楊曉娜，張 瑩，韓 笑

支氣管哮喘俗稱(chēng)“哮喘”，是指氣道的慢性炎性反應(yīng)，由嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞參與引起，具有氣道高反應(yīng)性的特征，以發(fā)作性喘息伴呼吸困難、過(guò)敏性咳嗽為主要臨床特征[1]。其發(fā)病機(jī)制相對(duì)復(fù)雜，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其關(guān)鍵致病機(jī)制在于眾多致病因素所誘導(dǎo)的細(xì)胞因子失衡[2]。非編碼小分子RNA(miRNA)是長(zhǎng)度為20～25 nt的非編碼單鏈RNA，于動(dòng)植物真核細(xì)胞內(nèi)廣泛存在，可特異性使靶標(biāo)基因mRNA降解或?qū)ζ浞g進(jìn)行抑制。miRNA對(duì)各種病理生理生物學(xué)改變具有廣泛調(diào)控作用，其miRNA表達(dá)水平、表達(dá)譜的改變可一定程度上反映諸多疾病發(fā)病情況[3]。羥脯氨酸(hydroxyproline, HP)屬于膠原蛋白特有氨基酸，為膠原纖維增生組織重建的關(guān)鍵指標(biāo)[4]。髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)作為特異性髓細(xì)胞標(biāo)志物，屬于血紅素過(guò)氧化物酶，主要存在于單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等髓系細(xì)胞嗜苯胺藍(lán)顆粒內(nèi)[5]。因此，為進(jìn)一步探索支氣管哮喘更為有效的診斷評(píng)估手段與預(yù)后指標(biāo)，本研究探討支氣管哮喘患者血清miR-155、HP及MPO水平與肺功能的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017-11至2019-09我院呼吸內(nèi)科收治的支氣管哮喘患者62例，其中39例處于發(fā)作期(作為發(fā)作組)，23例處于緩解期(作為緩解組)，另選擇同期健康體檢者12例(作為健康組)。發(fā)作組男25例，女14例；年齡27～80歲，平均(53.67±10.38)歲；病程(6.79±3.12)年；緩解組男14例，女9例；年齡25～79歲，平均(52.59±10.41)歲；病程(6.82±3.09)年；健康組男7例，女5例；年齡24～78歲，平均(51.55±10.45)歲。各組間基本資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，受試人員均簽知情同意書(shū)。支氣管哮喘患者入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)支氣管哮喘與其分期符合指南診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；(2)近3個(gè)月內(nèi)未使用相關(guān)藥物治療；(3)可積極配合至試驗(yàn)結(jié)束。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并結(jié)締組織病、慢性肝病、慢性阻塞性肺疾病、心血管疾病、肺癌等疾??；(2)妊娠狀態(tài)或哺乳期婦女；(3)有精神類(lèi)疾患、溝通交流障礙者。

1.2 方法

1.2.1 miR-155、HP及MPO表達(dá)水平檢測(cè) 采集所有受試人員空腹外周靜脈血(發(fā)作組在糖皮質(zhì)激素使用前)，經(jīng)高速離心分離血清后，保存于冰箱內(nèi)(-80 ℃)，然后進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。HP采用美國(guó)惠普公司提供的高效液相色譜儀(型號(hào)21100)進(jìn)行測(cè)定，由南京建成生物工程研究所提供相關(guān)試劑盒。MPO采用酶聯(lián)免疫分析法進(jìn)行檢測(cè)，由美國(guó)RD公司提供檢測(cè)試劑。miRNA155:由德國(guó)Qiagen公司提供反轉(zhuǎn)錄試劑盒(MiScript Reverse Transcription Kit)，美國(guó)Ambion公司提供米爾納隔離套件(MirVanaTM miRNA Isolation Kit)，丹麥Exiqon公司提供1.0版本的miRNA芯片，miR-155引物序列由北京天根生化科技有限公司提供，美國(guó)Applied Biosystems公司提供ABIprism儀(7900HTPCR)。利用試劑盒將總RNA以及miRNA進(jìn)行提取，采用瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)RNA的完整性和純度進(jìn)行檢測(cè)。采用miRCURY R Array Power試劑盒對(duì)熒光基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記，制備探針。在熱收縮雜交袋(PhalanxTM)內(nèi)進(jìn)行miRCURY R芯片和探針雜交，采用軟件MeV 4.0對(duì)納入實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，驗(yàn)證miR-155基因芯片結(jié)果。采用Trizol法對(duì)樣品的總RNA進(jìn)行抽提，然后反轉(zhuǎn)錄miRNA。反應(yīng)條件包括：30 min，16 ℃；40 min，42 ℃；5 min，85 ℃。按下列程序進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增：10 min，95 ℃；PCR 循環(huán)40個(gè)(15 s，95 ℃；30 s，60 ℃；30 s，72 ℃)，結(jié)束擴(kuò)增反應(yīng)后，繼續(xù)進(jìn)行緩慢加熱，速度為1 ℃/5 s。直至99 ℃，將PCR產(chǎn)物建立熔解曲線(xiàn)，內(nèi)參為U6 snRNA，采用2-ΔΔCT法分析數(shù)據(jù)，各反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)循環(huán)數(shù)為CT值。

1.2.2 肺功能測(cè)定 肺功能由高級(jí)組合式MasterScreen肺功能儀(耶格公司，德國(guó))測(cè)定，包括FVC(forced vital capacity，用力肺活量)、FEV1(forced expiratory volume in one second)、MMEF75/25(maximal mid-expiratory flow，最大呼氣中期流量)、PEF(peak expiratory flow，最大呼氣峰值流速)及FEV1/FVC。測(cè)試在患者呼吸波顯示至少連續(xù)10個(gè)穩(wěn)定波形后進(jìn)行。

1.3 觀察指標(biāo) 比較各組miR-155、HP及MPO表達(dá)水平與肺功能指標(biāo)，分析肺功能與miR-155、HP及MPO的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 各組HP、MPO、miR-155表達(dá)水平比較 發(fā)作組HP、MPO、miR-155表達(dá)水平最高，健康組最低，三組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，表1)。

組別例數(shù)HP(mg/L)MPO(U/L)miR-155發(fā)作組391.97±0.98①②757.28±111.63①②2.89±0.93①②緩解組231.49±0.73①579.06±101.74①2.02±0.83①健康組121.01±0.45403.65±89.151.58±0.77F6.67258.09513.505P0.0020.0000.000

注：與健康組對(duì)比，①P<0.05；與緩解組對(duì)比，②P<0.05

2.2 各組肺功能指標(biāo)比較 發(fā)作組FVC、FEV1、FEV1/FVC、MMEF75/25、PEF各肺功能指標(biāo)最低，健康組最高，三組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，表2)。

2.3 肺功能與HP、MPO、miR-155的相關(guān)性 根據(jù)Pearson相關(guān)分析，F(xiàn)VC、FEV1、FEV1/FVC、MMEF75/25、PEF與HP、MPO、miR-155均呈負(fù)相關(guān)性(P<0.05，表3)。

組別例數(shù)FVC(L)FEV1(L)FEV1/FVC(%)MMEF75/25(L/s)PEF(L/min)發(fā)作組392.63±0.92①②1.45±0.31①②59.26±14.25①②0.41±0.09①②138.95±15.06①②緩解組233.12±0.76①1.87±0.30①73.73±10.04①0.73±0.08①402.69±10.85①健康組123.33±0.652.01±0.4282.01±12.161.37±0.07589.33±11.26F4.42619.66518.630607.3826354.427P0.0150.0000.0000.0000.000

注：與健康組對(duì)比，①P<0.05；與緩解組對(duì)比，②P<0.05

表3 支氣管哮喘組與健康組肺功能與HP、MPO、miR-155的相關(guān)性

3 討 論

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)水平的快速發(fā)展，環(huán)境污染問(wèn)題日益凸顯，哮喘的發(fā)病率也因此逐年上升，且越來(lái)越低齡化。哮喘具有較為復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制，目前尚無(wú)統(tǒng)一定論，主要包括氣道高反應(yīng)性、變態(tài)反應(yīng)、氣道神經(jīng)調(diào)節(jié)失常、氣道慢性炎性反應(yīng)、神經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、氣道重構(gòu)和遺傳機(jī)制等。目前，診斷哮喘主要是依據(jù)患者的臨床表現(xiàn)及肺功能的檢查，前瞻性和預(yù)見(jiàn)性較差。臨床主要通過(guò)激素、β2-受體激動(dòng)藥等進(jìn)行抗炎治療，進(jìn)而使支氣管痙攣解除、癥狀緩解，但長(zhǎng)期使用藥物可導(dǎo)致不同程度的不良反應(yīng)。因此，為進(jìn)一步研究有效且不良反應(yīng)少的治療手段，哮喘發(fā)病機(jī)制的研究已成為當(dāng)前的熱點(diǎn)[7，8]。

研究顯示，miRNA廣泛參與了真核細(xì)胞的生物學(xué)調(diào)節(jié)途徑，目前研究主要集中在腫瘤生理、病理、發(fā)病機(jī)制等方面，近年來(lái)，miRNA對(duì)哮喘發(fā)病的影響廣受重視。研究人員通過(guò)miRNA芯片將哮喘輕度患者和正常健康者的肺組織miRNA表達(dá)譜對(duì)比發(fā)現(xiàn)，哮喘患者的肺組織內(nèi)miRNAs呈高表達(dá)。據(jù)此推斷，miRNAs為調(diào)控肺組織基因表達(dá)和氣道的miRNA。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在T細(xì)胞分化為T(mén)hl、Th2細(xì)胞過(guò)程中，miRNA-155有著關(guān)鍵作用，而miR-155又可通過(guò)使IL-13(白介素-13)受體表達(dá)下調(diào)進(jìn)而發(fā)揮IL-13通路調(diào)控的目的。據(jù)此推斷，miR-155可能通過(guò)其有效的抗炎效果進(jìn)而發(fā)揮對(duì)哮喘發(fā)病的調(diào)控作用。通常情況下，人體血清內(nèi)miRNA表達(dá)水平較為平穩(wěn)，然而當(dāng)機(jī)體處于疾病狀態(tài)時(shí)，miRNA表達(dá)水平則可出現(xiàn)異常。故通過(guò)miR-155表達(dá)水平的變化作為臨床檢測(cè)疾病的參考指標(biāo)，對(duì)疾病治療亦有一定的指導(dǎo)意義[9，10]。本次試驗(yàn)根據(jù)LNATM技術(shù)捕獲探針檢測(cè)分析了支氣管哮喘受試人員血清內(nèi)miRNAs表達(dá)譜變化情況。結(jié)果顯示：健康組最低，而發(fā)作組最高，且3組間具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。血清miR-155可作診斷哮喘的血清學(xué)指標(biāo)，亦可參與調(diào)控哮喘發(fā)病，未來(lái)甚至可能成為治療哮喘的新靶點(diǎn)[11]。

目前，臨床科研人員利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)動(dòng)物模型與人類(lèi)哮喘蛋白展開(kāi)了大量的組學(xué)研究，鑒定出大量哮喘相關(guān)蛋白質(zhì)，然而目前關(guān)于哮喘血漿蛋白相關(guān)組學(xué)研究卻鮮有報(bào)道。對(duì)比細(xì)胞和組織樣品，血液樣品獲得方式更加容易且便宜，因此臨床的轉(zhuǎn)化潛力巨大，廣受關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)中探討的血漿蛋白質(zhì)MPO，為前期在哮喘患者內(nèi)已經(jīng)利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定出表達(dá)呈現(xiàn)差異且轉(zhuǎn)化效能顯著的蛋白質(zhì)，屬于促炎蛋白，可反映中性粒細(xì)胞的活動(dòng)情況，為炎性反應(yīng)的重要標(biāo)志。HP屬于特有膠原蛋白氨基酸，是提示膠原纖維增生、組織重建的關(guān)鍵標(biāo)志，可一定程度上間接反映患者肺泡壁受損嚴(yán)重程度及氣道重塑情況，可作為病情的嚴(yán)重程度及預(yù)后的評(píng)估參考指標(biāo)[12-14]。本研究中結(jié)果表明，健康組血清HP、MPO表達(dá)水平明顯低于發(fā)作組、緩解期組，說(shuō)明在哮喘發(fā)病狀態(tài)下，患者存在過(guò)度的膠原纖維分解及代謝，考慮其原因可能在于哮喘導(dǎo)致患者肺泡壁受損，缺氧狀態(tài)下，患者堆積的血管壁下膠原纖維發(fā)生斷裂和毀損，炎性反應(yīng)活躍[15]。

目前，肺功能是輔助判斷哮喘患者發(fā)病嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)。FVC是判斷患者有無(wú)呼吸道阻力的關(guān)鍵指標(biāo)。而FEV1/FVC則臨床應(yīng)用廣泛。支氣管哮喘作為可逆性的氣道阻塞疾病，在患者應(yīng)用相關(guān)藥物后，指標(biāo)可有一定程度的改善。健康人FEV1/FVC>80%，其數(shù)值的下降通常提示病情加重[16，17]。MMEF75/25是最大呼氣中段流量，是經(jīng)FVC曲線(xiàn)算得用力肺活量在25%～75%間的平均值，而PEF為測(cè)定用力肺活量過(guò)程中，最快呼氣流量的瞬時(shí)流速。以上指標(biāo)均可反映患者氣道是否存在梗阻及呼吸肌的情況[18，19]。本研究健康組肺功能各項(xiàng)指標(biāo)均相對(duì)較高，而發(fā)作組各項(xiàng)指標(biāo)最低。

肺功能各指標(biāo)與miR-155、HP及MPO之間的關(guān)系均呈負(fù)相關(guān)性，患者肺功能指標(biāo)越差，miR-155、HP及MPO表達(dá)水平越高。由此可以推斷，對(duì)于無(wú)法配合呼吸功能檢查的支氣管哮喘患者，可通過(guò)其血清miR-155、HP及MPO表達(dá)水平輔助診斷并判斷病情嚴(yán)重程度和預(yù)后水平。Gao等[20]通過(guò)蝦蛋白誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型研究發(fā)現(xiàn)，隨著小鼠哮喘癥狀的加重，肺功能的減弱，其氣道炎性反應(yīng)明顯更為活躍，相關(guān)因子指標(biāo)與蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯增加，與本次研究結(jié)果一致。

綜上所述，支氣管哮喘患者血清miR-155、HP及MPO水平與肺功能具有明顯的負(fù)相關(guān)性，患者肺功能越差，其血清miR-155、HP及MPO表達(dá)水平越高，通過(guò)檢測(cè)患者血清miR-155、HP及MPO水平可輔助判斷患者肺功能情況，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值，值得應(yīng)用推廣。