劉登堯，李建邦，黃伍奎，楊樹法，樊喜文

（新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 介入診療科，新疆 烏魯木齊）

0 引言

組織間內(nèi)照射治療作為非小細(xì)胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC）的一種輔助治療手段，對(duì)于經(jīng)傳統(tǒng)放化療后效果不佳的患者，是一種較好的局部治療選擇[1]。125I粒子組織間近距離治療可通過持續(xù)釋放低劑量率射線造成物理損傷有效控制局部腫瘤，同時(shí)刺激分泌各種細(xì)胞因子啟動(dòng)細(xì)胞凋亡，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長[2]。本研究探討125I 粒子抑制人肺鱗癌裸鼠移植瘤生長的作用機(jī)制，旨在為臨床提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

肺癌細(xì)胞株H520（上海名勁生物科技有限公司），健康雄性BALB/c 裸鼠20 只，體重20.0～25.0 g。125I 粒子，6711-99 型，粒子長4.5 mm，直徑0.8 mm，活度分別為22.2 MBq、0 MBq（空源粒子），半衰期59.43 d。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

復(fù)蘇H520 細(xì)胞，混勻制成細(xì)胞懸液，置于37 °C、5%CO2培養(yǎng)。

1.2.2 裸鼠移植瘤建模

實(shí)驗(yàn)前24 h 禁食，自由飲水。取對(duì)數(shù)生長期的H520 細(xì)胞制成濃度為1×107細(xì)胞/100 μL 的單細(xì)胞懸液，取100 μL接種于裸鼠右上肢皮下，每兩天用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤長短徑。當(dāng)體積達(dá)1000 mm3時(shí)建模成功，進(jìn)行粒子植入。

1.2.3 動(dòng)物分組及粒子植入

按隨機(jī)數(shù)字表法將模型裸鼠平均分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。造模成功后，瘤體體積達(dá)1 cm3進(jìn)行粒子植入，實(shí)驗(yàn)操作者做好射線防護(hù)，用徒手穿刺植入法，將放射性粒子植入移植瘤內(nèi)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不同，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別植入活度為22.2 MBq 和0 MBq 的粒子各1 顆。各組動(dòng)物分籠飼養(yǎng)。

1.3 移植瘤生長情況

分別于粒子植入前、粒子植入后直至第30 天，期間每隔2 d 測(cè)量腫瘤的長徑（A）和短徑（B），按公式計(jì)算腫瘤相對(duì)體積（V）=A×B2/2，觀察兩組的體積曲線變化趨勢(shì)[3]，在皮下移植瘤體積達(dá)1000 mm3時(shí)用乙醚麻醉裸鼠后處死，移植瘤置于-80 ℃中保存。

1.4 VEGF 蛋白表達(dá)

常規(guī)制備移植瘤組織切片，脫蠟，水洗?？乖迯?fù)：高壓修復(fù)：鍋內(nèi)倒入0.01 M 檸檬酸鈉緩沖液，溫度調(diào)到最大，高壓鍋置氣后開始計(jì)時(shí)2 min45 s，脫蠟至水：脫蠟液Ⅰ 20 min，脫蠟液Ⅱ 20 min，脫蠟液Ⅲ 20 min，脫水后放入80%乙醇浸泡8 min，水洗。抗原修復(fù)：高壓修復(fù)：鍋內(nèi)倒入0.01 M 檸檬酸鈉緩沖液，溫度調(diào)到最大，高壓鍋置氣后開始計(jì)時(shí)2 m i n 4 5 s，自然冷卻。滅活：將處理后的組織玻片擦干，滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，置于室溫（25 ℃）避光處理10 min 后，PBS 洗。一抗孵育：將處理后的組織玻片擦干，每張片子加150 μL 抗體（抗體用專用稀釋液稀釋，含血清），37 ℃孵育1 h，后PBS 洗。滴加增強(qiáng)酶標(biāo)羊抗小鼠/兔IgG 聚合物，室溫靜置20 min，PBS 洗。DAB 顯色3 min，水洗。復(fù)染后脫水：80%乙醇5 min，95%乙醇5 min，無水乙醇5 min，透明液Ⅰ5 min，透明液Ⅱ5 min。中性樹膠封片。鏡下觀察，當(dāng)視野中細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色深染顆粒為陽性。半定量結(jié)果分析：在20 倍鏡視野測(cè)量相對(duì)灰度值，相對(duì)灰度值=（背景灰度值-實(shí)測(cè)灰度值）[4]，值越小，代表該蛋白表達(dá)越高。

1.5 VEGF mRNA 表達(dá)

采用熒光定量PCR 法檢測(cè)移植瘤組織VEGF mRNA表達(dá)。mRNA 相對(duì)表達(dá)量運(yùn)用ABI7500 軟件（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）進(jìn)行分析，采用法。RNA 反轉(zhuǎn)錄后擴(kuò)增（Roche Lightcycler 480 Ⅱ）。引物、內(nèi)參序列以及反應(yīng)條件，如表1 所示。

表1 引物序列

1.6 數(shù)據(jù)處理統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 腫瘤生長情況

經(jīng)大體觀察測(cè)量，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組瘤體生長趨勢(shì)均穩(wěn)定增長，實(shí)驗(yàn)組從125I 粒子植入后第10 天開始，腫瘤體積增長速度開始放緩，在第20 天后直至第30 天實(shí)驗(yàn)組的生長曲線更為平坦，與對(duì)照組曲線的差距比逐漸增大。

2.2 VEGF 蛋白表達(dá)

免疫組化檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組人肺鱗癌H520 細(xì)胞移植瘤組織中VEGF 蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在30 d 后對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組瘤組織免疫組化切片中VEGF 均有陽性表達(dá)（胞質(zhì)和細(xì)胞表面呈深棕色）。但兩組表達(dá)情況有不同，經(jīng)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)對(duì)照組VEGF 陽性表達(dá)水平明顯高于實(shí)驗(yàn)組，相對(duì)灰度值為（130.7±9.2）（92.7±7.2）。

2.3 VEGF mRNA 表達(dá)

熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在粒子植入后30 d，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組VEGF mRNA 表達(dá)情況不同，經(jīng)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后分別為（0.279±0.065）（0.923±0.088）（P＜0.05）。

3 討論

放射性粒子植入在國外批準(zhǔn)應(yīng)用于前列腺癌的治療。作為一種局部近距離內(nèi)照射放療經(jīng)我國學(xué)者引進(jìn)后，經(jīng)過多年努力和改進(jìn)，配合各種輔助引導(dǎo)方式，目前該治療技術(shù)正廣泛地應(yīng)用于體部各部位實(shí)體惡性腫瘤的臨床治療，越來越多的患者從中獲益[5]。125I 粒子的有效輻射距離約為1.7 cm，因此它具有靶區(qū)內(nèi)高劑量、靶區(qū)外低劑量的特點(diǎn)，可以避免對(duì)周圍正常組織和器官的影響。我們團(tuán)隊(duì)前期的臨床研究發(fā)現(xiàn)，放射性粒子聯(lián)合靜脈標(biāo)準(zhǔn)化療方案用于不可手術(shù)的晚期非小細(xì)胞肺癌患者，相較于單獨(dú)使用化療的患者，聯(lián)合治療組局部控制率高（78.4% vs 56.4%），1 年生存率高（66.7% vs 45.3%），兩組不良反應(yīng)發(fā)生率無明顯差異，提示粒子治療具有良好的近期療效和安全性，但患者能否從粒子治療中獲得長期生存仍需進(jìn)一步研究[6]。由于粒子治療的生物學(xué)特性，許多學(xué)者對(duì)其抑瘤生長機(jī)制開展大量研究。眾所周知，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）通過與特征性受體（VEGFR）相結(jié)合，激活下游信號(hào)通路，介導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)血管新生過程[7]。本次研究結(jié)果顯示，具有放射活度的粒子植入荷人肺鱗癌H520細(xì)胞裸鼠移植瘤后，實(shí)驗(yàn)組VEGF 表達(dá)水平降低（P＜0.05），表明放射性125I 粒子可在蛋白和基因水平降低人肺鱗癌組織VEGF 表達(dá)。同姚傳山等的研究結(jié)果類似[8]。此外，本研究觀察到實(shí)驗(yàn)組植入22.0 MBq 活度粒子后，在30 d 的實(shí)驗(yàn)觀察期內(nèi)移植瘤體積生長速度逐漸減慢，但經(jīng)過分析，兩者差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），推測(cè)可能實(shí)驗(yàn)設(shè)定觀察期較短，未達(dá)到粒子的自然半衰期所致，部分研究發(fā)現(xiàn)延長實(shí)驗(yàn)時(shí)間超過半衰期時(shí)，可觀察到體積差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[9-13]。

綜上所述，放射性125I 粒子可抑制人肺鱗癌H520 細(xì)胞荷瘤裸鼠移植瘤的生長，在蛋白水平和基因水平均能抑制VEGF 的表達(dá)，推測(cè)粒子治療可能通過影響該因子的表達(dá)發(fā)揮抑制腫瘤生長[14-15]。