陶筱帆 謝婷婷 李小霞 羅軍濤 白雅靜,2 韓兵社,2,3 張俊芳,2,3

低溫馴化下斑馬魚(yú)的表達(dá)檢測(cè)*

陶筱帆1謝婷婷1李小霞1羅軍濤1白雅靜1,2韓兵社1,2,3張俊芳1,2,3①

(1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 201306；2. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 上海 201306；3. 上海海洋大學(xué) 中國(guó)科學(xué)技術(shù)部海洋生物科學(xué)國(guó)際聯(lián)合研究中心 上海 201306)

長(zhǎng)散布核元件-1(Long spread nuclear element-1,)是跳躍基因。前期比較基因組研究發(fā)現(xiàn)，南極魚(yú)經(jīng)歷漫長(zhǎng)的低溫適應(yīng)進(jìn)化后，與南極圈外的同亞目魚(yú)類(lèi)相比較，在基因水平上的擴(kuò)增效率高達(dá)8~300倍，但的擴(kuò)增與魚(yú)類(lèi)抵御寒冷之間的關(guān)系尚未明了。本實(shí)驗(yàn)對(duì)斑馬魚(yú)()胚胎成纖維細(xì)胞ZF4進(jìn)行了不同時(shí)間梯度的低溫處理(18℃、5 d和18℃、30 d)，同時(shí)對(duì)斑馬魚(yú)成魚(yú)也進(jìn)行了不同時(shí)間的低溫處理(10℃, 3 h、6 h、1 d、3 d、5 d)。采用RT-qPCR檢測(cè)了的mRNA水平，并克隆了斑馬魚(yú)基因啟動(dòng)子區(qū)，利用Luciferase雙熒光報(bào)告系統(tǒng)，在ZF4細(xì)胞中驗(yàn)證5￠UTR在低溫壓力下的生物活性。結(jié)果顯示，短時(shí)間低溫處理下，ZF4細(xì)胞中mRNA水平有所降低，而在長(zhǎng)時(shí)間低溫處理中，的mRNA水平顯著升高。在成魚(yú)中，短時(shí)間低溫處理下，mRNA水平降低；長(zhǎng)期低溫處理下，mRNA水平顯著升高。在ZF4細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，5￠UTR具有生物活性。在低溫處理(18℃，3 d)下，報(bào)告基因信號(hào)減弱，間接表明啟動(dòng)子活性減弱。研究結(jié)果表明，低溫壓力會(huì)影響在魚(yú)類(lèi)中的表達(dá)。本研究為進(jìn)一步探究在魚(yú)類(lèi)適應(yīng)低溫環(huán)境中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

；低溫；斑馬魚(yú)；ZF4細(xì)胞；啟動(dòng)子

真核生物基因組中存在大量的轉(zhuǎn)座子元件，包含、和。迄今為止，3種逆轉(zhuǎn)座子依舊具有活性：、和元素。逆轉(zhuǎn)座子包含5￠UTR、2個(gè)開(kāi)放閱讀框及具有PolyA尾的3￠UTR (Dombroski, 1991)。屬跳躍基因，占人類(lèi)基因組約17%，為自主轉(zhuǎn)座，通過(guò)RNA中間體自我傳播；而和為非自主轉(zhuǎn)座(Lander, 2001)。它們利用“復(fù)制–粘貼”機(jī)制，通過(guò)RNA中間體在整個(gè)基因組中繁殖，這一過(guò)程稱(chēng)為逆轉(zhuǎn)錄(Lu, 2016)。逆轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座導(dǎo)致基因組改變，多數(shù)時(shí)候給基因組帶來(lái)負(fù)面影響，如：改變基因組結(jié)構(gòu)、影響基因表達(dá)、改變基因調(diào)控方式等(Gilbert, 2005; Tubio, 2014)。因此，宿主基因會(huì)通過(guò)啟動(dòng)子區(qū)域甲基化或者小RNA干擾等機(jī)制來(lái)抑制轉(zhuǎn)座(Kinomoto, 2007; Levin, 2011)。但研究表明，轉(zhuǎn)座元件與基因組是互益的(Faulkner, 2009)，逆轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座可導(dǎo)致新基因產(chǎn)生，這對(duì)于物種多樣性和物種進(jìn)化具有積極意義(Hamon, 2011; Volff, 2000)。

魚(yú)類(lèi)作為變溫動(dòng)物，水溫變化在很大程度上影響其生理及行為(Perry, 2005)。南極大陸經(jīng)歷了漫長(zhǎng)降溫，水溫常年處于0℃以下(Gordon, 2003)，南極圈內(nèi)與南極圈外同亞目魚(yú)類(lèi)相比較逆轉(zhuǎn)座子的擴(kuò)增倍率在8倍以上，有些甚至高達(dá)300倍(Chen, 2008)。這些基因可能參與了魚(yú)類(lèi)適應(yīng)寒冷的過(guò)程，在漫長(zhǎng)的歷史進(jìn)化中變化。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)，在面對(duì)環(huán)境壓力時(shí)，逆轉(zhuǎn)座子的逆轉(zhuǎn)座活性會(huì)受到環(huán)境因素影響(Butelli, 2012)。因此，推測(cè)寒冷可能會(huì)導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子擴(kuò)增，并且可能與魚(yú)類(lèi)適應(yīng)寒冷環(huán)境相關(guān)。

斑馬魚(yú)()體型纖細(xì)，成體長(zhǎng)為3~4 cm，對(duì)水質(zhì)要求不高。孵出后約4個(gè)月達(dá)到性成熟，成熟魚(yú)每隔幾天可產(chǎn)卵一次，卵子體外受精，體外發(fā)育，胚胎發(fā)育速度快，胚體透明、子代多、遺傳背景清楚，容易進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，易于在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)繁殖飼養(yǎng)，與人類(lèi)基因87%相似(Watanabe, 2016)，作為一種模式生物應(yīng)用于生物學(xué)中(Howe, 2013; Sollars,2003)。斑馬魚(yú)ZF4細(xì)胞來(lái)自孵化后1 d的斑馬魚(yú)胚胎(Driever, 1993)，被廣泛用于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中(Hu, 2015)。為研究低溫對(duì)的影響，本研究檢測(cè)了斑馬魚(yú)ZF4細(xì)胞18℃培養(yǎng)5 d和30 d、10℃培養(yǎng)3 h、6 h、1 d、3 d、5 dmRNA水平以及通過(guò)報(bào)告基因監(jiān)測(cè)基因5￠UTR在18℃ 3 d的活性變化，為研究寒冷環(huán)境下魚(yú)類(lèi)基因組中的表達(dá)變化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 ZF4細(xì)胞和斑馬魚(yú)

斑馬魚(yú)胚胎成纖維細(xì)胞ZF4購(gòu)買(mǎi)于ATCC (American Type Culture Collection)。斑馬魚(yú)由實(shí)驗(yàn)室斑馬魚(yú)魚(yú)房飼養(yǎng)，恒溫循環(huán)水系統(tǒng)，水溫為27℃~ 28℃，pH為6.8~7.8，用豐年蟲(chóng)()飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑和儀器

胎牛血清和胰蛋白酶、DMEM︰F12液體培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco公司；T4連接酶和限制性內(nèi)切酶購(gòu)于NewEngland；SYBR Green購(gòu)于羅氏公司；Lipofectamine3000購(gòu)于英濰捷基貿(mào)易有限公司；RT-qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司；雙熒光報(bào)告系統(tǒng)試劑盒購(gòu)于Promega公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成(表1)。

表1 PCR擴(kuò)增引物

主要儀器：細(xì)胞低溫培養(yǎng)箱(Galaxy170R, eppendorf)、LightCycler 480Ⅱ(羅氏)；酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司)；NanoDrop2000賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

應(yīng)用IDT引物設(shè)計(jì)軟件(http://sg.idtdna.com/ sessionTimeout.aspx)設(shè)計(jì)RT-qPCR引物(,, 表1)。采用Trizol方法提取斑馬魚(yú)細(xì)胞和肌肉組織的RNA，使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào): RR047A)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行SYBR Green熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。PCR條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算方法用2–ΔΔCt計(jì)算，β-actin作為內(nèi)參。

1.4 載體構(gòu)建及報(bào)告基因檢測(cè)

提取斑馬魚(yú)細(xì)胞基因組DNA，以基因組DNA為模板，上下游引物(，, 表1)分別引入酶切位點(diǎn)Ⅰ和Ⅰ，利用PCR擴(kuò)增基因5￠UTR，Ⅰ、Ⅰ酶切后用T4連接酶連接至載體PGL4.10中，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌內(nèi)。

選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的ZF4細(xì)胞接種于6孔板中，次日細(xì)胞完全貼壁后棄除培養(yǎng)基，按Lipofectamine3000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

采用Dual-Luciferase Reporter Assay System進(jìn)行雙熒光報(bào)告基因活性檢測(cè)，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用GraphPad Prism 5 (GraphPad software, 美國(guó))軟件分析。的表達(dá)數(shù)據(jù)和雙熒光檢測(cè)數(shù)據(jù)均來(lái)自3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，采用Student’s-test方法分析統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，<0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 斑馬魚(yú)胚胎成纖維細(xì)胞(ZF4)和斑馬魚(yú)成魚(yú)在低溫處理下LINE1的表達(dá)變化

有研究表明，長(zhǎng)期生活在低溫環(huán)境的南極魚(yú)基因組與南極圈外同亞目魚(yú)類(lèi)的基因組相比較，轉(zhuǎn)座家族發(fā)生了8~300倍的擴(kuò)增(Chen, 2008)。本研究選取的2個(gè)基因和進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。在斑馬魚(yú)成魚(yú)中，10℃為斑馬魚(yú)低溫生存的臨界溫度，因此，選取10℃作為魚(yú)類(lèi)低溫處理溫度。與在常溫(28℃)飼養(yǎng)的成魚(yú)相比，在10℃低溫處理3 h和6 h的成魚(yú)肌肉組織中的mRNA水平(圖1A)有所下調(diào)，而在10℃低溫處理1 d、3 d、5 d的成魚(yú)肌肉組織中mRNA水平顯著上調(diào)，在成魚(yú)中的mRNA水平(圖1B)與的mRNA有相同趨勢(shì)；在ZF4細(xì)胞中，選取18℃作為低溫環(huán)境(Han, 2016)，與常溫(28℃)細(xì)胞對(duì)比，在18℃低溫處理5 d的細(xì)胞中的mRNA水平有所下調(diào)，而在18℃低溫處理30 d的細(xì)胞的mRNA水平顯著上調(diào)(圖1C)。

2.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建與檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，低溫環(huán)境會(huì)引起CpG位點(diǎn)甲基化的改變(Han, 2016)。猜測(cè)低溫環(huán)境會(huì)影響5￠UTR區(qū)域啟動(dòng)子的活性，以斑馬魚(yú)基因組DNA為模板，將2個(gè)基因的5￠UTR區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖2)。

圖1 斑馬魚(yú)低溫處理下LINE1表達(dá)的變化(*: P<0.05.下同)

圖2 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

1:-promoter; 2:-promoter

載體PGL4.10-basic與PCR擴(kuò)增片段經(jīng)過(guò)Ⅰ和Ⅰ雙酶切后，在T4 DNA連接酶的作用下，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物插入PGL4.10-basic載體中(圖3)，將重組質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與PCR擴(kuò)增的基因序列相同，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 雙熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性，間接檢測(cè)5￠UTR區(qū)域啟動(dòng)子活性，5￠UTR區(qū)域啟動(dòng)子活性越高，熒光素酶活性發(fā)光值越高。海腎熒光素作為檢測(cè)系統(tǒng)內(nèi)參，當(dāng)5￠UTR區(qū)域啟動(dòng)子沒(méi)有生物學(xué)活性時(shí)，不能檢測(cè)到熒光素酶活性發(fā)光值。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)常溫(28℃)培養(yǎng)ZF4細(xì)胞中，結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照PGL4.10-basic相比，重組質(zhì)粒均能檢測(cè)到熒光素酶活性發(fā)光值，而PGL4.10-basic不能檢測(cè)到熒光素酶發(fā)光值，表明5￠UTR具有啟動(dòng)子活性(圖4A)。將重組質(zhì)粒與PGL4.10-basic和PGL3- promoter轉(zhuǎn)染到18℃低溫處理3 d的ZF4細(xì)胞中，PGL4.10-basic為陰性對(duì)照，PGL3-promoter為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果顯示，與常溫(28℃)細(xì)胞相比，重組質(zhì)粒在低溫處理下熒光素酶活性發(fā)光值均有不同程度的下降，表明短期低溫處理會(huì)影響基因5￠UTR區(qū)域啟動(dòng)子活性(圖4B)。

圖3 PGL4.10-LINE1 5￠UTR質(zhì)粒構(gòu)建

圖4 重組質(zhì)粒PGL4.10-LINE1-promoter轉(zhuǎn)染斑馬魚(yú)細(xì)胞后雙熒光素酶相對(duì)活性分析

3 討論

屬于最豐富的一類(lèi)自主轉(zhuǎn)座因子。盡管多數(shù)被抑制活性，但依舊有很少一部分的具有活性，的插入雖與疾病相關(guān)，但同樣影響基因組的進(jìn)化(Beck, 2011)。當(dāng)面對(duì)環(huán)境因素刺激時(shí)，基因組進(jìn)行自身進(jìn)化誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座(McClintock, 1984)，使生物對(duì)環(huán)境變化做出適應(yīng)性改變。在之前研究中發(fā)現(xiàn)，南極圈內(nèi)物種與南極圈外物種轉(zhuǎn)座子擴(kuò)增效率存在巨大差異。在西西里血橙中，寒冷誘導(dǎo)逆轉(zhuǎn)座子的擴(kuò)增(Butelli, 2012)。這提示的擴(kuò)增可能與生物體對(duì)長(zhǎng)期寒冷環(huán)境的適應(yīng)相關(guān)。為了研究逆轉(zhuǎn)座子在長(zhǎng)期低溫環(huán)境下的大量擴(kuò)增是否與生物體對(duì)寒冷環(huán)境的適應(yīng)相關(guān)，將ZF4細(xì)胞培養(yǎng)在18℃5 d，發(fā)現(xiàn)ZF4細(xì)胞生長(zhǎng)明顯停滯，而后20 d左右逐漸恢復(fù)生長(zhǎng)狀態(tài)，盡管相比28℃依舊緩慢。本研究發(fā)現(xiàn)，短期低溫處理誘導(dǎo)斑馬魚(yú)成魚(yú)及斑馬魚(yú)ZF4細(xì)胞的mRNA水平下調(diào)，長(zhǎng)期低溫處理誘導(dǎo)斑馬魚(yú)成魚(yú)及斑馬魚(yú)ZF4細(xì)胞的mRNA水平顯著上調(diào)，推測(cè)對(duì)生物體適應(yīng)外界低溫環(huán)境壓力可能有積極作用。生物體在寒冷環(huán)境下轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座水平升高，可能增加生物體基因型的多樣性，使其對(duì)環(huán)境壓力產(chǎn)生適應(yīng)性進(jìn)化。

在自然界中遵循著優(yōu)勝劣汰的法則，從生物的進(jìn)化開(kāi)始，生物體內(nèi)有益于適應(yīng)環(huán)境、使生物體更好生存下去的基因會(huì)保留，垃圾基因會(huì)逐漸被淘汰，那么在長(zhǎng)期寒冷環(huán)境中，L1的顯著擴(kuò)增是否是生物體為了適應(yīng)寒冷環(huán)境而選擇的一種生物途徑？在之前研究中發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)子甲基化水平在低溫環(huán)境下有所改變：18℃低溫處理ZF4細(xì)胞5 d，啟動(dòng)子甲基化水平升高，而低溫處理30 d時(shí)，甲基化水平降低(Han, 2016)。生物體會(huì)通過(guò)甲基化水平來(lái)調(diào)節(jié)表達(dá)水平，與甲基化水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(Hata,1997)，因此，甲基化水平升高時(shí)，被抑制，mRNA水平呈下降趨勢(shì)；當(dāng)甲基化水平降低時(shí)，激活，mRNA水平呈上升趨勢(shì)。據(jù)此推測(cè)，低溫環(huán)境會(huì)通過(guò)影響5￠UTR區(qū)域啟動(dòng)子活性，進(jìn)而影響的擴(kuò)增。構(gòu)建重組質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)，低溫確實(shí)能引起5￠UTR區(qū)域啟動(dòng)子活性改變，推測(cè)這種調(diào)節(jié)可能是生物體應(yīng)對(duì)外界低溫環(huán)境壓力的方式之一，L1對(duì)生物體適應(yīng)外界低溫環(huán)境壓力可能有積極作用。生物體在寒冷環(huán)境下轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座水平升高，可能增加生物體基因型的多樣性，使其對(duì)環(huán)境壓力產(chǎn)生適應(yīng)性進(jìn)化。

總之，本研究通過(guò)對(duì)斑馬魚(yú)細(xì)胞以及斑馬魚(yú)成魚(yú)不同時(shí)間的低溫處理，研究的表達(dá)變化，為更好了解在魚(yú)類(lèi)寒冷適應(yīng)中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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Expression of) During Cold Acclimation

TAO Xiaofan1, XIE Tingting1, LI Xiaoxia1, LUO Juntao1, BAI Yajing1,2, HAN Bingshe1,2,3, ZHANG Junfang1,2,3①

(1. Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 2. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Ministry of Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 3. International Research Center for Marine Biosciences, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306)

The long-spread nuclear element-1 () retrotransposon is a mobile element in genome. Previous comparative genomic studies found that Antarctic Notothenioid fish underwent a long low-temperature adaptation evolution, and compared with Notothenioid fish outside the Antarctic circle,genes were duplicated by 8~300 fold.The link between this augmentation and the resistance of fish to cold is not known. In this study, zebrafish () embryonic fibroblasts ZF4 were exposed to a low temperature (18℃) for 5 days and 30 days, and adult zebrafish were exposed to a low temperature (10℃) for 3 h, 6 h, 1 d, 3 d, and 5 d. The mRNA expression ofwas examined using RT-qPCR. The promoter regions of zebrafishgene were cloned and the biological activity of5'UTR at low temperature were verified in ZF4 cells by using the dual-luciferase reporter system. The following results were obtained: (1) In ZF4 cells,mRNA expression was decreased by short-term low temperature treatment, but was significantly increased by long-term low temperature treatment. (2) In adult fish,mRNA expression was decreased by short-term low temperature treatment, but was significantly increased in long-term low temperature treatment. (3) The5'UTR was found to be biologically active in ZF4 cells. (4) It was found that during low temperature treatment (18℃, 3 d), the reporter gene signal was weakened, which indirectly indicated that thepromoter activity was weakened. The results showed that low temperature stress affectedexpression in fish, which presents a foundation for further study on the mechanism of action of

; Low temperature;; ZF4 cells; Promoter

Q74

A

2095-9869(2020)03-0088-06

10.19663/j.issn2095-9869.20190226001

張俊芳，教授，E-mail: jfzhang@shou.edu.cn

2019-02-26,

2019-03-14

* 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31372516; 81770165)、上海市教育委員會(huì)“東方學(xué)者”計(jì)劃和上海市人才發(fā)展資金項(xiàng)目(201457)共同資助 [This work was supported by National Natural Science Foundation of China (31372516; 81770165), and Project of Shanghai Education Commission “Oriental Scholars” Program, and Shanghai Talent Development Fund Project (201457)]. 陶筱帆，E-mail: 512099587@qq.com

http://www.yykxjz.cn/

陶筱帆, 謝婷婷, 李小霞, 羅軍濤, 白雅靜, 韓兵社, 張俊芳. 低溫馴化下斑馬魚(yú)的表達(dá)檢測(cè). 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2020, 41(3): 88–93

Tao XF, Xie TT, Li XX, Luo JT, Bai YJ, Han BS, Zhang JF. Expression ofin zebrafish () during cold acclimation. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(3): 88–93

ZHANG Junfang, E-mail: jfzhang@shou.edu.cn

(編輯 馮小花)