黃書(shū)杰 徐 東 王東升 張現(xiàn)盛 葉乃好

海洋酸化對(duì)顆石藻生理特性的影響*

黃書(shū)杰1,2,3,4徐 東4王東升4張現(xiàn)盛4葉乃好4①

(1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 上海 201306; 2. 上海海洋大學(xué) 中國(guó)科學(xué)技術(shù)部海洋生物科學(xué)國(guó)際聯(lián)合研究中心 上海 201306; 3. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 201306; 4. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071)

CO2濃度升高引起的海洋酸化對(duì)海洋生物尤其是鈣化生物顆石藻產(chǎn)生了很大的影響。然而，有關(guān)顆石藻對(duì)CO2濃度升高響應(yīng)的研究多集中在單一的品系上，并且在種內(nèi)或者種間產(chǎn)生了差異甚至相互矛盾的結(jié)果。本研究中，分別以赫氏顆石藻()和大洋球石藻() 2種顆石藻的鈣化和非鈣化的4個(gè)品系藻種為研究對(duì)象，設(shè)置了400、750、1000、2000 μatm共4個(gè)CO2濃度梯度，同時(shí)進(jìn)行分批充氣培養(yǎng)，系統(tǒng)研究了海洋酸化對(duì)顆石藻的生長(zhǎng)光合、氮源吸收、元素組成和鈣化效率等生理影響。結(jié)果顯示，隨著CO2濃度升高至2000 μatm，不同的顆石藻并未有一致的反應(yīng)。除了非鈣化的(N-E)外，其他3個(gè)品系顆石藻的生長(zhǎng)和顆粒有機(jī)碳產(chǎn)率都對(duì)CO2增加表現(xiàn)出積極的響應(yīng)；隨著CO2濃度的升高，4種品系顆石藻的光合參數(shù)v/m、(Ⅱ)和葉綠素含量呈整體下降趨勢(shì)；CS369 (C-E)和(C-G)在第7天的鈣化效率分別下降了35.4%和68.9%；此外，4種品系顆石藻的顆粒有機(jī)氮產(chǎn)率都出現(xiàn)增加趨勢(shì)，而POC/PON和PIC/POC均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。本研究確定了海洋酸化對(duì)顆石藻的不同生理影響，這種差異影響可能會(huì)導(dǎo)致未來(lái)海洋生物多樣性的改變和其他生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)程的變化。

海洋酸化；顆石藻；特異性；生物多樣性

浮游植物在海洋食物網(wǎng)和生物地球化學(xué)循環(huán)中起著至關(guān)重要的作用(Falkowski, 2012)。顆石藻作為一種單細(xì)胞定鞭藻類，其細(xì)胞表面覆蓋著細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的方解石小板，是目前海洋中數(shù)量最多、分布最廣的鈣化浮游生物類群之一(Langer, 2009; Langer, 2013; Lohbeck, 2014; Young, 2014)。此外，顆石藻參與形成的碳酸鹽泵，在碳生物地球化學(xué)循環(huán)中發(fā)揮著重要作用；顆石藻能夠形成大規(guī)模的赤潮，這些特征被認(rèn)為對(duì)全球氣候變化有反饋?zhàn)饔?Hutchins, 2011; Riebesell, 2011; Jin, 2013; Beaufort, 2014)。然而，大氣CO2濃度的增加引起的海洋酸化正在導(dǎo)致海洋表層pH值下降(預(yù)計(jì)到2100年和2300年分別減少0.5和0.7個(gè)單位)(Caldeira, 2003; IPCC, 2008; Ross, 2011)，同時(shí)改變碳酸鹽系統(tǒng)(Beaufort, 2010)。表層海水的這些變化對(duì)顆石藻和其他鈣化藻種產(chǎn)生了巨大的影響，預(yù)計(jì)將影響整個(gè)群落和生態(tài)系統(tǒng)，甚至破壞整個(gè)海洋環(huán)境(Turley, 2010; Hoppe, 2011; Sinutok, 2011; Lohbeck, 2012; Meier, 2014)。

過(guò)去十年間，許多有關(guān)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)和大型半封閉野外培養(yǎng)(中試實(shí)驗(yàn))的研究，都集中在單種顆石藻對(duì)海洋酸化的響應(yīng)，這產(chǎn)生了不一致甚至相互矛盾的結(jié)果(Young,2014)。Riebesel等(2000)發(fā)現(xiàn)，隨著CO2濃度的增加，顆石藻的鈣化作用明顯減弱，同時(shí)伴隨著顆粒有機(jī)碳(POC)的增加。隨后對(duì)單一藻種赫氏顆石藻()的研究也表明，海洋酸化導(dǎo)致該物種的鈣化效率降低，但POC產(chǎn)量發(fā)生不均一(增加、減少或不受影響)變化(Zondervan,2002; Sciandra,2003; Delille,2005; Feng,2008; Müller,2010; Hoppe, 2011)。許多其他關(guān)于藻株應(yīng)對(duì)海洋酸化的研究也顯示相互矛盾的結(jié)果，例如，顆石藻鈣化率的不斷增加(Iglesias-Rodriguez,2008; Shi,2009; Jones, 2013)或不敏感變化(Langer, 2009; De Bodt, 2010; Fiorini,2011b)。

此外，前人研究的3種鈣化顆石藻(,,)，都對(duì)CO2濃度升高表現(xiàn)出不同的響應(yīng)模式。例如，CO2濃度升高使PC7/1的鈣化效率大幅下降44.7% (Riebesell, 2000)，4762藻株的鈣化率則表現(xiàn)出輕微增加(Rickaby,2010)，而AC370藻株反應(yīng)不敏感(Fiorini, 2011b)。鑒于這種矛盾的結(jié)果，已經(jīng)出現(xiàn)了一些同時(shí)測(cè)試不同顆石藻品系或種類的研究(Langer, 2006、2009; Fiorini, 2011b)。Langer等(2009)指出，先前海洋酸化研究中使用的不同赫氏顆石藻品系的敏感性在本質(zhì)上是不同的，這可能是由于存在特異性反應(yīng)的遺傳基礎(chǔ)所致。

過(guò)去有關(guān)海洋酸化對(duì)顆石藻鈣化作用影響的研究結(jié)果是不一致的，利用這些研究結(jié)果，在日益酸化的海洋環(huán)境中，準(zhǔn)確預(yù)測(cè)未來(lái)顆石藻的命運(yùn)仍然存在著問(wèn)題。此外，基于短期實(shí)驗(yàn)的海洋表層優(yōu)勢(shì)種赫氏顆石藻對(duì)海洋酸化的響應(yīng)也得到了深入的研究，文獻(xiàn)范圍也在迅速擴(kuò)大。Langer等(2006)指出，單一品系顆石藻得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可能會(huì)對(duì)很好適應(yīng)當(dāng)前CO2條件的不同顆石藻在應(yīng)對(duì)未來(lái)可能發(fā)生的海洋酸化的響應(yīng)研究產(chǎn)生偏差，而且實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在著缺乏普遍有效性的問(wèn)題。此外，由于非鈣化的顆石藻藻種在海洋生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的生態(tài)作用，非鈣化藻株的研究不應(yīng)該被忽視，并且最近受到越來(lái)越多的關(guān)注(Kottmeier, 2014)。因此，當(dāng)下需要同時(shí)研究更多不同的顆石藻品系，并研究CO2濃度升高對(duì)顆石藻的長(zhǎng)期生物學(xué)效應(yīng)。

本研究將CO2濃度從400 μatm升高到2000 μatm，來(lái)分別模擬當(dāng)今和未來(lái)海洋酸化條件。同時(shí)，利用顆石藻的2個(gè)優(yōu)勢(shì)種赫氏顆石藻和大洋球石藻，包括非鈣化的和鈣化的品系，進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)。通過(guò)測(cè)定顆石藻的細(xì)胞密度、藻體光合參數(shù)、氮吸收速率、顆粒無(wú)機(jī)碳(PIC)產(chǎn)量、顆粒有機(jī)碳(POC)產(chǎn)量、顆粒有機(jī)氮(PON)以及它們之間的比率等生理參數(shù)，以分析不同品系顆石藻在不同CO2濃度下的潛在生理變化。此外，擬合了4個(gè)品系顆石藻相對(duì)于CO2變化的氮吸收速率響應(yīng)曲線，并應(yīng)用響應(yīng)曲線中的動(dòng)力學(xué)常數(shù)進(jìn)一步分析4種品系顆石藻之間的本質(zhì)響應(yīng)差異。這些結(jié)果旨在了解類似條件下海洋酸化對(duì)不同顆石藻的差異影響，有助于評(píng)估未來(lái)環(huán)境條件下生物多樣性和其他生態(tài)進(jìn)程的改變。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和培養(yǎng)條件

實(shí)驗(yàn)所用的鈣化和非鈣化的赫氏顆石藻(簡(jiǎn)寫(xiě)為N-E;CS369, 簡(jiǎn)寫(xiě)為C-E)以及鈣化和非鈣化的大洋球石藻(NIES-1318, 簡(jiǎn)寫(xiě)為N-G;, 簡(jiǎn)寫(xiě)為C-G)均來(lái)源于中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所微藻培養(yǎng)中心。藻細(xì)胞在天然過(guò)濾海水(0.22 μm)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，海水中硝酸鹽和磷酸鹽的濃度分別為882 μmol/L和36.2 μmol/L，根據(jù)f/2培養(yǎng)基向海水中添加金屬和維生素(Guillard, 1962)。細(xì)胞培養(yǎng)在含1 L培養(yǎng)基的2 L三角燒瓶中，放置在植物培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度為20℃，鹽度為32。培養(yǎng)光源為白色熒光燈，光強(qiáng)為300 μmol/m2?s，光暗比為16 h/8 h，實(shí)驗(yàn)采用處于指數(shù)生長(zhǎng)期的顆石藻。

1.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)置 采用與Xu等(2014)類似的方法，在植物培養(yǎng)箱(GXZ，瑞華，武漢)中，將空氣與CO2混合，向4種品系顆石藻泵入不同CO2分壓的空氣，設(shè)3個(gè)重復(fù)的1000 ml培養(yǎng)物進(jìn)行培養(yǎng)。在準(zhǔn)備階段，在上述條件下，4種品系顆石藻被分別培養(yǎng)到指數(shù)生長(zhǎng)期。在培養(yǎng)基中用含有不同CO2分壓的空氣連續(xù)充氣，以提供400、750、1000和2000 μatm的CO2，各項(xiàng)初始值見(jiàn)表1。待持續(xù)充氣48 h穩(wěn)定后，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。每次實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)空氣–CO2混合物均設(shè)3份平行樣，以不添加細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)體系作為空白對(duì)照，分別監(jiān)測(cè)細(xì)胞密度和pH值。在取樣點(diǎn)分別測(cè)定葉綠素含量、PIC、POC、DIC和堿度。

1.2.2 碳酸鹽體系分析 培養(yǎng)基pH值采用pH計(jì)檢測(cè)(Orion ROSS, Thermo Electron Corp., 美國(guó))。總堿度(TA)用Whatman GF/F膜過(guò)濾，儲(chǔ)存在密封的100 ml三角燒瓶中，放置在-20℃，使用848自動(dòng)滴定儀(Metrohm, Riverview, FL, 美國(guó))獲得總堿度值。利用CO2SYS包獲得海水中碳酸鹽體系的pH、溫度、鹽度和TA，其中堿度根據(jù)Pelletier等(2007)提供的方法計(jì)算。

1.2.3 生長(zhǎng)測(cè)定 在光學(xué)顯微鏡(Nikon，日本)下用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器手動(dòng)計(jì)數(shù)，獲得準(zhǔn)確的細(xì)胞數(shù)以估算微藻的生長(zhǎng)情況。利用如下公式測(cè)定比生長(zhǎng)速率()：

=(ln1-ln0)/(1-0)

式中，0和1分別是初始時(shí)間0和隨后時(shí)間1的藻細(xì)胞濃度。

1.2.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定及色素分析 使用Dual-PAM-100(Walz, Effeltrich, 德國(guó))測(cè)定顆石藻的葉綠素?zé)晒鈪?shù)。測(cè)量前將樣品暗適應(yīng)15 min，在弱光下測(cè)定初始熒光(0)。暗適應(yīng)后的樣品在飽和脈沖光下獲得最大熒光值(m)?！閙代表被照亮后樣品的m產(chǎn)量，t是實(shí)時(shí)熒光產(chǎn)量。根據(jù)公式v/m=(m-0)/m計(jì)算最大PSⅡ量子產(chǎn)額(v/m)。有效PSⅡ量子產(chǎn)率計(jì)算：(Ⅱ)=(￠m-t)/￠m。

為了確定色素含量，樣品被過(guò)濾收集到GF/F過(guò)濾膜(25 mm)上，然后在4℃的黑暗條件下，用10 ml的90%丙酮提取24 h，7000 g離心10 min后，上清液用于室溫下色素含量分析。葉綠素含量采用Jeffrey等(1975)的方法測(cè)定。

1.2.5 氮吸收速率的測(cè)定 每個(gè)實(shí)驗(yàn)體系收集5 ml水樣，迅速用醋酸纖維素膜過(guò)濾，置于聚乙烯離心管中，冷凍保存于-80℃。營(yíng)養(yǎng)鹽分析前，將樣品解凍至室溫，用營(yíng)養(yǎng)鹽自動(dòng)分析儀(Bran and Luebbe AA3, 德國(guó))對(duì)硝酸鹽濃度進(jìn)行光度分析。氮吸收速率計(jì)算公式：NUR=(0-t)//，NUR為氮吸收速率(pmol of nitrate?N/cell?d)，0和t分別為實(shí)驗(yàn)開(kāi)始和第7天硝酸鹽濃度(pmol/L)；為水的體積(L)；為細(xì)胞數(shù)；為時(shí)間間隔(d)。此外，使用米氏方程曲線(Michaelis, 1913; Hutchins, 2013)擬合每個(gè)CO2濃度下的平行樣品關(guān)于氮吸收的CO2響應(yīng)曲線。使用Origin Pro軟件進(jìn)行動(dòng)力學(xué)常數(shù)和曲線相關(guān)系數(shù)的計(jì)算。

1.2.6 藻體中碳和氮元素的含量分析 將樣品過(guò)濾到灼燒過(guò)(500℃, 5 h)的GF/F膜(25 mm)，保存在-20℃直到分析。在分析之前，顆粒有機(jī)碳的濾膜用濃鹽酸熏24 h，除去無(wú)機(jī)碳，再次干燥。然后將過(guò)濾膜裝好進(jìn)行后續(xù)分析。POC、PON、TPC濃度由Vario ELⅢ自動(dòng)元素分析儀(Elemntar Analysensysteme Co., 德國(guó))依次測(cè)定。通過(guò)TPC與POC的差異，計(jì)算PIC濃度，POC、PIC或PON產(chǎn)量計(jì)算公式如下：

=比生長(zhǎng)速率(d?1)×細(xì)胞中POC、PIC或PON含量(pg/cell)。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17.0軟件，運(yùn)用單因素方差分析(One-way ANOVA)來(lái)分析各處理之間差異的顯著性，以<0.05作為差異顯著水平。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)中碳酸鹽體系的變化

本實(shí)驗(yàn)采用充氣法模擬海水酸化，檢測(cè)不同處理?xiàng)l件下的海水碳酸鹽系統(tǒng)參數(shù)的變化，包括pH、DIC、HCO3?、CO32?和CO2。圖1和表1為不同顆石藻的海水pH值隨CO2濃度的變化情況。濃度為400、750、1000和2000 μatm的CO2對(duì)應(yīng)的pH值分別為8.06±0.02、7.79±0.01、7.65±0.02和7.48±0.02。因?yàn)楹Ｋ泻幸饓A度變化的緩沖液，本研究設(shè)定的實(shí)驗(yàn)條件與預(yù)期的海洋酸化條件并不完全相同。有些實(shí)驗(yàn)測(cè)量需要大量的生物量，因此，需要較大的細(xì)胞密度，從而導(dǎo)致碳酸鹽體系的變化。盡管存在這些變化，但在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，培養(yǎng)藻的4種梯度的pH值始終保持著明顯的差異，使研究結(jié)果具有重要意義。

2.2 海洋酸化對(duì)顆石藻生長(zhǎng)的影響

實(shí)驗(yàn)室條件下，不同CO2分壓對(duì)4種品系顆石藻生長(zhǎng)的影響如圖2所示。所有處理的藻細(xì)胞濃度隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高并達(dá)到最大值，隨后，藻細(xì)胞濃度逐漸下降直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。CO2分壓對(duì)每種顆石藻的細(xì)胞濃度均有顯著影響。隨著CO2濃度逐漸增加，C-E、N-E和N-G均顯示出積極響應(yīng)，然而對(duì)于N-E，CO2分壓達(dá)到2000 μatm時(shí)，N-E的生長(zhǎng)被抑制。所有處理的藻細(xì)胞在前7 d均呈指數(shù)級(jí)生長(zhǎng)，其特定生長(zhǎng)速率如圖2e~h所示。CO2濃度持續(xù)增加至2000 μatm，比生長(zhǎng)速率分別增大約53% (C-E)，36% (N-G)和30% (C-G)。然而，對(duì)于N-E，當(dāng)CO2濃度達(dá)到1000 μatm，比生長(zhǎng)率增加約26%。當(dāng)CO2連續(xù)升至2000 μatm時(shí)，與對(duì)照組相比，海洋酸化導(dǎo)致N-E的比生長(zhǎng)率下降14%。

表1 初始碳酸鹽系統(tǒng)參數(shù)

Tab.1 The data of the original carbonated system

圖1 4種品系顆石藻在不同的CO2濃度下隨著培養(yǎng)時(shí)間改變的海水pH值變化

[N-E:(a); C-E:CS369 (b); N-G:NIES-1318 (c); C-G:(d)]

2.3 海洋酸化對(duì)顆石藻光合特性的影響

圖3為海洋酸化對(duì)顆石藻v/m和Y(Ⅱ)在內(nèi)的光系統(tǒng)參數(shù)變化的影響。當(dāng)CO2升高至2000 μatm時(shí)，所有處理的v/m和Y(Ⅱ)均顯示出負(fù)面影響，但響應(yīng)幅度在4種品系顆石藻中不同。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，除了CO2濃度達(dá)到2000 μatm時(shí)，C-E的參數(shù)v/m在第10天達(dá)到最大值，N-E一直下降之外，4種品系顆石藻的光合系統(tǒng)參數(shù)在第7天達(dá)到最大值，隨后下降直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。隨著CO2分壓增加到2000 μatm，對(duì)于N-E、C-E、N-G和C-G，海洋酸化對(duì)v/m的顯著抑制作用分別發(fā)生在第7、4、13和10天，而對(duì)Y(Ⅱ)的抑制作用分別發(fā)生在第4、13、13和10天。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，與對(duì)照組相比，當(dāng)CO2分壓升高至2000 μatm，v/m被抑制，分別下降60%、45%、55%和46%；Y(Ⅱ)也被抑制，分別下降75%、69%、76%和39%。此外，與N-E和N-G的最大Y(Ⅱ)值相比[低于400 μatm時(shí)分別為(0.32±1.90)%和(0.34±2.60)%]，C-E和C-G的最大Y(Ⅱ)值[低于400 μatm時(shí)分別為(0.39±3.10)%和(0.48±2.30)%]顯著較高，而v/m無(wú)顯著差異。

圖2 不同CO2濃度下4種品系顆石藻的生長(zhǎng)曲線(a~d)和比生長(zhǎng)速率(e~h)

圖3 培養(yǎng)過(guò)程CO2濃度升高對(duì)4種品系顆石藻的光合參數(shù)Fv/Fm (a~d)和Y(Ⅱ)(e~f)的影響

當(dāng)CO2濃度從400 μatm升高至2000 μatm對(duì)不同品系顆石藻細(xì)胞內(nèi)葉綠素含量的影響見(jiàn)圖4。細(xì)胞葉綠素含量在第20天(N-E、C-E和N-G)和第7天(C-G)達(dá)到最大值，在初始值出現(xiàn)微小變化后，葉綠素含量逐漸下降，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束(圖4a~d)。然而，隨著時(shí)間的推移，葉綠素呈現(xiàn)出整體穩(wěn)定下降的趨勢(shì)(圖4e~f)。然而，隨著CO2濃度從400 μatm增加至1000 μatm，每種顆石藻葉綠素含量以同樣模式下降(除了個(gè)別點(diǎn)以不同的方式呈現(xiàn))。然而，當(dāng)CO2濃度達(dá)到2000 μatm時(shí)，測(cè)定的結(jié)果表現(xiàn)出不同的反應(yīng)。與1000 μatm相比，當(dāng)CO2濃度為2000 μatm時(shí)，在每個(gè)采樣點(diǎn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，N-E的葉綠素和的含量降低。然而，對(duì)于藻株C-E、N-G和C-G，隨著CO2濃度增加到1000 μatm，在每個(gè)采樣點(diǎn)葉綠素含量趨向于增加。

2.4 海洋酸化對(duì)顆石藻氮吸收速率的影響

海洋酸化對(duì)4種品系顆石藻氮吸收速率的影響如圖5所示。隨著CO2從400 μatm升高至2000 μatm，4種品系顆石藻的氮吸收速率均增加，分別增加了48.2%(N-E)、33.9%(C-E)、41.6%(N-G)和34.3%(C-G)。氮吸收速率的最大變異值(48.2%, N-E)比最小變異值(33.9%, C-E)增大了近1.5倍。此外，4種品系顆石藻的氮吸收速率相對(duì)于CO2增加的響應(yīng)根據(jù)米氏方程曲線擬合，由響應(yīng)曲線得到2個(gè)半飽和常數(shù)(m, μatm CO2)和最大CO2飽和率(max, pmol N/cell?d)得到。藻體N-E中，最大m和max值分別是307.2 μatm和24.1 pmol N/cell?d，分別大于C-E最低值約1.7倍和1.3倍。

a:; b:CS369; c:NIES-1318; d:

2.5 海洋酸化對(duì)顆石藻元素組成及鈣化速率的影響

圖6為CO2升高對(duì)第7天的4種品系顆石藻的POC和PON的產(chǎn)生情況。當(dāng)CO2達(dá)到2000 μatm時(shí)，顯著刺激顆石藻產(chǎn)生POC和PON(除了N-E)。N-E顆石藻有機(jī)碳生產(chǎn)率的變化是巨大的，在1000 μatm CO2濃度條件下，表現(xiàn)出明顯的增加，但在2000 μatm時(shí)，表現(xiàn)出大幅下降。與對(duì)照組相比，C-E、N-G和C-G藻種的POC產(chǎn)量分別增長(zhǎng)約101%、35%和49%，其中C-E品系POC產(chǎn)率變化分別為N-G、C-G品種的2.9倍、2.1倍。此外，在此范圍內(nèi)，PON較對(duì)照組分別增加233%(N-E)、289%(C-E)、148%(N-G)和129%(C-G)，增幅較大。然而，隨著CO2由400 μatm升高至2000 μatm，4個(gè)藻種的顆粒有機(jī)碳和氮的變化導(dǎo)致顆粒有機(jī)碳與顆粒有機(jī)氮的比值(POC/PON)分別減少76.6%(N-E)、48.3%(C-E)、45.7%(N-G)和34.9%(C-G)。此外，與400 μatm CO2相比，2000 μatm CO2對(duì)顆粒有機(jī)碳的產(chǎn)率有負(fù)面的影響，2個(gè)鈣化品系C-E和C-G的鈣化率呈現(xiàn)更大程度的降低，分別為35.4%和68.9%。當(dāng)CO2濃度增大到2000 μatm，C-G比C-E呈現(xiàn)更高的PIC還原力。同時(shí)，這2種藻的PIC/POC值也分別下降67.9%和79.2%。

圖6 海水酸化對(duì)4種品系顆石藻顆粒有機(jī)碳和顆粒無(wú)機(jī)碳的生產(chǎn)率及碳氮比的影響

3 討論

本研究首次在實(shí)驗(yàn)中使用了非鈣化品系和鈣化品系的2種顆石藻，研究了它們對(duì)CO2升高的響應(yīng)。同時(shí)，利用氮吸收率擬合的CO2響應(yīng)曲線，獲得的動(dòng)力常數(shù)來(lái)分析不同顆石藻的遺傳變異性。當(dāng)CO2濃度升高到2000 μatm時(shí)，與其他3個(gè)藻種不同程度的積極響應(yīng)相比，N-E被嚴(yán)重抑制。本結(jié)果表明，海洋酸化對(duì)顆石藻產(chǎn)生生理影響，不同顆石藻對(duì)海洋酸化具有特異響應(yīng)，最近的研究表明，不同的浮游植物對(duì)CO2濃度升高的響應(yīng)存在種間異質(zhì)性(馬莎等, 2019)，這與本研究結(jié)果類似。作者推測(cè)，海洋酸化可能導(dǎo)致未來(lái)海洋生物多樣性、營(yíng)養(yǎng)相互作用關(guān)系和其他生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)程的變化。

3.1 海洋酸化對(duì)不同顆石藻生長(zhǎng)和光合系統(tǒng)參數(shù)的影響

研究表明，與對(duì)照組相比，除了N-E，高CO2濃度(增加到2000 μatm)促進(jìn)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖2)。而N-E的生長(zhǎng)在CO2濃度為2000 μatm時(shí)下降，其特定生長(zhǎng)率在第7天顯著降低了7.61%。然而，在CO2濃度升高至1000 μatm之前，N-E的生長(zhǎng)保持增長(zhǎng)狀態(tài)(圖2a和2e)。Fiorini等(2011b)也得到了類似的結(jié)果，富含CO2(750 μatm)的水中，顆石藻藻狀細(xì)胞的生長(zhǎng)呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)。

前人的研究表明，由于細(xì)胞外碳酸酐酶的活性較低，導(dǎo)致其CO2濃縮機(jī)制(CCM)效率相對(duì)較低(Herfort, 2002; Trimborn, 2007; Rokitta, 2012a; Jin, 2013)，所以，目前海洋中的顆石藻具有碳限制性。因此，酸化的海水可利用CO2含量的增加可能會(huì)加速Rubisco附近CO2的積累，以彌補(bǔ)碳供應(yīng)不足，進(jìn)一步促進(jìn)顆石藻的羧化作用和生長(zhǎng)作用(伴隨著POC的增加) (Barcelose, 2010; Reinfelder, 2011; Jin, 2013; Kottmeier, 2014)。本研究中，觀察到4種品系顆石藻在高CO2條件下的生長(zhǎng)情況，N-E在1000 μatm增長(zhǎng)23%，另外3種藻在2000 μatm時(shí)分別增長(zhǎng)53%(C-E)、36%(N-G)和30%(C-G)(圖2)。然而，每個(gè)品系對(duì)CO2升高的反應(yīng)能力和策略不同。此外，對(duì)于N-E來(lái)說(shuō)，在2000 μatm條件下，幾乎處于白化狀態(tài)。

研究表明，細(xì)胞外pH值的變化可以通過(guò)破壞恒定膜電位平衡和生理參數(shù)來(lái)影響藻細(xì)胞的活性(Langer, 2006; Taylor, 2011; Rokitta, 2012b)。相比于其他3種品系顆石藻，由于pH值下降及超過(guò)耐受能力(7.48, 2000 μatm)，N-E更加敏感而呈負(fù)反應(yīng)。因?yàn)轭w石藻是一種豐富的藻種，具有獨(dú)特的生理和形態(tài)特征(Winter, 1994; Raven, 2012)，推測(cè)顆石藻對(duì)CO2增加的特異性反應(yīng)具有遺傳基礎(chǔ)。Read等(2013)報(bào)道了第一次解析的基因組(來(lái)自CCMP1516)在復(fù)合種內(nèi)的變異性支持了顆石藻在不同生境中的繁榮發(fā)展。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，猜想顆石藻固有的遺傳特異性可能導(dǎo)致其對(duì)海洋酸化產(chǎn)生特異性反應(yīng)。

然而，由于光合系統(tǒng)參數(shù)和色素含量分析的藻類光合作用(與生長(zhǎng)緊密相關(guān))能力隨著CO2增加產(chǎn)生多種負(fù)反應(yīng)，尤其N-E幾乎喪失光合能力(圖3和4)。這些涉及到光系統(tǒng)活動(dòng)的結(jié)果表明，由于pH值下降(CO2升高)對(duì)細(xì)胞離子平衡的影響，藻細(xì)胞仍然處于光合不健康狀態(tài)(Langer, 2006)，誘導(dǎo)了葉綠素含量降低(圖4)。特別是當(dāng)CO2濃度達(dá)到2000 μatm，超過(guò)可調(diào)節(jié)的范圍，與其他3種品系顆石藻相比，NE的V/m和葉綠素的含量被嚴(yán)重影響(圖3a和4a)。與CO2升高對(duì)生長(zhǎng)的不同反應(yīng)相類似，不同藻類光合作用對(duì)CO2升高響應(yīng)也具有特異性。對(duì)于整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，一部分的微小變化可能會(huì)影響整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)，顆石藻對(duì)海洋酸化的特異反應(yīng)可能會(huì)影響生物多樣性和其他生態(tài)過(guò)程(Orr, 2005; Hendriks, 2010)。

3.2 海洋酸化對(duì)顆石藻氮吸收速率的影響

考慮到海洋酸化對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽吸收的影響，本研究在第7天取樣測(cè)試了不同CO2水平下各品系藻株的氮吸收速率，并擬合了每種顆石藻應(yīng)對(duì)CO2變化的氮吸收速率響應(yīng)曲線，以供進(jìn)一步分析。結(jié)果表明，當(dāng)CO2濃度升高至2000 μatm時(shí)，所有品系的氮吸收速率增加(圖5)。非鈣化藻株N-E和N-G的氮吸收速率顯著的增加了41.6%和48.2%(圖5a和c)，而鈣化藻株C-E和C-G分別在氮吸收速率提高了33.9%和34.3%。Jin等(2013)的研究表明，CO2增加導(dǎo)致顆石藻對(duì)無(wú)機(jī)氮的吸收增強(qiáng)，硅藻硝酸鹽還原酶基因上調(diào)。此外，各品系藻種之間也存在差異。

先前的研究表明，在海洋酸化條件下，顆石藻細(xì)胞具有能量再分配的過(guò)程(Raven, 2011; Beaufort, 2011)，導(dǎo)致額外的ATP釋放優(yōu)先支持額外的氮吸收以合成更多的蛋白質(zhì)(Jin, 2013)。然而，與非鈣化細(xì)胞相比，鈣化細(xì)胞需要更多的能量來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)鈣化作用中的氫離子到酸性環(huán)境中(Suffrian, 2011; Taylor, 2011; Beaufort, 2011; Stojkovic, 2013)。CO2升高到2000 μatm時(shí)，鈣化品系藻株的氮吸收速率顯著低于非鈣化藻株。此外，本研究在CO2升高下測(cè)定PON產(chǎn)量也間接證實(shí)了氮吸收的能量再分配偏好(圖6b)。

藻氮吸收速率相對(duì)CO2變化的響應(yīng)曲線，證實(shí)了CO2對(duì)這些顆石藻的影響行為。由響應(yīng)曲線推導(dǎo)出的動(dòng)力學(xué)常數(shù)(m)表示酶對(duì)底物的親和力，m值越大，親和力越小(Michaelis, 1913)。最近，Hutchins等(2013)通過(guò)分析不同的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，證實(shí)了固氮作用與CO2濃度之間的品系特異性差異。在這項(xiàng)研究中，相比其他3種藻株，N-E顯示出最高m值，即NO3還原酶的親和力最低(圖5)。這一結(jié)果與其他測(cè)量參數(shù)，如生長(zhǎng)速率、光合活動(dòng)等反映出相同的趨勢(shì)，這表明CO2濃度升高嚴(yán)重抑制了N-E的生命活動(dòng)。

3.3 海洋酸化對(duì)不同顆石藻元素組成的影響

浮游植物的化學(xué)元素組成會(huì)對(duì)營(yíng)養(yǎng)相互作用關(guān)系有一定影響，并最終對(duì)海洋營(yíng)養(yǎng)元素的生物地球化學(xué)產(chǎn)生影響，因?yàn)楹Ｑ蟾∮蝿?dòng)物的膳食價(jià)值隨POC與PON的比值(C∶N)變化而變化(Hutchins, 2009; Anderson, 2013)。本研究測(cè)量了不同品系顆石藻的C∶N比例，以評(píng)估生物有機(jī)體的元素組成是否受到CO2濃度的影響，并探討了影響的程度。結(jié)果顯示，在2000 μatm CO2濃度下，4種品系顆石藻的元素組成均發(fā)生變化，C∶N分別降低76%(N-E)、48%(C-E)、45%(N-G)和35%(C-G)(圖6)。N-E相對(duì)其他3種顆石藻的影響較大，C-G的影響最小。在之前的研究中，F(xiàn)iorini等(2011a)和Rickaby等(2010)的研究表明，當(dāng)CO2濃度增強(qiáng)時(shí)，顆石藻發(fā)生了相似的變化。當(dāng)CO2濃度從400 μatm持續(xù)上升到2000 μatm時(shí)，POC(除了在2000 μatm下的N-E)和PON的產(chǎn)率增加(圖6)。

研究還發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，PON的增加量比POC要高。前面已經(jīng)討論過(guò)，由于CO2的升高，能量的重新分配導(dǎo)致了更多的氮吸收，增加了PON產(chǎn)量。盡管不同顆石藻的品系之間存在差異，這種偏好優(yōu)勢(shì)使得PON產(chǎn)量超過(guò)POC產(chǎn)量，導(dǎo)致C∶N下降的幅度不同(圖6)。與Riebesell等(2011)之前的研究結(jié)果類似，C∶N比值隨著CO2濃度的變化具有高度的物種特異性。此外，這種變異比例可能是不同品系藻株間遺傳差異的體現(xiàn)。此外，也存在與目前的研究結(jié)果相反的結(jié)果，隨著CO2濃度的升高，細(xì)胞C∶N比值增加(Feng, 2010; Kottmeier, 2014)。

產(chǎn)生矛盾結(jié)果的原因可能是實(shí)驗(yàn)設(shè)置的不同，如溫度、光照強(qiáng)度、藻種的選擇等。此外，最終結(jié)果表現(xiàn)出一種非常有趣的現(xiàn)象，非鈣化藻的C∶N比值比鈣化藻高。這種現(xiàn)象的原因尚不清楚，但很可能與顆石藻鈣化作用有關(guān)。這些結(jié)果表明，CO2濃度的增加影響了顆石藻C∶N比值，并且對(duì)不同顆石藻產(chǎn)生了不同的影響。此外，它還將進(jìn)一步影響浮游植物的捕食選擇壓力，并對(duì)許多生物地球化學(xué)循環(huán)過(guò)程產(chǎn)生影響(特別是碳輸出通量)(Iglesias-Rodriguez, 2008)。

3.4 海洋酸化對(duì)顆石藻鈣化效率的影響

在過(guò)去幾年里，顆石藻PIC生產(chǎn)效率(鈣化率)已被廣泛用于顆石藻的研究，以預(yù)測(cè)海洋酸化的生物學(xué)影響。結(jié)果表明，當(dāng)藻細(xì)胞生長(zhǎng)在高于當(dāng)前CO2水平時(shí)(400 μatm)，主要反應(yīng)是鈣化率下降或者至少減少PIC/POC的值(Zon-dervan, 2001; Langer, 2006; Muller, 2010; Hoppe, 2011)。本研究中，關(guān)于PIC的響應(yīng)與上述的趨勢(shì)是一致的。同時(shí)，當(dāng)CO2濃度由400 μatm升高到2000 μatm時(shí)，鈣化赫氏顆石藻和鈣化大洋球藻在第7天的鈣化率分別下降35.4%和68.9%(圖7)。相比大洋球藻，赫氏顆石藻更容易受海洋酸化的影響，從而導(dǎo)致生態(tài)不平衡的因素。但對(duì)于實(shí)驗(yàn)中所用的非鈣化種，由于失去了表面覆蓋的鈣化外殼，PIC的產(chǎn)量幾乎可以忽略不計(jì)。

最近各種生物體的研究顯示，鈣化很大程度上是由飽和碳酸鈣而不是單靠pH值控制(Langer, 2006; Trimborn, 2007)。海水中的飽和碳酸鈣由(DIC)和pH值共同控制(Iglesias-Rodriguez, 2008)。當(dāng)表層海水過(guò)飽和碳酸鈣由于海洋酸化或其他自然過(guò)程條件下飽和程度下降時(shí)，分布在貝殼和骨骼中的碳酸鹽礦物開(kāi)始溶解(Feely, 2009)。該研究表明，當(dāng)CO2濃度由400 μatm升高到2000 μatm，鈣離子的飽和度降低，但依然處于溶解發(fā)生的閾值。結(jié)果明確表明，與對(duì)照組相比，PIC的產(chǎn)量(鈣化效率)最終有所下降(圖7)。

Langer等(2009)的研究結(jié)果也出現(xiàn)同樣的現(xiàn)象，雖然鈣離子的飽和度大于1，但顆粒無(wú)機(jī)碳的溶解仍然發(fā)生。為了解釋這一現(xiàn)象，我們發(fā)現(xiàn)400 μatm和2000 μatm CO2在第7天的pH值介于8.81~7.62之間(表1和圖1)，并且與空白對(duì)照相比，細(xì)胞的生理狀態(tài)和pH值有一定的變化。這些變化影響了藻細(xì)胞的光合作用，這意味著顆石藻細(xì)胞不完全適應(yīng)改變后的pH條件。Bach等(2011)認(rèn)為，鈣化作用對(duì)pH值降低具有特異性反應(yīng)。在CO2升高的情況下，顆石藻的鈣化作用是一個(gè)嚴(yán)格控制的生物進(jìn)程(Mackinder, 2010)，將受到pH水平下降的影響。

最近，大量的生理和分子研究證據(jù)表明，當(dāng)使用HCO3–進(jìn)行鈣化作用(產(chǎn)生H+，并保持細(xì)胞pH穩(wěn)態(tài)接近中性)時(shí)，H+必須通過(guò)膜離子通道被清除(Suffrian, 2011; Taylor, 2011)或者在顆石藻細(xì)胞中被總和(Fabry, 2008; Rokitta, 2012; Stojkovic, 2013)。為了維持合適的跨質(zhì)膜電位差和H+射流，H+輸運(yùn)過(guò)程中需要能量(Raven, 2011)。當(dāng)CO2升高導(dǎo)致水體pH值和/或[CO32-]水平降低時(shí)，單位鈣化輸入的能量可能更大，從而導(dǎo)致鈣化率降低(Raven, 2011; Beaufort, 2011)。通過(guò)研究CO2增加對(duì)顆石藻鈣化的不利影響，顆石藻的鈣化作用與生物地球化學(xué)循環(huán)密切相關(guān)，雖然我們對(duì)鈣化作用的降低給出了合理的解釋，但這種解釋只是事實(shí)的一小部分。目前，海洋酸化對(duì)鈣化顆石藻影響的原因仍然需要進(jìn)一步的探索。

圖7 海水酸化第7天對(duì)鈣化顆石藻的顆粒無(wú)機(jī)碳生產(chǎn)率以及顆粒無(wú)機(jī)碳與顆粒有機(jī)碳的比值的影響

本研究表明，不同顆石藻在應(yīng)對(duì)海洋酸化威脅時(shí)表現(xiàn)出了特異的生理響應(yīng)，隨著CO2濃度的逐漸增加，不同顆石藻在維持穩(wěn)定的原始狀態(tài)都發(fā)生了不同程度的改變。因此，物種分布和豐度的潛在變化可以通過(guò)海洋食物網(wǎng)的多種營(yíng)養(yǎng)水平傳遞。雖然海洋酸化對(duì)生態(tài)系統(tǒng)長(zhǎng)期影響的研究還處于起步階段，但這些結(jié)果可能指示出在海洋酸化條件下生物多樣性、營(yíng)養(yǎng)相互作用關(guān)系、生物地球化學(xué)循環(huán)和其他生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)程的變化。

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Effects of Ocean Acidification on Physiological Characteristics of Coccolithophores

HUANG Shujie1,2,3,4, XU Dong4, WANG Dongsheng4, ZHANG Xiansheng4, YE Naihao4①

(1. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 2. International Research Center for Marine Biosciences, Ministry of Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 3. Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Shanghai Ocean University, Ministry of Education, Shanghai 201306; 4. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Qingdao 266071)

Ocean acidification caused by increasing amounts of carbon dioxide has a great impact on marine organisms, especially calcified coccolithophores. However, culture experiments examining the response of coccolithophores to elevated CO2pa have mostly been based on investigations of a single strain and have yielded differences and even contradictory results from experiments between and even within species. Here, four strains of the coccolithophores, which contained naked and calcifying strains, were investigated simultaneously for the first time. Four carbon dioxide concentration gradients (400 μatm, 750 μatm, 1000 μatm, and 2000 μatm) were set up to systematically study the effects of ocean acidification on growth, photosynthesis, nitrogen source absorption, element composition and calcification efficiency of four coccolithophore species by batch aeration culture. The results did not show a uniform response from the different strains to elevated CO2concentrations up to 2000 μatm, and the naked strain(N-E) was seriously suppressed, which was in sharp contrast to the positive response of the other three algae to the different levels. On the other hand, photosynthetic parametersv/m, Y(II) and pigment show overall downward trend for all four strains, and calcification efficiency of C-E and C-G decrease 35.4% and 68.9% respectively, on the seventh day. In addition, the four coccolithophore strains of particulate organic nitrogen production show an increasing trend and the resulting POC/PON and PIC/POC declin. We determined that the responses of coccolithophores to ocean acidification are specific, and this variation may cause changes to biodiversity and other ecosystem processes in the ocean of the future.

Ocean acidification; Coccolithophores; Specific; Biodiversity

YE Naihao, E-mail: yenh@ysfri.ac.cn

* 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“藍(lán)色糧倉(cāng)科技創(chuàng)新”重點(diǎn)專項(xiàng)(2018YFD0900703; 2018YFD0901503-8)、中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(20603022019006)、青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室漁業(yè)科技青年人才計(jì)劃項(xiàng)目(2018-MFS-T01)和山東省自然科學(xué)基金(ZR2017MD025)共同資助 [This work was supported by the National Key R&D Program of China (2018YFD0900703, 2018YFD0901503-8), Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, YSFRI, CAFS (20603022019006), and Youth Talent Program Supported by Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (2018-MFS-T01), and Shandong Provincial Natural Science Foundation,?China (ZR2017MD025)]. 黃書(shū)杰，E-mail: huangshujie1221@163.com

葉乃好，研究員，E-mail: yenh@ysfri.ac.cn

2019-03-19,

2019-04-11

S917

A

2095-9869(2020)03-0011-14

10.19663/j.issn2095-9869.20190319003

http://www.yykxjz.cn/

黃書(shū)杰, 徐東, 王東升, 張現(xiàn)盛, 葉乃好. 海洋酸化對(duì)顆石藻生理特性的影響. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2020, 41(3): 11–24

Huang SJ, Xu D, Wang DS, Zhang XS, Ye NH. Effects of ocean acidification on physiological characteristics of coccolithophores. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(3): 11–24

(編輯 馮小花)