袁 敏，黃桂忠，韋必曉，吳杏起，劉華勇，廖馳林，梁 東，陳秀林，梁林慧

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院研究生院，廣西 百色 533000；2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬西南醫(yī)院 心內(nèi)科，廣西 百色 533000)

高血壓成為我國(guó)當(dāng)前患病率較高的疾病之一，且呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，估計(jì)當(dāng)前約有2.7億患者，而且民眾對(duì)疾病還缺乏深層次的認(rèn)識(shí)，在治療和預(yù)防方面都有待提高。該病的發(fā)病機(jī)制相對(duì)來(lái)說(shuō)較為繁雜[1-3]。其具體發(fā)病機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究，截至目前為止，交感神經(jīng)系統(tǒng)活性亢進(jìn)導(dǎo)致兒茶酚胺分泌增加，血管收縮導(dǎo)致血壓升高被認(rèn)可為主要機(jī)制，其他還包括腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)激活、腎臟機(jī)制等。交感神經(jīng)中的β2-AR是使血管舒張的主要受體，它主要分布于血管平滑肌細(xì)胞和腎臟細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)調(diào)節(jié)血管的緊張性、腎臟排泄和腎素釋放起而到調(diào)節(jié)血壓的作用。因此，當(dāng)β2-AR出現(xiàn)變異時(shí)，β2-AR擴(kuò)張血管的作用可能會(huì)減弱，從而導(dǎo)致血壓升高[4]。有研究表明，β2-AR基因有多態(tài)性，且有原發(fā)性高血壓相關(guān)的易感基因，因此可以通過(guò)在分子生物探尋原發(fā)性高血壓的發(fā)病機(jī)制，從而增加醫(yī)務(wù)人員對(duì)高血壓的治療方法，并提高對(duì)該疾病的防治措施和認(rèn)識(shí)[5]。

1 資料與方法

1.1采用隨機(jī)的抽樣方式，百色市及各區(qū)縣人民醫(yī)院2019年9月15日-2019年10月25日在以上醫(yī)院高血壓門(mén)診就醫(yī)的98例當(dāng)?shù)貕炎逶l(fā)性高血壓患者為病例組，男64例，女34例，年齡25～80歲，平均(56.89±12.26)歲?；颊咧辽儆?年高血壓病史和服用降壓藥控制于正常水平的患者并且3代之內(nèi)沒(méi)有異族通婚史的當(dāng)?shù)貕炎寰用瘛?duì)照組選取2019年9月15日-2019年10月25日于百色市及各區(qū)縣人民醫(yī)院體檢中心的109例當(dāng)?shù)貕炎褰】嫡Ｈ恕Ｄ?5例，女64例，年齡25～80歲，平均(55.91±14.11)歲。所有受試者均知曉該項(xiàng)研究的項(xiàng)目和內(nèi)容，均同意并自愿參與此項(xiàng)研究，受試者本人簽署了同意書(shū)。同時(shí)受試者們填寫(xiě)了有關(guān)信息的調(diào)查表。

1.2方法 (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)1999年WHO/ISH高血壓治療指南，選取收縮壓≥140 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，舒張壓≥90 mmHg的患者。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：心血管病變(如主動(dòng)脈關(guān)閉不全、主動(dòng)脈縮窄)、腎臟疾病(如腎動(dòng)脈狹窄、腎小球疾病)、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病(如皮質(zhì)醇增多癥、原發(fā)性醛固酮增多癥、甲狀腺功能亢進(jìn)癥、甲狀腺功能減退癥、糖尿病)、顱腦疾病(如腦外傷、腦干感染)、妊娠以及不能耐受檢查的人員。

1.3問(wèn)卷調(diào)查 將所需要的數(shù)據(jù)和信息設(shè)計(jì)為表格和問(wèn)卷并填寫(xiě)，如家族史、肌酐、尿酸等。

1.4一般健康指標(biāo)檢測(cè) 按照間接測(cè)量法，測(cè)量非同日血壓，血壓測(cè)量不得少于3次，取平均值。

1.5提取受試者的全血DNA 取出核酸提取試劑盒(磁珠法)(重慶中元生物技術(shù)有限公司)中的各組分平衡至室溫，進(jìn)行下一步操作，需將可能黏附在96孔鋁膜及孔壁的液體甩至孔底部，靜置3～5 min備用。在96孔深孔板a1到h1，a7到h7孔位依次加入20 μl的蛋白酶K。在96孔深孔板a1到h1，a7到h7孔位依次加入200 μl的受試者的全血，打開(kāi)核酸提取儀進(jìn)入程序頁(yè)面(ZY-WB-DNA)，進(jìn)行程序設(shè)定，程序編輯好后，點(diǎn)擊“開(kāi)始”運(yùn)行，程序完成提取過(guò)程約需要20 min。程序設(shè)定見(jiàn)表1。

表1 運(yùn)行程序的設(shè)定

1.6檢測(cè)基因多態(tài)性 引物的合成與設(shè)計(jì)：由南寧國(guó)拓生物科技有限公司根據(jù)所需檢測(cè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)β2-AR基因的rs6879202、rs2053044位點(diǎn)的 PCR 擴(kuò)增引物。引物序列如下(5’-3’)：Rs6879202-F：ACTGCTGTGTGAAGACCTCCC；Rs6879202-R：CTTCAGATACAAATTACCAGCAGC；Rs2053044-F：AACAGATAATGAGTGAGTGATGCC；Rs2053044-R：ACTCCGAACTTGCCTCACC。

1.7SNP的檢測(cè) 將所有標(biāo)本的DNA送至南寧國(guó)

拓生物科技有限公司進(jìn)行檢驗(yàn)，(1)目的片段PCR擴(kuò)增；(2)酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；(3)PCR 產(chǎn)物電泳檢測(cè)；(4)PCR產(chǎn)物純化，檢測(cè)結(jié)果通過(guò)SoftGenetics GeneMarker VI.91軟件分型并輸出結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1相關(guān)因素 患者飲酒率、吸煙率、是否有家族高血壓史、性別以及職業(yè)與原發(fā)性高血壓呈現(xiàn)一定的相關(guān)性(P<0.05)，相反學(xué)歷與原發(fā)性高血壓并沒(méi)有一定的相關(guān)性(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組相關(guān)因素比較[例(%)]

2.2生化指標(biāo) 病例組與對(duì)照組之間比較，年齡、總膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。病例組與對(duì)照組之間的尿素氮、肌酐、甘油三酯、尿酸、低密度脂蛋白膽固醇和空腹血糖與原發(fā)性高血壓均呈現(xiàn)一定的相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.3基因直接測(cè)序結(jié)果 見(jiàn)圖1～3。

2.4遺傳平衡檢驗(yàn) 病例組中β2-AR基因rs6879202位點(diǎn)和rs2053044位點(diǎn)多態(tài)性分布皆與HWE定律(P>0.05)相符；百色地區(qū)壯族對(duì)照組β2-AR基因rs6879202位點(diǎn)和rs2053044位點(diǎn)多態(tài)性也符合HWE定律(P>0.05)，體現(xiàn)病例組和對(duì)照組的兩個(gè)位點(diǎn)選取樣本具群體代表性。見(jiàn)表4。

表3 兩組生化指標(biāo)比較

表4 兩組遺傳平衡檢驗(yàn)

2.5β2-AR基因型與等位基因頻率分布 β2-AR基因位點(diǎn)rs6879202基因型頻率分布，在病例組與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，然而其等位基因頻率分布，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；β2-AR基因位點(diǎn)rs2053044基因型頻率分布，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而且其等位基因頻率分布，兩組差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。由此可得，百色地區(qū)壯族患者β2-AR基因rs6879202位點(diǎn)多態(tài)性與原發(fā)性高血壓有相關(guān)性，而β2-AR基因rs2053044位點(diǎn)多態(tài)性與百色壯族的原發(fā)性高血壓沒(méi)有相關(guān)性。見(jiàn)表5。

表5 兩組β2-AR基因型與等位基因頻率分布[例(%)]

2.6原發(fā)性高血壓患者β2-ARrs6879202易感基因型的logistic分析 采用logistic回歸來(lái)探討各個(gè)基因?qū)φT導(dǎo)患者高血壓的危險(xiǎn)性的大小。對(duì)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的基因位點(diǎn)，自變量X為各個(gè)基因頻率，因變量為是否產(chǎn)生高血壓。對(duì)rs6879202位點(diǎn)而言，可以看出CG基因頻率較其他兩個(gè)基因頻率更容易誘導(dǎo)原發(fā)性高血壓。見(jiàn)表6。

表6 原發(fā)性高血壓患者rs6879202易感基因型的logistic回歸結(jié)果

3 討 論

復(fù)雜的環(huán)境因素與遺傳因素是導(dǎo)致高血壓的主要原因，參與血壓調(diào)節(jié)的任何一個(gè)候選基因的變異都有可能導(dǎo)致高血壓，而β2-AR就是調(diào)節(jié)血壓的一個(gè)重要的候選基因。

β2-AR的全核苷酸序列位于染色體5q31-q32，該基因沒(méi)有內(nèi)含子，只有一個(gè)外顯子，長(zhǎng)約1 239個(gè)堿基，總共編碼413氨基酸，其相對(duì)分子質(zhì)量為64 000，由3個(gè)細(xì)胞外環(huán)，3個(gè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)，細(xì)胞外氨基末端及細(xì)胞內(nèi)的羧基末端7次跨膜段組成，β2-AR總共還有3個(gè)功能區(qū)：胞外區(qū)域、跨膜區(qū)域和胞內(nèi)區(qū)域，β2-AR中在編碼區(qū)總共有11個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，在調(diào)控區(qū)，有10個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，即該基因含有21個(gè)多態(tài)位點(diǎn)[6-8]。當(dāng)交感神經(jīng)興奮時(shí)釋放的兒茶酚胺作用于β2-AR上，并通過(guò)受體-G蛋白-AC-cAMP-PKA通路對(duì)平滑肌產(chǎn)生抑制性效應(yīng)使得血管擴(kuò)張和血壓下降[9-11]。因此，當(dāng)β2-AR存在基因多態(tài)性時(shí)，可能導(dǎo)致β2-AR對(duì)血壓的調(diào)節(jié)部分或者全部喪失，從而導(dǎo)致血壓升高。早期Reihsaus等[9]研究就發(fā)現(xiàn)β2-AR有3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)+46、+79、+491可能與高血壓有關(guān)，+46位點(diǎn)的A突變?yōu)镚使得β2-AR16位的氨基酸由精氨酸突變?yōu)楦拾彼幔?79位點(diǎn)的C突變?yōu)镚使得β2-AR27位的氨基酸由谷氨酰胺突變?yōu)楣劝彼幔?491位點(diǎn)的C突變?yōu)門(mén)使得β2-AR164位的氨基酸由蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?。近幾年?lái)，研究較多的位點(diǎn)主要是Glyl6和Gln27Glu[12]，有多項(xiàng)研究表明β2-AR 基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓有關(guān)，雖然國(guó)內(nèi)外就高血壓有關(guān)基因的研究成果多，但大家的結(jié)論卻并不一致。而且有國(guó)外研究表明β2-AR基因多態(tài)性與人群的民族特征具有一定的相關(guān)性。例如Kotanko等[13]在加勒比海地區(qū)，對(duì)本地非洲人后裔進(jìn)行調(diào)查研究，通過(guò)研究當(dāng)?shù)厝甩?-AR 基因 Glyl6 等位基因，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)患高血壓與Glyl6基因有關(guān)。栗程等[14]在對(duì)西北地區(qū)漢族的182例高血壓患者與104例血壓正常者的β2-AR基因Gln27Glu基因多態(tài)性的研究中發(fā)現(xiàn)：Gln27Glu基因與該地區(qū)原發(fā)性高血壓沒(méi)有相關(guān)性。李南方等通過(guò)對(duì)新疆哈薩克族人群β2-AR的G252A和C523T的多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)?shù)厝巳夯几哐獕号c這兩個(gè)位點(diǎn)的基因型、等位基因、基因聯(lián)合型無(wú)關(guān)[15]。吳弘等[16]通過(guò)對(duì)166例高血壓患者和98例健康者的研究中發(fā)現(xiàn)：在β2-AR的5’-調(diào)控區(qū)有兩個(gè)基因多態(tài)位點(diǎn)(654位和1023位)，在對(duì)這兩位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性研究中發(fā)現(xiàn)，1023位的等位基因型(AA)與重度高血壓相關(guān)。吳杏起等通過(guò)對(duì)36例患有高血壓的壯族人群和36例該民族的健康人群研究中發(fā)現(xiàn)：β2-AR的rs6879202和rs2053044位點(diǎn)與原發(fā)性高血壓無(wú)關(guān)[17]。Alghasham等[18]對(duì)沙特人群的β2-AR基因G46A多態(tài)性中，發(fā)現(xiàn)原發(fā)性高血壓與G46A沒(méi)有顯著性差異。

為進(jìn)一步探索β2-AR基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓以及民族特征的關(guān)系。本文選取百色地區(qū)壯族3代內(nèi)沒(méi)有異族通婚史的人群作為研究對(duì)象，得出，β2-AR基因rs6879202位點(diǎn)與百色地區(qū)壯族人群的原發(fā)性高血壓有相關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)β2-AR基因rs2053044位點(diǎn)多態(tài)性與該地區(qū)的該民族原發(fā)性高血壓不存在相關(guān)系。通過(guò)Logistic回歸分析對(duì)β2-AR基因rs6879202位點(diǎn)進(jìn)行危險(xiǎn)因素分析，發(fā)現(xiàn)CG人群患高血壓的頻率較高，這可能為我們提供一些關(guān)于如何保護(hù)高?；蝾l率患者的建議，他們?cè)谄匠５纳钪懈装l(fā)病，應(yīng)給予更多的關(guān)注。對(duì)于β2-AR基因rs6879202位點(diǎn)為CG的人群，在職業(yè)方面，可以建議這些人從事工作壓力較小的行業(yè)，比如教師、保安、文員、公務(wù)員等，盡量不去從事警察、管理員、醫(yī)生、工人等負(fù)荷較重行業(yè)[19]。在生活習(xí)慣方面，可以建議這類人群少抽煙、適當(dāng)?shù)倪M(jìn)行體育鍛煉、減少鈉的攝入、多吃膳食以及提高飲食依從性等[20]。

綜上，β2-AR基因rs6879202位點(diǎn)與百色地區(qū)壯族人群的原發(fā)性高血壓有關(guān)聯(lián)，尤以CG型基因的攜帶者最為顯著，其更容易誘發(fā)高血壓。但本研究樣本含量有限，更深入的研究需要去證實(shí)此結(jié)論，從而找出原發(fā)性高血壓的發(fā)病機(jī)制。并由此為我國(guó)心血管部門(mén)的醫(yī)務(wù)人員提供相關(guān)的研究成果，增加醫(yī)務(wù)人員對(duì)高血壓的治療方法和提高對(duì)該疾病的防治措施和認(rèn)識(shí)。