聶蓓娜 許晨光 萬(wàn)曉春

1(中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 深圳 518055)

2(中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

3(廣東省免疫細(xì)胞治療工程技術(shù)研究中心 深圳 518055)

1 引 言

繼 2013 年腫瘤免疫治療被評(píng)為世界十大科技突破之首[1]后，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)在 2017 年批準(zhǔn)了兩款 CD19 嵌合抗原受體(Chimeric Antigen Receptor，CAR)T 細(xì)胞藥品上市，分別用于治療 B 細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)和彌散性大 B 細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)。這標(biāo)示著腫瘤細(xì)胞免疫治療從科研階段發(fā)展到了直接造福病人的階段[2]。CAR-T 技術(shù)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一是實(shí)現(xiàn) CAR 在 T 細(xì)胞上的安全穩(wěn)定表達(dá)。目前有 3 種可實(shí)現(xiàn)的方法:電穿孔、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)和慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。其中，通常的逆轉(zhuǎn)錄病毒所攜帶的 DNA 片段較小，不能感染非分裂細(xì)胞且體內(nèi)注射的致瘤風(fēng)險(xiǎn)較高；而電穿孔雖然較安全，但也只能實(shí)現(xiàn) T 細(xì)胞的瞬時(shí)表達(dá)，故需進(jìn)行多次制備和輸注[3]。因此，目前常用于制備 CAR-T 的方法是經(jīng)過(guò)改良的、相對(duì)更加安全穩(wěn)定的慢病毒侵染系統(tǒng)[4]。

慢病毒載體是重組的人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)，不僅能夠整合到宿主基因組獲得長(zhǎng)期穩(wěn)定的基因表達(dá)，而且具有無(wú)毒性、低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，已被用于人細(xì)胞的高效基因傳遞，并在基因治療研究和臨床治療中具有廣泛的應(yīng)用[5]。慢病毒存活和發(fā)揮功能所需的基本基因包括 gag、pol 和 env，分別編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白、逆轉(zhuǎn)錄蛋白及整合到宿主細(xì)胞基因組所需的酶和包膜糖蛋白[6]。目前制備慢病毒通常是把病毒基因組的基本原件分到單獨(dú)的質(zhì)粒中，再通過(guò)將 3～4 種不同的質(zhì)粒和目的穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人胚腎 293T 細(xì)胞獲得。實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模制備的病毒滴度范圍一般為 106～107TU/mL[7]，這雖然可以滿足短基因片段或易轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，但要實(shí)現(xiàn)較長(zhǎng) CAR 基因在 T 細(xì)胞上的高效轉(zhuǎn)染和表達(dá)則需對(duì)病毒進(jìn)行濃縮純化以提高滴度。一般最常用的是物理濃縮方式，主要包括超速離心(超離)和超濾。

超速離心是實(shí)驗(yàn)室中較常見(jiàn)的一種病毒濃縮方式。常規(guī)超離所需的相對(duì)離心力(RCF)一般超過(guò) 10 000×g，以除去雜質(zhì)和確保較高的感染活力[8]。另有研究表明，含 env 編碼的包膜蛋白的慢病毒顆粒在超離過(guò)程中能保持較好的穩(wěn)定性[9]，但由于超離一次循環(huán)處理的病毒液體積十分有限，且儀器和耗材造價(jià)昂貴，故不利于比較大體積病毒液的濃縮。超濾是一種采用分子量截?cái)嘀?MWCO)在 20～500 kDa 的各向異性高分子膜進(jìn)行壓力驅(qū)動(dòng)的分離過(guò)程[10]。其中，超濾膜主要由兩層組成:提供機(jī)械強(qiáng)度的厚大孔支撐層、負(fù)責(zé)膜的選擇性和滲透性的薄表皮層[11]。超濾膜由超濾柱承載，由于超濾操作時(shí)間較超離的短，對(duì)離心機(jī)轉(zhuǎn)速要求不高，故也廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室的病毒濃縮和緩沖液交換。目前關(guān)于超離和超濾濃縮病毒效果比較的研究中，較多涉及的是非 HIV 不同種病毒之間的比較[12]。而針對(duì)不同慢病毒濃縮方式間的優(yōu)劣探究中，僅在一些對(duì)含不同包膜蛋白的慢病毒滴度和感染效果的比較研究中有所提及。但對(duì)于含不同長(zhǎng)度插入基因的同種包膜慢病毒，仍然缺乏超離與超濾濃縮效果的對(duì)比研究[13-14]。雖然大規(guī)模生產(chǎn)病毒的下游工藝已較成熟，但在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室小批量制備高滴度慢病毒時(shí)，對(duì)濃縮方式的選擇仍沒(méi)有相關(guān)的研究作為參照依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)旨在使用兩種含不同長(zhǎng)度外源基因的二代慢病毒，比較二者使用不同方法濃縮的效果，以探索超離和超濾對(duì)科研級(jí)制備高滴度慢病毒的影響。

2 材料與方法

2.1 材料

本研究所用穿梭質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒由中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院免疫細(xì)胞治療實(shí)驗(yàn)室保存；人胚腎 293T 細(xì)胞系購(gòu)于美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)；急性 T 細(xì)胞白血病細(xì)胞系 Jurkat 購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)；RPMI-1640 培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基、0.25% 胰蛋白酶和磷酸鹽緩沖液(DPBS)均購(gòu)于美國(guó) Hyclone 公司；胎牛血清和 Opti-MEM 培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó) Gibco 公司；青霉素/鏈霉素雙抗購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；轉(zhuǎn)染試劑 PEIpro 購(gòu)于法國(guó) Polyplus Transfection 公司；100 mm×20 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿和 24 孔板均購(gòu)于無(wú)錫耐思生物科技有限公司；超濾柱購(gòu)于英國(guó)頗爾(PULL)公司；超速離心管購(gòu)于美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；0.45 μm 一次性針頭式過(guò)濾器購(gòu)于英國(guó)頗爾(PULL)公司；20 mL 一次性注射器購(gòu)于上海雙鴿醫(yī)療器械有限公司；超速離心機(jī)(美國(guó)貝克曼(Beckman)公司，型號(hào) Optima XE-100)；流式細(xì)胞分析儀(美國(guó)貝克曼(Beckman)公司，型號(hào) CytoFLEX)。

2.2 方法

2.2.1 病毒包裝

于轉(zhuǎn)染前一天，將狀態(tài)良好的 293T 細(xì)胞接種到 100 mm×20 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿，細(xì)胞數(shù)為(3.5～4.0)×106個(gè)/皿，以確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合率在 70%～80%。轉(zhuǎn)染時(shí)，采用 Opti-MEM 配制包裝質(zhì)粒 psPAX2、包膜質(zhì)粒 pMD2.G 和穿梭質(zhì)?；旌弦?，加入 PEIpro 靜置 15 min 后滴加到前一天接種的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng) 6～8 h 后更換新培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染 48 h 后收集上清液，0.45 μm 濾膜過(guò)濾去除雜質(zhì)得病毒原液。

2.2.2 病毒濃縮

將所得病毒原液取出 1 mL，剩下的病毒液均分兩管，分別進(jìn)行超離和超濾處理。

(1) 超速離心

將病毒液轉(zhuǎn)移到超速離心機(jī)專用離心管中，精確配平后使用 Beckman 超速離心機(jī)進(jìn)行超離(40 000×g、4 ℃、2 h)。離心結(jié)束后去除上清液，并用新鮮培養(yǎng)基重懸收集底部病毒顆粒沉淀。

(2) 超濾

將病毒液加入分子量截?cái)嘀禐?100 kDa 的 Omega 膜超濾柱，4 ℃、3 220×g 離心 30 min，收集上層濃縮液。

2.2.3 T 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和滴度測(cè)定

于 24 孔培養(yǎng)板中每孔接種 5×105個(gè) Jurkat 細(xì)胞，第一梯度稀釋孔的細(xì)胞懸液體積為 300 μL，后續(xù)稀釋梯度每孔加入 360 μL 細(xì)胞懸液。其中，每個(gè)梯度設(shè) 3 個(gè)平行，共設(shè) 4 個(gè)濃度梯度。取 100 μL 濃縮后的病毒液加入第一梯度孔。另取 3 個(gè) 1.5 mL 離心管用于病毒稀釋，第一管中加入 340 μL 培養(yǎng)基，其余離心管分別加入 360 μL 培養(yǎng)基。取 100 μL 病毒液加入第一管，充分混勻后吸取 40 μL 混合液加入第二梯度孔，再?gòu)牡谝还苤腥?40 μL 加入第二管，依此進(jìn)行 10 倍稀釋，每孔終體積為 400 μL。置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜后補(bǔ)充 1 mL 新鮮培養(yǎng)基，感染 48 h 后取 500 μL 細(xì)胞懸液進(jìn)行流式檢測(cè)熒光蛋白的表達(dá)。使用 0.5%～10% 的熒光蛋白陽(yáng)性率計(jì)算滴度:

2.2.4 統(tǒng)計(jì)分析

本文使用 GraphPad Prism 8 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，其中實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”(n=3)表示。

3 結(jié) 果

3.1 質(zhì)粒構(gòu)建和表達(dá)

本文在慢病毒穿梭載體的基礎(chǔ)上，以自切割短肽 P2A 序列[15]做橋接構(gòu)建了共表達(dá) mCherry 熒光蛋白和 CD19 CAR (CAR19)的慢病毒質(zhì)粒，其中通過(guò) mCherry 表征 CAR19 的表達(dá)，故本文將該病毒質(zhì)粒表示為 CAR19-mCherry。同時(shí)，以標(biāo)記綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)的慢病毒質(zhì)粒(表示為 pWPXLd-GFP)作為對(duì)照。兩種病毒質(zhì)?；驑?gòu)成如圖 1(a)所示，將二者分別轉(zhuǎn)入 293T 細(xì)胞 48 h 后，通過(guò)流式分析熒光蛋白表達(dá)情況。從圖 1(b)可看出，mCherry 和 GFP 在 293T 上的瞬時(shí)表達(dá)率分別為 18.5% 和 36.9%，表明在慢病毒載體上插入的目的基因成功轉(zhuǎn)入 293T 細(xì)胞并能有效表達(dá)。

3.2 慢病毒產(chǎn)生和感染效率測(cè)定

圖 1 有效表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建Fig. 1 The construction of effective expression plasmids

慢病毒顆粒在 293T 細(xì)胞中組裝后，通過(guò)內(nèi)體分選復(fù)合體運(yùn)送出細(xì)胞膜，并釋放到胞外空間[16]。因此，本文通過(guò)收集 293T 包裝 48 h 后的細(xì)胞上清液，過(guò)濾雜質(zhì)后得到病毒毒液。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，首先將濃縮前、后病毒液分別感染 Jurkat 細(xì)胞。結(jié)果顯示，在等體積情況下，兩種濃縮方法濃縮 15 倍后的病毒液均比未濃縮時(shí)的感染效率高 1.5～2 倍(如圖 2 所示)，這表明濃縮處理是有效的。其次，對(duì)濃縮后的病毒液進(jìn)行梯度稀釋并分別感染 Jurkat 細(xì)胞。48 h 后流式分析及熒光顯微鏡觀察 mCherry 熒光蛋白表達(dá)可見(jiàn)，隨著病毒稀釋倍數(shù)的增加，熒光細(xì)胞數(shù)量成倍遞減，且能明顯看出超濾的滴度高于超離，具體如圖 3(a、b)所示。最后，將陽(yáng)性表達(dá)率與病毒加入量做統(tǒng)計(jì)分析。為準(zhǔn)確計(jì)算滴度、避免多個(gè)病毒顆粒整合到同一細(xì)胞內(nèi)，在病毒加入量與熒光表達(dá)率呈線性關(guān)系的范圍內(nèi)選取數(shù)值進(jìn)行滴度計(jì)算[17]。如圖 3(c)所示，每次病毒感染后選取 0.5%～10% 的陽(yáng)性率計(jì)算病毒滴度。

圖 2 濃縮有效性分析Fig. 2 The assessment of concentrated effectiveness

3.3 不同濃縮方式的滴度和回收效率

通過(guò)比較超離和超濾法產(chǎn)生的病毒滴度差異可知，兩種方法均可對(duì)慢病毒產(chǎn)生有效的濃縮。從表 1 可以看出，同一濃縮倍數(shù)下，超離產(chǎn)生的病毒滴度為 108～109TU/mL，回收率為 115%～202%。對(duì)比而言，超濾產(chǎn)生的滴度均高于 1×1010TU/mL，比超離滴度高 20～40 倍；同時(shí)，回收效率比超離高 60～400 倍。這表明，超濾法在慢病毒滴度和回收率方面比超離更有效。圖 4 顯示，兩種方法產(chǎn)生的滴度間具有顯著性差異(P＜0.05)。由此可見(jiàn)，通過(guò)超濾能得到更高效的慢病毒顆粒濃縮，且濃縮造成的損失更少，對(duì)病毒活力的抑制也更小。

圖 3 不同方法濃縮后的病毒感染效率評(píng)估Fig. 3 The assessment of infection efficiency of virus concentrated by different methods

表 1 超離心法和超濾法濃縮慢病毒的比較 Table 1 Comparison of lentivirus stocks concentrated by ultracentrifugation or ultrafiltration

圖 4 不同濃縮方式滴度統(tǒng)計(jì)分析Fig. 4 The statistical analysis of titers concentrated by different methods

4 討論與分析

目前用于測(cè)量慢病毒滴度的方法主要有 4 種:(1)使用定量 PCR(聚合酶鏈反應(yīng))法檢測(cè)轉(zhuǎn)導(dǎo)病毒細(xì)胞基因組中的載體拷貝數(shù)；(2)基于病毒 RNA(核糖核酸)測(cè)定病毒載體相對(duì)顆粒數(shù)；(3)使用 ELISA(酶聯(lián)免疫吸附)測(cè)定 HIV-1 p24 蛋白；(4)通過(guò)流式測(cè)定慢病毒載體表達(dá)的熒光蛋白滴定慢病毒滴度。其中，前 3 種方法無(wú)法確定所測(cè)定的病毒顆粒是否有活性，而流式分析法能夠比較準(zhǔn)確地測(cè)定活性病毒顆粒的滴度[18]。因此，本文采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)慢病毒的感染效率和滴度。

本文通過(guò)對(duì)比超離和超濾對(duì)含不同目的基因的慢病毒的影響發(fā)現(xiàn)，超離所得的滴度遠(yuǎn)低于超濾，說(shuō)明超離過(guò)程可能使慢病毒的活性和感染效力減弱甚至丟失。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，等體積等稀釋度的病毒液感染 Jurkat 細(xì)胞時(shí)，超離的病毒會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)變差甚至大量死亡，表明超離方法對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的毒性高于超濾法。推測(cè)原因，首先可能是超離的離心力較大且時(shí)間較長(zhǎng)，施加在病毒顆粒上的剪切力可能會(huì)使得病毒活性下降，使得感染力大幅降低。其次，超離過(guò)程涉及相變(從液體到固體)，也可能會(huì)導(dǎo)致病毒失活[19]。對(duì)于離心力造成的剪切力，Boroujeni 等[18]發(fā)現(xiàn)降低相對(duì)離心力至 8 000×g 時(shí)，可在一定程度上提高病毒的存活率。另外，多種與病毒顆粒密度類似的雜質(zhì)會(huì)被沉淀下來(lái)，如宿主細(xì)胞的膜泡等[20]，而這些雜質(zhì)會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，容易造成感染細(xì)胞死亡。另有研究表明，小鼠大腦注射超離沉淀后的逆轉(zhuǎn)錄病毒會(huì)引起輕微神經(jīng)炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)[21]。本文表 1 顯示超離的回收率存在一定的損失，提示超離對(duì)慢病毒的損傷作用可能與慢病毒的包膜蛋白 VSV-G 有關(guān)[22]。從表 1 可以看出，無(wú)論是超離還是超濾，相同條件下含較長(zhǎng)外源 CAR 片段的慢病毒產(chǎn)率比只含 GFP 的慢病毒低一個(gè)數(shù)量級(jí)，而從圖 1(b)可知慢病毒質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞的陽(yáng)性率也僅相差約一倍。因兩個(gè)慢病毒載體的外源基因相差約2 000 bp，表明慢病毒的濃縮獲得率與插入片段長(zhǎng)度具有一定關(guān)系。

相對(duì)來(lái)說(shuō)，超濾所得到的病毒滴度更高，從回收率來(lái)看病毒顆粒的損失更小，且感染后的細(xì)胞狀態(tài)較好，提示超濾濃縮的病毒懸液感染力更強(qiáng)、細(xì)胞毒性更低。雖然超濾的離心過(guò)程也會(huì)產(chǎn)生剪切力，但與超離相比，其離心時(shí)間較短、離心速率較低，因而對(duì)病毒活力的影響大大降低。使用合適孔徑的濾膜能在達(dá)到高回收率的同時(shí)濾除多數(shù)小粒徑雜質(zhì)，既能提高病毒純度又大大降低雜質(zhì)引起的細(xì)胞毒性。由于慢病毒大小在 300 kDa左右，因此本文使用分子截留率為 100 kDa 的濾膜進(jìn)行超濾，從表 1 可見(jiàn)其滴度和回收率都遠(yuǎn)高于超離。Rodrigues 等[23]也發(fā)現(xiàn)，病毒超濾后的回收率普遍高于 100%，主要原因與超濾不涉及相變，能更好地保持病毒的活力有關(guān)[19]。另有研究[24]認(rèn)為，回收率超過(guò) 200% 可能是去除了大量的血清蛋白、降解的 DNA 片段和轉(zhuǎn)染抑制因子。但超濾也存在弊端，如果病毒顆粒與膜孔徑大小在同一數(shù)量級(jí)，那么病毒顆粒有可能陷入濾膜微孔，導(dǎo)致低回收率[25]。另外，膜污染是超濾的潛在制約因素，污垢的積累會(huì)導(dǎo)致流速隨著時(shí)間的增加而降低[19]，故為確保濃縮病毒的質(zhì)量，超濾的體積應(yīng)在合理范圍內(nèi)。

5 結(jié) 論

本文通過(guò)比較超離和超濾對(duì)含不同長(zhǎng)度目的基因慢病毒的濃縮效果，探究了超離和超濾兩種方式對(duì)二代慢病毒滴度和回收率的影響。結(jié)果顯示，無(wú)論是從滴度還是回收率來(lái)看，超濾濃縮慢病毒的效果均優(yōu)于超速離心。表明在實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模制備高滴度慢病毒過(guò)程中，超濾產(chǎn)生的慢病毒感染力更強(qiáng)，細(xì)胞毒性也更低，比超離達(dá)到更優(yōu)的病毒濃縮和純化效果。同時(shí)，超濾具有所需耗材更便宜，操作更方便、時(shí)間更短，可濃縮體積更大等特點(diǎn)，無(wú)疑比超離更適用于實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模制備高滴度慢病毒，特別對(duì) CAR-T 基礎(chǔ)研究中所涉及到慢病毒濃縮純化具有重要參考意義。