遺傳變異。

變綠紅菇作為云南省普遍食用的野生菌，具有顯著的經濟價值，深入了解變綠紅菇的遺傳多樣性，了解其遺傳分化現狀，對于后期有針對性地開展資源保護培育及綜合開發(fā)利用具有重要意義。本研究使用ITS標記和LSU標記評估云南變綠紅菇的遺傳多樣性和遺傳分化情況，獲得了多態(tài)位點和關鍵的遺傳學數據信息。在未來的研究中，需不斷增加不同地理居群樣本數量，使樣品數能完全囊括云南各地區(qū)，再配合多種類型的分子標記，精確評估物種遺傳多樣性，為后續(xù)研發(fā)提供詳實的數據支撐。

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Genetic variation and population genetic differentiation ofin Yunnan

Yu Jinfeng Chen Zhengqi Zhou Xi Wu Surui Guo Xiang*

（Kunming Edible Fungi Institute, All China Federation of Supply and Marketing Cooperatives, Kunming,Yunnan 650221, China）

In order to find out the genetic diversity and differentiation ofpopulation distributed in different areas of Yunnan.The fruiting bodies offrom 7 geographical populations, namely Kunming (KM), Qujing (QJ), Chuxiong (CX), Yuxi (YX), Zhaotong (ZT), Lincang (LC) And Dali (DL), were used as test materials. Molecular variation, genetic diversity and population genetic differentiation of 30 samples were analyzed based on ITS and LSU sequences. The results showed that 18 haplotypes were detected based on ITS sequence and 10 haplotypes were detected based on LSU sequence. The haplotype phylogenetic tree constructed based on ITS sequence and LSU sequence showed that there was no corresponding relationship between genetic distance and geographical distance in each geographical population, and there was no significant correlation between them. The results of the two sequences analysis showed that the haplotype diversity was rich in each geographic population, while the nucleotide diversity was low, indicating that the genetic diversity ofwas low; Fst values among different geographical populations were basically less than 0.15, indicating that the degree of genetic differentiation was low, and most of the differentiation came from differences among individuals.

; ITS; LSU; genetic variation; population genetic differentiation

S646

A

2095-0934（2020）03-178-07

云南省技術創(chuàng)新人才項目（2017HB094）

余金鳳（1988—），女，碩士，助理研究員，主要從事食用菌分子生物學研究。E-mail：584905471@qq.com。

郭相（1980—），男，碩士，副研究員，主要從事珍稀野生食用菌持續(xù)利用技術研究。E-mail：guoxkm@yeah.net。