刁 樂，張鳳英，宋 煒，馬春艷，王 偉，諶 微，馬凌波，趙 明，喬振國，蔣科技

(1. 中國水產科學研究院東海水產研究所，農業(yè)農村部遠洋與極地漁業(yè)創(chuàng)新重點實驗室，上海 200090； 2. 上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306)

鹽度對水生甲殼動物的生長發(fā)育和新陳代謝等具有極其重要的影響[1-2]，水生甲殼動物Na+/H+-exchanger向膜內和膜外分別轉運Na+和H+[3-5]，維持胞內Na+穩(wěn)態(tài)，對廣鹽性蟹類在低鹽環(huán)境下的Na+攝入具有重要影響[6-11]。擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)隸屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda) ，甲殼綱(Crustacea) ，十足目(Decapoda)，短尾亞目(Brachyura) ，梭子蟹科(Portunidae)，青蟹屬，廣泛分布于我國東南沿海地區(qū)[12-13]，是我國重要的海水捕撈和養(yǎng)殖品種。擬穴青蟹幼體在27～35鹽度條件下都能正常發(fā)育成仔蟹，但在鹽度27時的成活率和生長情況最好[14-16]。隨著個體的生長發(fā)育，擬穴青蟹具有逐步趨向低鹽環(huán)境生活的習性[17-18]。擬穴青蟹幼體相比仔蟹更易遭受鹽度改變帶來的影響[17]，幼體培育階段的鹽度環(huán)境往往直接影響育苗的成活率，其中大眼幼體變態(tài)期是幼體培育過程中死亡率最高的階段[17-18]。當前海水經濟蟹類中，擬穴青蟹苗種規(guī)模化繁育技術還未完全成熟，其中一個關鍵因素就是目前擬穴青蟹幼體階段鹽度脅迫的研究很少，缺乏相應的調控思路與方法。

水生甲殼動物中，三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)[5]、普通濱蟹(Carcinusmaenas)[19]、中國明對蝦(Penaeuschinensis)，麥龍螯蝦(Cheraxtenuimanu)[20]、天空藍魔(Cheraxdestructor)[20]和紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)[21]等已見Na+/H+-exchanger基因的相關報道。馬金武等[5]研究發(fā)現(xiàn)，Na+/H+-exchanger基因主要在三疣梭子蟹的鰓組織中特異性表達，在低鹽中起作用，在高鹽中的作用不明顯。XU等[22]報道了擬穴青蟹Na+/H+-exchanger的部分序列，但未報道Na+/H+-exchanger的表達情況。本研究克隆獲得擬穴青蟹Na+/H+-exchanger的cDNA全長，并對該基因及其編碼的氨基酸序列進行生物信息學分析，分析該基因在不同組織和不同幼體時期的表達變化，同時研究擬穴青蟹大眼幼體時期鹽度脅迫下Na+/H+-exchanger的表達情況。以期為廣鹽性甲殼動物Na+/H+-exchanger基因滲透調節(jié)機理的研究、擬穴青蟹耐低鹽新品系的選育等提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

擬穴青蟹幼體取自海南瓊海東海水產研究所養(yǎng)殖基地，不同幼體分期為受精卵(F.egg)、溞狀幼體I～V(Z1～Z5)、大眼幼體(M)、一期仔蟹(C1)和二期仔蟹(C2)，加無液氮型樣品RNA保存液(生工生物工程有限公司)凍至-80℃保存?zhèn)溆?。成體購買于中國海南省文昌市環(huán)球碼頭，實驗前在實驗室水循環(huán)系統(tǒng)提前養(yǎng)殖一周。

1.2 擬穴青蟹Na+/H+-exchanger基因cDNA全長克隆

前期通過轉錄組測序獲得了擬穴青蟹Na+/H+-exchanger的核心序列，提取成體雌蟹的神經節(jié)組織構建5′-RACE和3′-RACE cDNA文庫，在預測的ORF區(qū)設計RACE特異性引物，進行5′-RACE和3′-RACE PCR擴增反應得到該基因全長cDNA序列。RACE使用Clontech公司(TAKARA，中國大連)的SmartTM Race cDNA Amplification kit試劑盒，按照使用說明書進行操作。5′-RACE 的特異性引物為Sp-NHE-F(AGACCACCAGATACCACCGA)，3′-RACE的特異性引物為Sp-NHE-R(ACCTCCAATCCCCAAAC

CTTAC)，另一方向引物為試劑盒自帶通用引物。

RACE產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將目的條帶進行割膠回收，克隆到pMD19-T載體上轉化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，挑取陽性克隆送至上海杰李生物公司進行測序。測序結果利用DNAMAN軟件進行拼接獲得Na+/H+-exchanger的cDNA全長。除試劑盒提供的引物外，其他引物委托上海杰李生物技術有限公司合成。

1.3 生物信息學分析

使用ORF Finder(http ：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)查找序列的開放閱讀框并翻譯，在Nr 數(shù)據(jù)庫進行blast比對分析從而對基因進行初步注釋。利用ExPASy(http://au.expasy.org/drug_design)分析蛋白質的分子量和等電點。

在UniPortKB數(shù)據(jù)庫中下載多個物種的Na+/H+-exchanger序列，所使用的序列包括：三疣梭子蟹A0A286QYA6、普通濱蟹Q23706、中國明對蝦A0A286QYA6、麥龍螯蝦A0A0C5DFF2、天空藍魔A0A0C5DNU5、紅螯螯蝦A0A0C5DNU5、黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)Q8MQP4、埃及伊蚊 (Aedesaegypti)Q7Z0L7、中華按蚊(Anophelessinensis)A0A084VYE0、岡比亞按蚊(Anophelesgambiae)Q5TNB1、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)I3J5H3、斑馬魚(Daniorerio)F1R610、雀鱔(Lepisosteusoculatus)W5MNT3、智人(Homosapiens)Q14940、小白鼠(Musmusculus) B2RXE2。

使用 DNAMAN 軟件對部分物種的Na+/H+-exchanger氨基酸序列進行多重比對分析，使用MEGA7的clustalW對16條Na+/H+-exchanger序列進行比對，鄰接法構建發(fā)育樹，Bootstrap設置為1 000。采用ORF Finder進行基因開放閱讀框(ORF)預測，采用Blast程序分析目的基因與其他物種的相似度，使用DNAMAN軟件進行基因編碼氨基酸序列的多重序列比對。使用ProtParam tool、SMART、TMHMM Server v. 2.0和ProtScale等在線生物信息分析工具對基因編碼蛋白的基本物理性質、結構域、信號肽、跨膜結構和親、疏水性進行預測分析。

1.4 Na+/H+-exchanger基因的組織表達分析和時空分布分析

提取成體蟹的腦神經節(jié)、鰓、心臟、中腸、卵巢(卵巢發(fā)育I期)、納精囊、精巢、胸神經節(jié)組織，以及從受精卵到仔蟹Ⅱ期不同幼體發(fā)育時期樣本的總RNA，使用DNAase I處理后反轉錄用于Na+/H+-exchanger的表達分析。RNA提取使用北京艾德萊生物技術有限公司的總RNA提取試劑盒，反轉錄使用TOYOBO的熒光定量反轉錄試劑盒參考說明書進行。熒光定量使用試劑為TAKARA公司的SYBR green PCR master mix(TAKARA，大連)。反應體系和程序參考本實驗室常規(guī)方法進行[23]，反應體系為：cDNA模板1 μL，SYBR Primix ExTaq5 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 3 μL，PCR反應程序為：95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s， 60 ℃ 34 s， 40 個循環(huán); 95 ℃ 15 s， 60 ℃ 1 min， 95 ℃ 15 s。

由于18S rRNA在擬穴青蟹的多種不同樣本中能穩(wěn)定表達，適合作為擬穴青蟹基因表達分析的內參基因。本文使用18S作為內參基因[24]，Na+/H+-exchanger的特異性引物為Sp-NHE-RTF(TGTGATGTGTTACGGAGGGC)和Sp-NHE-RTR(AAACCATGGCGATAGTGGCA)。采用標準曲線法進行分析計算檢測Na+/H+-exchanger基因在各個樣本中的相對表達量。

1.5 擬穴青蟹大眼幼體在不同鹽度脅迫下對Na+/H+-exchanger的表達調控分析

實驗所用為擬穴青蟹大眼幼體3日齡，實驗設置鹽度7、17和37試驗組和自然海水對照組(鹽度27)，保持溫度與養(yǎng)殖池溫度一致，每組約40只幼體，鹽度37試驗組水體由自然海水與鹵水混勻調制，鹽度7和17試驗組水體由自然海水與滅菌處理后的自來水(滅菌處理程序與養(yǎng)殖池海水處理程序一致)混勻調制，實驗前水體充分曝氣。各鹽度組分別在實驗20 min、1 h、2 h和6 h時取樣，放于無RNA酶離心管中，標記編號后置于RNA保存液中冷凍保存。

2 結果與分析

2.1 Na+/H+-exchanger基因cDNA全長克隆及序列分析

本研究采用RACE技術克隆獲得了擬穴青蟹Na+/H+-exchanger的全長(GenBank 接收號：MK408672)，cDNA全長3 624 bp(圖1)，開放閱讀框(ORF)長2 886 bp。ORF編碼氨基酸961個，預測蛋白分子量為107.1 kDa，理論等電點為6.90。

通過氨基酸序列多重比對分析表明，Na+/H+-exchanger氨基酸序列在60～660氨基酸區(qū)段內保守性較高。SMART分析預測表明該基因編碼蛋白結構域包括: Na+/H+-exchanger蛋白結構域(82～484)、信號肽 (0～21)和4個低復雜結構(23～42、 675～684、855～868和889～902)。TMHMM和ProtScale在線工具分析表明，Na+/H+-exchanger基因編碼蛋白質結構中含有12個跨膜結構域，主要分布于0～487氨基酸區(qū)段，該區(qū)段內親、疏水性氨基酸均有分布，488～951氨基酸編碼蛋白無跨膜區(qū)段，位于膜內，呈親水性。

2.2 Na+/H+-exchanger基因的多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析

多序列比對分析發(fā)現(xiàn)，擬穴青蟹Na+/H+-exchanger基因編碼氨基酸序列與三疣梭子蟹、中國明對蝦、普通濱蟹、麥龍螯蝦、天空藍魔和紅螯螯蝦的一致度分別為84.9%、62.7%、56.5%、53.7%、53.5%和52.1%(圖2)。利用MEGA 4.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析表明，脊椎動物和無脊椎動物Na+/H+-exchanger遺傳進化距離較遠，埃及伊蚊等昆蟲類聚為一支，擬穴青蟹同三疣梭子蟹親緣關系最近，并同中國明對蝦等聚為一支(圖3)。

2.3 Na+/H+-exchanger基因時空表達分析

利用qRT-PCR檢測Na+/H+-exchanger基因在擬穴青蟹成蟹不同組織中的表達情況。組織分布分析表明，擬穴青蟹Na+/H+-exchanger在卵巢中表達量最高，其次是精巢、鰓、中腸、胸神經節(jié)、心臟、納精囊，腦神經節(jié)中表達量最低(圖4)。除性腺組織外，其他組織表達情況與三疣梭子蟹和普通濱蟹在Na+/H+-exchanger基因上的研究結果基本一致。在幼體發(fā)育過程中，Na+/H+-exchanger基因在受精卵時期表達量最高，大眼幼體期次之。溞狀幼體Ⅱ期(Z2)最低，從受精卵期到溞狀幼體Ⅱ期(Z2)逐漸降到最低。然后隨著發(fā)育逐漸升高，到大眼幼體期(M)再次達到較高值，之后逐漸下降(圖5)。

圖1 擬穴青蟹 Na+/H+-exchanger的cDNA全長及其翻譯的氨基酸序列Fig.1 cDNA and deduced amino acid sequence of Na+/H+-exchanger from Scylla paramamosain注：方框內為起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAG)；* 代表終止密碼子；黃色陰影所示為熒光定量引物結合位點；陰影部分分別是信號肽(0～21)和Na+/H+-exchanger蛋白結構域(82～484)Note: The starting codon(ATG) and the stop codon (TAG) are in the box; * stands for termination codon; the yellow shadow regions are the binding sites of fluorescence quantitative primers; the shadow regions are signal peptide(0-21) and Na+/H+-exchanger domain(82-484)

圖2 Na+/H+-exchanger氨基酸序列與其他物種Na+/H+-exchanger的序列比對Fig 2 Na+/H+-exchanger amino acid sequence compared with Na+/H+-exchanger of other species注：黑色下劃線標注為預測的Na+/H+-exchanger蛋白結構域Note: Na+/H+-exchanger domain is underlined

圖3 基于Na+/H+-exchanger氨基酸序列的物種NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig 3 Phylogram based on neighbor-joining tree of species of Na+/H+-exchanger amino acid sequences

圖4 Na+/H+-exchanger基因在不同組織中的表達Fig 4 Tissue distribution analysis of Na+/H+-exchanger注： Cg：腦神經節(jié);Gi：鰓;H：心臟;Mi:中腸;Ov:卵巢;Sr:納精囊;Te:精巢;Tg:胸神經節(jié)Note: Cg： cephalic ganglion;Gi: gill;H: heart; Mi: midgut;Ov: ovary;Sr: seminal receptacle;Te: testes;Tg: thoracic ganglion

2.4 Na+/H+-exchanger基因在不同鹽度脅迫下的表達分析

鹽度7、17和37試驗組和養(yǎng)殖塘自然海水對照組(鹽度27)的測定結果表明，鹽度從27驟降至7和17時，7和17試驗組Na+/H+-exchanger基因的表達水平明顯高于對照組。在1 h和2 h期間，鹽度7和17試驗組Na+/H+-exchanger基因的表達水平明顯下降，此時已有足夠的蛋白產物，推測這是此時其表達水平降低的原因；而6 h時，鹽度7和17試驗組Na+/H+-exchanger基因的表達水平基本恢復正常，說明幼體已適應這種鹽度環(huán)境。鹽度37試驗組在20 min時Na+/H+-exchanger基因先下降，在1～2 h期間逐漸恢復至正常表達水平，但到6 h時其表達水平再次下降(圖6)。

圖5 Na+/H+-exchanger基因在不同發(fā)育階段中的表達Fig 5 Expression pattern of Na+/H+-exchanger during different larval development stages注: F. egg: 受精卵；Z1～Z5：溞狀幼體I-V；M: 大眼幼體；C1:一期仔蟹；C2：二期仔蟹Note: F. egg: fertilized eggs；Z1-Z5: five developmental phases of the zoea stage；M: megalopa stage；C1: the early juvenile crab；C2: the second juvenile crab

圖6 鹽度脅迫下Na+/H+-exchanger基因在擬穴青蟹大眼幼體期的表達情況Fig 6 Expression of Na+/H+-exchanger gene in the megalopae of Scylla paramamosainunder salinity stress

2.5 Na+/H+-exchanger蛋白結構域的比較分析

通過SWISS-MODEL在線程序對擬穴青蟹Na+/H+-exchanger蛋白結構域(82～484/961)進行三級結構的預測分析，以智人Na+/H+antiporter的三級結構模型(PDB: 4cza.1.A)為模板預測擬穴青蟹Na+/H+-exchanger蛋白結構域的三級結構，并與三疣梭子蟹(A0A286QYA6) Na+/H+-exchanger蛋白結構域(84～486/986)、斑馬魚(F1R610)Na+/H+-exchanger蛋白結構域(100～505/970)和黑腹果蠅(Q8MQP4) Na+/H+-exchanger蛋白結構域(199～603/999) 的三級結構進行比較分析(圖7)。

結果表明，擬穴青蟹、三疣梭子蟹、斑馬魚Na+/H+-exchanger蛋白結構域與黑腹果蠅Na+/H+-exchanger蛋白結構域相比較更為保守，說明Na+/H+-exchanger蛋白結構域的保守性基本符合生物進化規(guī)律，但也受物種生物特性及生活環(huán)境等影響，總體而言，Na+/H+-exchanger蛋白結構域在這些海洋動物間是高度保守的。

圖7 擬穴青蟹Na+/H+-exchanger domain (A)、三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger domain (B)、斑馬魚Na+/H+-exchanger domain (C)和黑腹果蠅Na+/H+-exchanger domain (D)蛋白三維結構模型Fig 7 Three-dimensional structure models of Na+/H+-exchanger domain from Scylla paramamosain (A), Portunus trituberculatus (B),Danio rerio (C) and Drosophila melanogaster (D)

3 討論

本研究首次克隆得到擬穴青蟹Na+/H+-exchanger基因cDNA全長，可編碼961個氨基酸，其氨基酸序列與三疣梭子蟹一致性最高，達到84.9%，這一結論印證了擬穴青蟹與三疣梭子蟹同屬梭子蟹科且具有相似生存環(huán)境和生活習性的特點，與PéQUEUX[2]提出的地域分布對生物滲透調節(jié)能力具有重要影響的結論一致。SMART在線結構域預測分析發(fā)現(xiàn)該基因具有典型的Na+/H+-exchanger蛋白結構域(82～484)，充分證明該基因為擬穴青蟹Na+/H+-exchanger基因。通過SWISS-MODEL在線程序對擬穴青蟹等物種的Na+/H+-exchanger蛋白結構域進行三級結構的預測分析，結果也表明Na+/H+-exchanger蛋白結構域在這些海洋動物間是高度保守的。TMHMM和ProtScale在線工具預測表明0～487氨基酸區(qū)段具有12個跨膜α螺旋，與擬穴青蟹Na+/H+-exchanger蛋白結構域重疊，且該區(qū)段內親疏水性氨基酸均有分布，推測該區(qū)段可能與離子的跨膜轉運功能相關[21]。此外，系統(tǒng)進化分析表明，擬穴青蟹Na+/H+-exchanger符合遺傳進化規(guī)律。

利用RT-qPCR分析表明擬穴青蟹Na+/H+-exchanger基因的表達具有組織特異性，除性腺組織外與三疣梭子蟹和普通濱蟹Na+/H+-exchanger基因的研究結果基本一致[5,19]，但三疣梭子蟹與普通濱蟹目前沒有Na+/H+-exchanger基因在性腺組織表達的分析研究報道。本文首次在梭子蟹科探究該基因在性腺組織的表達，并發(fā)現(xiàn)該基因在擬穴青蟹性腺相關組織(卵巢、精巢和納精囊)表達量較高，其中卵巢和精巢表達顯著高于鰓。鹽度的變化會直接影響擬穴青蟹變態(tài)和蛻殼周期與成功率，水環(huán)境的穩(wěn)態(tài)是擬穴青蟹產卵和發(fā)育的必要條件，這個過程中Na+/H+-exchanger基因可能扮演著重要的作用。

鹽度7試驗組擬穴青蟹大眼幼體在20 min表達量顯著高于鹽度17和對照組(鹽度27)，表明Na+/H+-exchanger基因在較低鹽度環(huán)境下的作用更加明顯。鹽度7和17試驗組在1 h表達水平顯著低于對照組(鹽度27)，明顯受到抑制，推測是前期Na+/H+-exchanger基因的高表達已滿足滲透調節(jié)作用，此時已有足夠的蛋白產物。低鹽組(鹽度7和17)在2～6 h，Na+/H+-exchanger基因表達水平基本恢復正常，體現(xiàn)了擬穴青蟹大眼幼體有一定低鹽環(huán)境適應能力。結果表明，擬穴青蟹Na+/H+-exchanger基因在鹽度適應過程中主要在低鹽脅迫下起作用，且其在低鹽環(huán)境下是一個快速應答的基因，在高鹽環(huán)境中作用不明顯。高鹽組(鹽度37)該基因的表達在20 min內表達量低于對照組，推測是因為高鹽度對基因表達產生抑制。

本研究探討了鹽度脅迫作用下擬穴青蟹Na+/H+-exchanger基因的表達情況，通過對擬穴青蟹Na+/H+-exchanger基因的克隆、鑒定和表達分析，初步論述了該基因的序列特征、Na+/H+-exchanger蛋白結構域及其在擬穴青蟹大眼幼體鹽度適應過程中的生理作用，為水生甲殼動物滲透壓調控分子機制提供了理論支撐。