黃嬌，周圓圓，鄧愷飛，羅儀文，孫其然，李周儒，黃平，張吉，蔡紅星

（1.徐州醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)教研室，江蘇 徐州 221004；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030；3.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 司法部司法鑒定重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海 200063）

死亡時(shí)間（postmortem interval，PMI）通常是指死亡發(fā)生到尸體被發(fā)現(xiàn)的時(shí)間間隔[1]。在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，推斷死亡時(shí)間不僅為刑事案件的前期偵查工作提供了線索，還可以縮小偵察范圍，對(duì)排除嫌疑人和確定兇犯具有重要的意義[2]。

傳統(tǒng)死亡時(shí)間推斷方法主要是通過(guò)觀察尸體現(xiàn)象（如尸冷、尸斑、尸僵、胃內(nèi)容物和超生反應(yīng)等）進(jìn)行粗略判斷[3]。為了能夠?qū)崿F(xiàn)更為精確的推斷，目前已有大量的技術(shù)方法被應(yīng)用于人體或動(dòng)物死亡時(shí)間推斷的研究中。例如，ZHANG等[4-6]采用傅里葉變換衰減全反射紅外（attenuated total reflectance-Fourier transform infrared，ATR-FTIR）光譜技術(shù)對(duì)兔子死后玻璃體液、心包液及血清內(nèi)化學(xué)成分進(jìn)行分析，并利用機(jī)器學(xué)習(xí)的方法成功建立了推斷死亡時(shí)間的數(shù)學(xué)模型。PITTNER等[7]通過(guò)蛋白質(zhì)印跡和酪蛋白酶譜法對(duì)40個(gè)人體肌肉樣本進(jìn)行了生物化學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)人體肌肉組織中蛋白質(zhì)降解過(guò)程與死亡時(shí)間明顯相關(guān)。蔡山青等[8]利用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）檢測(cè)技術(shù)分析窒息死亡大鼠0～120 h脾代謝產(chǎn)物的變化，發(fā)現(xiàn)其死后各代謝物成分具有一定的時(shí)序性改變。這些研究為推斷死亡時(shí)間提供了有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究擬采用FTIR光譜技術(shù)分析大鼠死后背部皮膚內(nèi)化學(xué)物質(zhì)的改變，通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)，深度挖掘皮膚組織光譜信息，來(lái)識(shí)別不同死亡時(shí)間點(diǎn)之間的光譜變化，并建立具有不同預(yù)處理的偏最小二乘（partial least squares，PLS）回歸模型，以期實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確推斷死亡時(shí)間的目的。

1 材料與方法

1.1 樣本制備

由上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供成年雄性大鼠20只，體質(zhì)量（220±20）g，室溫飼養(yǎng)2d后，用2%戊巴比妥鈉溶液（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，剃毛器除去大鼠背部的毛發(fā)后頸椎脫臼法處死，置于溫度為25℃、濕度為50%的恒溫培育箱（HSX-250，上海南榮實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司）中。于處死后0、1、2、3、4、5、6、7、9、11、13、15 d取大小約3 mm×3 mm、厚度約1mm的背部皮膚，立即放入液氮中冷凍保存，每只大鼠皮膚樣本重復(fù)收集。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)司法鑒定科學(xué)研究院科學(xué)與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 FTIR光譜檢測(cè)

從液氮中取出皮膚，用電吹風(fēng)冷風(fēng)吹干，置于ATR探頭金剛石晶體表面，下壓ATR探頭上的杠桿，使大鼠皮膚與晶體表面緊密貼合。用Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）在4000～900cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描，分辨率4cm-1，掃描次數(shù)32次。在相同的實(shí)驗(yàn)室條件下由同一工作人員收集本實(shí)驗(yàn)所有組織樣本的光譜數(shù)據(jù)，以保證數(shù)據(jù)的一致性。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

采用MATLAB R2018a軟件的PLS Toolbox 8.1.1工具箱（美國(guó)Math Works公司）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。選取1800～900cm-1的紅外光譜區(qū)域，此段含有豐富的生物信息。首先對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行擴(kuò)張多元散射校正（extended multiplicative signal correction，EMSC）、3點(diǎn)平滑+二階導(dǎo)數(shù)、15點(diǎn)平滑+二階導(dǎo)數(shù)等預(yù)處理，提高光譜的質(zhì)量。隨后對(duì)預(yù)處理后的光譜數(shù)據(jù)建立PLS回歸模型，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的光譜數(shù)據(jù)按照8∶2的比例隨機(jī)分成訓(xùn)練集和測(cè)試集，采用二十折交叉驗(yàn)證。

PLS回歸模型通過(guò)決定系數(shù)（R2）、校正均方根誤差（root mean square error of calibration，RMSEC）、預(yù)測(cè)均方根誤差（root mean square error of prediction，RMSEP）和交叉驗(yàn)證均方根誤差（root mean square error of cross validation，RMSECV）評(píng)估模型的穩(wěn)定性及預(yù)測(cè)泛化能力。變量投影重要性（variable importance for projection，VIP）是評(píng)估每個(gè)變量對(duì)PLS模型擬合的貢獻(xiàn)程度，通常用于變量的進(jìn)一步選擇。VIP大于1.0的變量可認(rèn)為對(duì)因變量的貢獻(xiàn)較大。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理

圖1為20只大鼠背部皮膚組織在不同死亡時(shí)間下的平均光譜。隨著死亡時(shí)間的延長(zhǎng)，光譜的波峰峰位沒有發(fā)生明顯改變。然而，不同死亡時(shí)間平均光譜之間波峰的強(qiáng)度存在明顯差異。在1800～900cm-1區(qū)域內(nèi)皮膚光譜的主要特征峰見表1。區(qū)域內(nèi)的吸收峰主要來(lái)自組織中脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及碳水化合物內(nèi)化學(xué)鍵或官能團(tuán)的振動(dòng)。

2.2 PLS結(jié)果

建立PLS回歸模型推斷死亡時(shí)間。模型結(jié)果如表2所示，所有模型的決定系數(shù)（R2）均≥0.85，最高可達(dá)0.95。不同預(yù)處理方法的比較中，以15點(diǎn)平滑+二階導(dǎo)數(shù)交叉驗(yàn)證建模效果最好，預(yù)測(cè)集決定系數(shù)（R2）為0.92，RMSEP為1.30d（圖2）。

應(yīng)用PLS模型的VIP技術(shù)進(jìn)一步確定皮膚光譜數(shù)據(jù)推斷死亡時(shí)間的有效波段。如圖3所示，位于1760～1700cm-1、1660～1640cm-1、1580～1540cm-1和1 460～1 420 cm-1波段區(qū)域的VIP值對(duì)模型的影響力顯著高于其他波段。

圖1 大鼠死后15d皮膚組織的平均光譜圖Fig.1 The average spectrogram of skin tissues 15d after the rats’death

表1 FTIR光譜中主要特征峰指認(rèn)Tab.1 Identification of major characteristic peaks in FTIR spectroscopy

表2 不同預(yù)處理方法對(duì)PLS定量模型性能的影響Tab.2 The effects of different pretreatments on the PLS quantitative model performance

圖2 PLS回歸模型預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.2 The prediction results of PLS regression model

圖3 PLS回歸模型的VIP分?jǐn)?shù)圖Fig.3 The VIP results of PLS regression model

3 討 論

ATR-FTIR主要通過(guò)檢測(cè)化學(xué)物質(zhì)中化學(xué)鍵或官能團(tuán)的振動(dòng)來(lái)獲得組織樣本的結(jié)構(gòu)成分信息，具有快速、靈敏、制樣簡(jiǎn)單和非破壞性等檢測(cè)特點(diǎn)，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[9]，特別是在腫瘤（如腦腫瘤[10]、乳腺癌[11]、肝細(xì)胞癌[12]、結(jié)直腸癌[13]）的診斷、分級(jí)及預(yù)后評(píng)估等方面。皮膚位于身體表面，分為表皮和真皮兩部分。真皮的細(xì)胞外基質(zhì)由膠原蛋白、彈性蛋白和其他基質(zhì)成分組成；真皮細(xì)胞與膠原纖維之間存在一些不固定物質(zhì)，主要由糖胺聚糖和蛋白質(zhì)組成[14]。與血液、肌肉組織和骨骼等其他生物樣本相比，皮膚組織具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）皮膚的表皮位于最表層，是與外界環(huán)境接觸的屏障，可以抵御微生物的侵襲，且具有易獲取的特點(diǎn)。（2）真皮屬于致密結(jié)締組織，由粗大膠原纖維彼此交織成致密的板層結(jié)構(gòu)，限制了死后細(xì)菌的擴(kuò)散，使腐敗進(jìn)展緩慢。因此，皮膚組織有望成為晚期死亡時(shí)間推斷的重要檢材。

金波[15]對(duì)不同環(huán)境下的大鼠尸體腐敗情況進(jìn)行了組織形態(tài)學(xué)的觀察，發(fā)現(xiàn)隨著死亡時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠皮膚內(nèi)的膠原纖維遭到破壞，但到死亡晚期，仍有部分膠原纖維保持完整。KOVARIK等[16]采用組織病理學(xué)技術(shù)觀察死亡1周內(nèi)的皮膚組織，發(fā)現(xiàn)局部真皮分離，外分泌腺管自溶，真皮降解。由于這些形態(tài)改變往往伴隨生物化學(xué)變化，因此，上述研究為以皮膚為檢材推斷死亡時(shí)間提供了重要理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究利用FTIR光譜技術(shù)檢測(cè)大鼠死后皮膚組織內(nèi)化學(xué)變化與死亡時(shí)間之間的關(guān)系，并基于FTIR光譜技術(shù)建立了推斷死亡時(shí)間的數(shù)學(xué)模型。

3.1 不同死亡時(shí)間的光譜比較

FTIR光譜是根據(jù)化學(xué)物質(zhì)中化學(xué)鍵或官能團(tuán)的振動(dòng)識(shí)別化學(xué)成分。一般而言，物質(zhì)中不同構(gòu)型的基團(tuán)在FTIR光譜中都有其各自對(duì)應(yīng)的吸收峰，可根據(jù)這些特征性吸收峰峰位和強(qiáng)度是否發(fā)生變化來(lái)推斷物質(zhì)分子中主要化學(xué)基團(tuán)的構(gòu)型和含量是否發(fā)生了變化[17]。皮膚內(nèi)含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、黏多糖、核酸和電解質(zhì)等成分。然而，皮膚分子光譜帶主要來(lái)自皮膚中脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和碳水化合物，可能的原因是其他小分子物質(zhì)的吸收峰被其覆蓋。本研究結(jié)果顯示，光譜波峰峰位沒有發(fā)生明顯改變，說(shuō)明大鼠死后15 d內(nèi)，皮膚所含的主要化學(xué)基團(tuán)構(gòu)型未發(fā)生明顯的改變。相關(guān)研究[18]也表明，大鼠心肌的光譜波峰峰位不隨時(shí)間的改變而發(fā)生變化。

然而，波峰的強(qiáng)度隨著時(shí)間的改變存在差異。本研究結(jié)果表明，皮膚組織中物質(zhì)的成分含量與死亡時(shí)間存在一定的關(guān)系，可以作為死亡時(shí)間推斷的指標(biāo)。但通過(guò)肉眼觀察這些區(qū)域，無(wú)法準(zhǔn)確地推斷死亡時(shí)間。因此，我們采用機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)深度分析不同時(shí)間點(diǎn)的光譜數(shù)據(jù)，并建立PLS回歸模型。

3.2 PLS優(yōu)化模型

本研究結(jié)果顯示，3種預(yù)處理方法及原始模型的決定系數(shù)（R2）均≥0.85，說(shuō)明以皮膚組織為樣本，運(yùn)用FTIR光譜技術(shù)推斷死亡時(shí)間具有一定的可行性。EMSC是一種多變量散射校正技術(shù)，可以有效消除樣品間散射影響所導(dǎo)致的基線平移和偏移現(xiàn)象，同時(shí)增強(qiáng)與成分含量相關(guān)的光譜信息[19]；平滑處理是消除噪聲的常用方法，可以有效提高光譜信噪比，減小隨機(jī)噪聲的頻率，但同時(shí)較大的平滑點(diǎn)數(shù)也會(huì)導(dǎo)致信號(hào)的失真[19]；通過(guò)二階導(dǎo)數(shù)的處理可以分辨重疊吸收峰，提高光譜的分辨率和靈敏度。對(duì)于建立的模型，決定系數(shù)（R2）越大，模型擬合效果和準(zhǔn)確性越好，RMSEP越小，則模型預(yù)測(cè)能力越強(qiáng)[20]。由結(jié)果可知，經(jīng)過(guò)15點(diǎn)平滑+二階導(dǎo)數(shù)處理后的PLS模型最優(yōu)。

VIP技術(shù)是基于PLS回歸的一種變量篩選方法，當(dāng)多個(gè)自變量間具有較強(qiáng)相關(guān)性時(shí)，可通過(guò)相關(guān)自變量綜合而成的主成分去描述自變量對(duì)因變量的解釋能力，并根據(jù)解釋能力的大小篩選自變量[21]。由本研究結(jié)果可知，VIP大于1.0的光譜吸收峰主要源于脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，表明大鼠各死亡時(shí)間點(diǎn)的光譜差異主要是組織中蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等物質(zhì)組分的變化引起。該發(fā)現(xiàn)與早期研究結(jié)果[22-23]一致。CHOI等[22]對(duì)老鼠骨骼肌內(nèi)蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)eEF1A2和GAPDH蛋白表達(dá)水平隨著死亡時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)下降。靳俊峰等[23]通過(guò)蘇丹Ⅲ對(duì)胸骨骨髓脂肪細(xì)胞進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)在死后1～9 d染色逐漸變淺淡，脂質(zhì)含量隨死亡時(shí)間延長(zhǎng)而下降。

3.3 結(jié)論

本研究應(yīng)用機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)解析FTIR光譜信息，分析大鼠死后15d內(nèi)皮膚組織光譜特征的差異性，建立死亡時(shí)間推斷的PLS回歸模型，發(fā)現(xiàn)恒定溫度、濕度的條件下，不同死亡時(shí)間點(diǎn)的光譜變化具有一定的規(guī)律。但在法醫(yī)學(xué)實(shí)際案例中，尸體周圍環(huán)境復(fù)雜多變，死亡時(shí)間的推斷可能受到環(huán)境溫度、濕度、昆蟲活動(dòng)及土壤特性等因素影響。因此，在未來(lái)的工作中，我們將著重考慮這些因素的影響，獲取更為全面的光譜數(shù)據(jù)，最終建立可用于實(shí)際需求的死亡時(shí)間推斷模型。