藍(lán)軍南溫久福李俊偉區(qū)又君周慧李加兒李活

四指馬鲅淋巴器官發(fā)育組織學(xué)觀察*

藍(lán)軍南1,2溫久福1李俊偉1區(qū)又君1①周 慧1李加兒1李 活3

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣州 510300；2. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心海洋動(dòng)物系統(tǒng)分類與進(jìn)化上海高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 201306；3. 茂名市金陽(yáng)熱帶海珍養(yǎng)殖有限公司 茂名 525444)

采用石蠟組織連續(xù)切片和HE染色技術(shù)，對(duì)1~60 dph (Days post hatching)四指馬鲅()的淋巴器官個(gè)體發(fā)育進(jìn)行研究，描述了淋巴器官發(fā)育特點(diǎn)及組織學(xué)特征。結(jié)果顯示，在鹽度為9.0±0.5，水溫為(28±2)℃條件下，3 dph胸腺原基出現(xiàn)，由4~6層未分化干細(xì)胞和淋巴母細(xì)胞樣的細(xì)胞組成；胸腺發(fā)育迅速，主要由淋巴細(xì)胞填充；至25 dph皮質(zhì)區(qū)和髓質(zhì)區(qū)分明顯，胸腺發(fā)育基本完成。3 dph頭腎原基形成，由前腎管和少量造血干細(xì)胞組成；5 dph胸腺淋巴細(xì)胞向頭腎遷移，頭腎開(kāi)始淋巴化；隨著魚(yú)體生長(zhǎng)，造血干細(xì)胞分化成不同類型細(xì)胞；18 dph前腎管開(kāi)始退化，至53 dph完全消失，頭腎主要由網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)支持下的淋巴造血組織構(gòu)成。7 dph脾臟原基形成，至16 dph開(kāi)始淋巴化；脾臟內(nèi)皮系統(tǒng)較頭腎發(fā)達(dá)，但其發(fā)育速度較胸腺和頭腎慢，淋巴細(xì)胞明顯少于胸腺和頭腎。研究表明，四指馬鲅淋巴器官原基出現(xiàn)及淋巴化的順序是胸腺、頭腎、脾臟。免疫淋巴器官結(jié)構(gòu)及功能尚未發(fā)育完善，可能是四指馬鲅在變態(tài)期間幼體死亡率高的主要原因之一。

四指馬鲅；淋巴器官；發(fā)育；組織學(xué)

魚(yú)類的淋巴器官主要包括胸腺、頭腎、脾臟以及黏膜相關(guān)的淋巴組織(Boehm, 2012)，黏膜相關(guān)淋巴組織包括鼻咽、內(nèi)臟、鰓和皮膚相關(guān)淋巴組織，它們通過(guò)細(xì)胞和體液介導(dǎo)途徑參與繼發(fā)性淋巴免疫反應(yīng)。胸腺是大多數(shù)魚(yú)類最早發(fā)育的中樞淋巴器官，它在魚(yú)類胚胎發(fā)育早期就已經(jīng)形成并發(fā)揮作用，胸腺為T(mén)細(xì)胞的增殖、成熟和抗原受體庫(kù)的生成提供了適宜的微環(huán)境(Nakanishi, 2015)，同時(shí)，產(chǎn)生促淋巴細(xì)胞生成素以促進(jìn)其他淋巴器官的淋巴細(xì)胞生成(Fishelson, 2006)。頭腎和脾臟是主要的免疫及造血器官，含有豐富的血管、血竇和免疫細(xì)胞(胡玲玲等, 2010)。其免疫細(xì)胞介導(dǎo)并參與免疫反應(yīng)，尤其吞噬細(xì)胞(黑色素–巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞)是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有趨化、吞噬、細(xì)胞因子分泌、抗原處理以及通過(guò)多種機(jī)制表達(dá)來(lái)清除病原體的作用(Espinosa, 2018;邢賀飛等, 2016)。免疫淋巴器官是魚(yú)類防止病原入侵的主要防線，研究免疫淋巴器官的發(fā)生發(fā)育可了解機(jī)體免疫活性建立的時(shí)間節(jié)點(diǎn)，對(duì)優(yōu)化養(yǎng)殖條件、完善苗種培育和健康養(yǎng)殖技術(shù)具有重要意義(Campoverde, 2019)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外越來(lái)越多的學(xué)者針對(duì)魚(yú)類免疫淋巴器官的發(fā)生發(fā)育開(kāi)展研究，如在大西洋白姑魚(yú)()、考氏鰭竺鯛()、斑馬魚(yú)()、牙鲆()、草魚(yú)()和斜帶石斑魚(yú)()等多種魚(yú)類已見(jiàn)報(bào)道(Campoverde, 2019;Fishelson, 2010; Danilova, 2004; Liu, 2004; 雷雪彬等, 2013; 吳金英等, 2003)。

四指馬鲅()俗稱馬友、午魚(yú)、午筍等，通常分布于熱帶和溫帶海區(qū)，主要分布于印度洋和太平洋西部，在我國(guó)黃海、東海、南海和渤海均有分布(Moore, 2011; Wang, 2014)。其肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，具有良好的養(yǎng)殖前景。2012年我國(guó)規(guī)?；斯し庇宛B(yǎng)殖四指馬鲅屬魚(yú)類獲得成功，近年來(lái)先后在廣東、海南、福建、廣西、上海、江蘇、山東、浙江、河北等沿海地區(qū)開(kāi)展了養(yǎng)殖技術(shù)推廣應(yīng)用，四指馬鲅已成為海水魚(yú)類養(yǎng)殖的新品種(林先智等, 2015)。目前，四指馬鲅苗種培育和養(yǎng)殖技術(shù)已經(jīng)成功，但在仔稚魚(yú)變態(tài)發(fā)育階段常出現(xiàn)大量死亡現(xiàn)象，同時(shí)，在成魚(yú)養(yǎng)殖過(guò)程中對(duì)應(yīng)激反應(yīng)比較敏感，容易因手工操作受傷死亡，其中原因需要進(jìn)一步研究(劉奇奇等, 2017)。魚(yú)類淋巴器官對(duì)病害具有重要的免疫作用，關(guān)于四指馬鲅淋巴器官發(fā)生發(fā)育的研究目前在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用石蠟組織連續(xù)切片和HE染色技術(shù)對(duì)人工培育的四指馬鲅淋巴器官發(fā)育進(jìn)行研究，試從免疫器官發(fā)育的角度推測(cè)機(jī)體免疫活性建立的時(shí)間，并觀察淋巴器官發(fā)育過(guò)程中組織形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，以豐富四指馬鲅的基礎(chǔ)生物學(xué)資料，為其苗種培育和成魚(yú)健康養(yǎng)殖提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用的四指馬鲅仔稚魚(yú)為2018年6~9月在中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所珠海試驗(yàn)基地培育所得。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

魚(yú)苗孵化及培育參考區(qū)又君等(2017)的方法進(jìn)行。孵化后2 dph (Days post hatching, dph)將魚(yú)苗置于1000 L白色塑料桶中培育，放苗前，水桶中預(yù)先接種小球藻和輪蟲(chóng)，每天添加淡水降低鹽度0.5~1，直到鹽度降至9.0±0.5。培育水溫為(28±2)℃。7 dph投喂枝角類和橈足類幼體，25 dph起投喂鹵蟲(chóng)無(wú)節(jié)幼體，30 dph起投喂粉狀配合飼料并逐漸過(guò)渡到人工顆粒飼料。1~ 18 dph，每天取樣1次；20~45 dph，每5 d取樣1次；45~ 60 dph，每7 d取樣1次，每次取15尾。取樣時(shí)，記錄魚(yú)苗日齡，并用數(shù)顯游標(biāo)卡尺(精確度0.01 mm)測(cè)量全長(zhǎng)，置于4%多聚甲醛中固定，24 h后轉(zhuǎn)入70%的乙醇中保存。參考馬定昌等(2014)的方法并稍作調(diào)整，將固定好的樣品進(jìn)行流水沖洗12 h，經(jīng)50%～100%梯度乙醇脫水(50%乙醇2 h、70%乙醇4 h、80%乙醇2 h、85%乙醇2 h、95%乙醇45 min×2、100%乙醇45 min×2)，二甲苯透明(1/2無(wú)水乙醇+1/2二甲苯混合液1 h、二甲苯15 min×2)，浸蠟(石蠟2 h×2)，石蠟包埋，以4~6 μm的厚度進(jìn)行縱向連續(xù)切片，蘇木精?伊紅(HE)染色，中性樹(shù)脂封片，在ZEISS Axio Scope. A1型光學(xué)顯微鏡(德國(guó))下觀察并攝影記錄。

2 結(jié)果

2.1 胸腺

3 dph，胸腺原基開(kāi)始形成，位于鰓蓋骨背上角處，由4~6層未分化干細(xì)胞和淋巴母細(xì)胞樣的細(xì)胞組成，細(xì)胞較大，圓形或橢圓形，嗜堿性，核大且深染，原基外緣上皮鞘尚未形成(圖1A)。6 dph，胸腺個(gè)體增大，呈長(zhǎng)橢圓形，胸腺細(xì)胞增多，染色加深，出現(xiàn)小淋巴細(xì)胞，呈紫紅色，上皮鞘形成(圖1B)。18 dph，胸腺外包結(jié)締組織被膜，淋巴細(xì)胞增多，密度增大 (圖1C)。20 dph，結(jié)締組織開(kāi)始向胸腺實(shí)質(zhì)伸展把腺體分成若干小葉，小葉間結(jié)締組織形成的小梁將其分成數(shù)個(gè)小結(jié)(圖1D)。25 dph，胸腺與頭腎有結(jié)締組織連接(圖1E)，胸腺分區(qū)明顯，皮質(zhì)區(qū)位于胸腺外層，淋巴細(xì)胞密集，著色較深，有許多微血管分布；髓質(zhì)區(qū)位于胸腺內(nèi)層，著色較淺，淋巴細(xì)胞數(shù)量較少。胸腺小葉明顯，由于小葉間隔不明顯，小結(jié)不完全隔開(kāi)(圖1F)。胸腺主要由著色較深的淋巴母細(xì)胞和淋巴細(xì)胞所填充，偶見(jiàn)少量紅細(xì)胞。

另外，在早期發(fā)育過(guò)程中，胸腺外周有一些分散的淋巴細(xì)胞，胸腺與頭腎有細(xì)胞“橋”連接(圖2B),到發(fā)育基本完成，細(xì)胞“橋”衍變成結(jié)締組織，胸腺與頭腎獨(dú)立分開(kāi)。

A：3dph (Days post hatching)，示胸腺淋巴母細(xì)胞，400×；B：6 dph，示胸腺淋巴母細(xì)胞和小淋巴細(xì)胞，400×；C：18 dph，示胸腺淋巴細(xì)胞和結(jié)締組織被膜，200×；D：20 dph，示胸腺小葉、小梁及小結(jié)出現(xiàn)，200×；E：25 dph，示頭腎和胸腺，100×；F：25 dph，示胸腺皮質(zhì)區(qū)、髓質(zhì)區(qū)、小葉、小梁，400×；CTC：結(jié)締組織被膜；CA：皮質(zhì)區(qū)；DT：消化道；G：鰓弓；LB：淋巴母細(xì)胞；MA：髓質(zhì)區(qū)；O：耳囊；OP：鰓蓋骨；PR：頭腎；PRT：前腎管；SL：小淋巴細(xì)胞；TH：胸腺；TL：胸腺小葉；TT：胸腺小梁；TN：胸腺小結(jié)

A: 3 dph, showing lymphoblasts of the thymus, 400×; B: 6 dph, showing lymphoblasts and small lymphocytic of the thymus, 400×; C: 18 dph, showing lymphocytes and connective tissue, 200×; D: 20 dph, showing thymic lobules, trabeculae, and nodules appear, 200×; E: 25 dph, showing thymus and pronephros; F: 25 dph, showing the cortical areas, medulla areas, lobule, trabecular, 400×; CTC: Connective tissue; CA: Cortical areas; DT: Digestive tract; G: Gill; LB: Lymphoblasts; MA: Medulla areas; O: Oticcapsule; OP: Operculum; PR: Pronephros; PRT: Pronephric tubules; SL: Small lymphocytic; TH: Thymus; TL: Thymic lobule; TT: Thymic trabecular; TN: Thymic nodules

2.2 頭腎

1 dph，頭腎原基尚未形成，原腎管沿脊椎直抵軀干后部，開(kāi)口于肛門(mén)。3 dph，原腎管前端分化成若干個(gè)前腎管，前腎管的管壁由單層上皮細(xì)胞組成，前腎管間有少量未分化的造血干細(xì)胞，此時(shí)頭腎原基形成(圖2A)。5 dph，前腎管由外向內(nèi)集中且管徑增大，頭腎外圍有紅色髓性細(xì)胞分布，邊緣出現(xiàn)淋巴樣組織，呈紫紅色(圖2B)。7 dph，前腎管管徑增大，管壁細(xì)胞紅色深染，細(xì)胞核偏位，腎管外緣出現(xiàn)淋巴母細(xì)胞和圓形的粒細(xì)胞，管間組織開(kāi)始填充，前腎管之間有少量紅細(xì)胞分布(圖2C)。15 dph，頭腎的淋巴細(xì)胞分化明顯，淋巴細(xì)胞逐漸增多，前腎管之間的填充細(xì)胞增多，紅細(xì)胞數(shù)量增加(圖2D)。18 dph，前腎管開(kāi)始退化，管壁細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象；淋巴細(xì)胞增多，著色加深，出現(xiàn)淋巴細(xì)胞集中區(qū)(圖2E)。20 dph，頭腎內(nèi)出現(xiàn)腎上腺，有少量圓形、紫紅色的腎上腺細(xì)胞分布，淋巴細(xì)胞集中區(qū)明顯，粒細(xì)胞增多，在腎管外緣偶見(jiàn)黃褐色的巨噬細(xì)胞(圖2F)。25 dph，大量前腎管退化，淋巴細(xì)胞比例增大，并出現(xiàn)大量嗜鉻細(xì)胞團(tuán)，呈黃褐色，分布于頭腎外緣(圖2G)。30 dph，前腎管減少，腎上腺增大，腎上腺細(xì)胞及嗜鉻細(xì)胞團(tuán)增多 (圖2H)。35 dph，頭腎中央靜脈出現(xiàn)，只有少數(shù)前腎管和退化殘留的小腎管(圖2I)。40 dph，頭腎內(nèi)部紅細(xì)胞活躍，淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞相間分布，偶見(jiàn)著色較深的淋巴細(xì)胞集中區(qū)和著色較淺粒細(xì)胞集中區(qū) (圖2J)。53 dph，前腎管完全退化，僅有少量退化后的前腎管殘留(圖2L)，靜脈腔直徑增大，內(nèi)有較多的血細(xì)胞(圖2K)，此時(shí)與成魚(yú)頭腎的組織結(jié)構(gòu)接近。頭腎外緣由被膜包圍，實(shí)質(zhì)由大量的淋巴細(xì)胞、血細(xì)胞和粒細(xì)胞填充，僅見(jiàn)少數(shù)黑色素?巨噬細(xì)胞聚集中心，淋巴細(xì)胞集中區(qū)和粒細(xì)胞集中區(qū)比較明顯，其形態(tài)很不規(guī)則。

2.3 脾臟

7 dph，脾原基出現(xiàn)，位于腸壁背側(cè)，并被胰臟組織包圍，卵圓形，由疏松的間充質(zhì)細(xì)胞索和毛細(xì)血管組成(圖3A)。16 dph，脾原基增大，梨形，內(nèi)含少量嗜堿性細(xì)胞或造血干細(xì)胞，并開(kāi)始淋巴化(圖3B)。 20 dph，脾體積增大，淋巴細(xì)胞與紅細(xì)胞相間排列，可見(jiàn)活躍的紅細(xì)胞生成；著色較深的嗜堿性細(xì)胞、成纖維細(xì)胞與紅細(xì)胞排列較疏松，成索狀結(jié)構(gòu)(圖3C)。25 dph，脾外緣由漿膜包裹，淋巴細(xì)胞密度增大，毛細(xì)血管增多，偶見(jiàn)黑色素巨噬細(xì)胞聚集中心(圖3D)。30 dph，脾臟增大，小淋巴細(xì)胞增多，巨噬細(xì)胞出現(xiàn)，黃褐色，形狀不規(guī)則；毛細(xì)血管增多，橢圓體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)(圖3E)。35 dph，黑色素巨噬細(xì)胞聚集中心數(shù)量增多，體積增大；淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞增多，著色加深，出現(xiàn)明顯的淋巴細(xì)胞集中區(qū)(圖3F)。45 dph，結(jié)締組織被膜伸入脾實(shí)質(zhì)內(nèi)形成脾小梁，脾小葉開(kāi)始形成，著色較深的白髄和著色較淺的紅髓開(kāi)始區(qū)分，紅細(xì)胞增多，巨噬細(xì)胞明顯(圖3G)。53 dph，淋巴細(xì)胞數(shù)量增加，著色加深，呈紫紅色(圖3H)，紅髓與白髄交錯(cuò)排列，脾竇較明顯(圖3I)。此時(shí)，脾組織發(fā)育基本完成，但尚未成熟，往后繼續(xù)增大，脾細(xì)胞繼續(xù)淋巴化。脾的內(nèi)皮系統(tǒng)較頭腎發(fā)達(dá)，其發(fā)育速度較胸腺和頭腎慢，淋巴細(xì)胞明顯少于胸腺和頭腎。

A：3 dph，示頭腎的造血干細(xì)胞(↑)和前腎管，400×；B：5 dph，示增大的前腎管和淋巴組織，400×；C：7 dph，示繼續(xù)增大的前腎管，管間組織，淋巴母細(xì)胞，粒細(xì)胞，紅細(xì)胞，400×；D：15 dph，示前腎管，淋巴細(xì)胞，紅細(xì)胞，400×；E：18 dph，示淋巴細(xì)胞集中區(qū)和退化的腎管，凋亡細(xì)胞，200×；F：20 dph，示腎上腺細(xì)胞，前腎管，粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，400×；G：25 dph，示大量前腎管退化(▲)，嗜鉻細(xì)胞團(tuán)，200×；H：30 dph，示前腎管，腎上腺，嗜鉻細(xì)胞團(tuán)，200×；I：35 dph，示中央靜脈，血竇，前腎管，200×；J：40 dph，示前腎管，血竇，血細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，粒細(xì)胞，400×；K：53 dph，示靜脈，400×；L：53 dph，示已退化的前腎管，400×；AC：凋亡細(xì)胞；AG：腎上腺；AGC：腎上腺細(xì)胞；ALY：淋巴細(xì)胞集中區(qū)；BC：血細(xì)胞；BS：血竇；CCM：嗜鉻細(xì)胞團(tuán)；CV：中央靜脈；DT：消化道；G：鰓弓；GA：粒細(xì)胞；IT：管間組織；LP：肝原基；LT：淋巴組織；LB：淋巴母細(xì)胞；LY：淋巴細(xì)胞；MA：巨噬細(xì)胞；ND：腎管；PR：前腎；PRT：前腎管；RBC：紅細(xì)胞；V：靜脈；VPRT：退化的前腎管

A: 3 dph, showing hematopoietic stem cells of head kidney(↑) and pronephric tubules, 400×; B: 5 dph, showing enlarged pronephric tubules and lymphatic tissue, 400×; C: 7 dph, showing pronephric tubules continues to enlarge, inter tubular tissue, lymphocytoblast, granulocytes, red blood cell, 400×; D: 15 dph, showing pronephric tubules, lymphocyte, red blood cell, 400×; E: 18 dph, showing lymphocytes accumulation, degenerated pronephric tubules and apoptotic cell, 200×; F: 20 dph, showing adrenal gland cells, pronephric tubules, granulocytes, lymphocyte, macrophage, 400×; G: 25 dph, showing a lot of pronephric tubules degenerate(▲), chromaffin cell mass, 200×; H: 30 dph, showing pronephric tubules, adrenal gland, chromaffin cell mass, 200×; I: 35 dph, showing central veins, blood sinus, pronephric tubules, 200×; J: 40 dph, showing pronephric tubules, blood sinus, blood cell, lymphocyte, granulocytes, 400×; K: 53 dph, showing vein, 400×; L: 53 dph, showing vestigial pronephric tubules, 400×; AC: Apoptotic cell; AG: Adrenal gland; AGC: Adrenal gland cells; ALY: Lymphocytes accumulation; BC: Blood cell; BS: Blood sinus; CCM: Chromaffin cell mass; CV: Central veins; DT: Digestive tract; G: Gill; GA: Granulocytes; IT: Inter tubular tissue; LP: Liver primordium; LT: Lymphoid tissue; LB: Lymphocytoblast; LY: Lymphocyte; MA: Macrophage; ND: Nephric ducts; PR: Pronephros; PRT: Pronephric tubules; RBC: Red blood cell; V: Vein; VPRT: Vestigial pronephric tubules

A：7 dph，示脾臟原基和胰臟，400×；B：16 dph，脾臟體積增大，細(xì)胞開(kāi)始淋巴化，200×；C：20 dph，示淋巴母細(xì)胞，小淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞，400×；D：25 dph，示黑色素-巨噬細(xì)胞聚集中心，漿膜，血管，200×；E：30 dph，小淋巴細(xì)胞增多，示巨噬細(xì)胞，橢圓體，200×；F：35 dph，示中央靜脈，淋巴細(xì)胞聚集區(qū)，200×；G：45 dph，示脾小梁，紅髓，白髄，200×；H：53 dph，200×；I：53 dph，示脾竇，紅髓，白髄，200×。BL：血管；E：橢圓體；IN：腸；LB：淋巴母細(xì)胞；LC：淋巴細(xì)胞聚集區(qū)；M：巨噬細(xì)胞；MC：黑色素-巨噬細(xì)胞聚集中心；PA：胰臟；RBC：紅細(xì)胞；RP：紅髓；S：胃；SE：漿膜；SP：脾臟；SL：小淋巴細(xì)胞；ST：脾小梁；SI：脾竇；V：靜脈；WP：白髄

A: 7 dph, showing the spleen primordium and pancreas, 400×; B: 16 dph, showing the spleen bulked up, and the cells began to lymphatize, 200×; C: 20 dph, showing the lymphoblast, small lymphocytes and red blood cells, 400×; D: 25 dph, showing blood vessel, melano-macrophage centers and serosa, 200×; E: 30 dph, showing small lymphocytic increase, macrophage and ellipsoid, 200×; F: 35 dph, showing central veins, lymphocyte aggregation center, 200×; G: 45 dph, showing spleen trabecular, red pulp, white pulp, 200×; H: 53 dph, 200×; I: 53 dph, showing splenic sinus, red pulp, white pulp, 200×. BL: Blood vessel;CV: Central veins; E: Ellipsoid; IN: Intestines; LB: Lymphoblast; LC: Lymphocyte aggregation center; M: Macrophage;MC: Melano-macrophage centers; PA: Pancreas; RBC: Red blood cell; RP: Red pulp; S: Stomach; SE: Serosa; SP: Spleen;SL: Small lymphocytic; ST: Spleen trabecular; SI: Splenic sinus; V: Vein; WP: White pulp

3 討論

在許多硬骨魚(yú)類發(fā)育過(guò)程中，胸腺是第一個(gè)發(fā)育成熟的淋巴器官，如斑馬魚(yú)在4 dph時(shí)，其胸腺在其他淋巴器官開(kāi)始發(fā)育之前就已經(jīng)形成(Hansen, 1998; Willett, 1999)。本研究結(jié)果顯示，四指馬鲅胸腺原基及頭腎原基均在3 dph出現(xiàn)，但胸腺原基發(fā)育較快，25 dph基本發(fā)育完成，而頭腎淋巴化速度較慢；脾臟原基則在7 dph形成，發(fā)育過(guò)程較為緩慢。四指馬鲅淋巴器官淋巴化的順序是胸腺、頭腎、脾臟，可見(jiàn)胸腺作為魚(yú)類中樞免疫器官在維系機(jī)體早期發(fā)育階段的免疫機(jī)能具有重要作用(Rauta, 2012)。這與斜帶石斑魚(yú)、軍曹魚(yú)()等海水魚(yú)類的研究結(jié)果一致(吳金英等, 2003; 蘇友祿等, 2008)。四指馬鲅的胸腺與鰓咽腔由組織被膜相隔，與咽上皮密切相關(guān)，這有利于口咽腔和鰓組織抵抗病原入侵，促進(jìn)和調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞和非淋巴細(xì)胞的相互作用，發(fā)揮免疫防御功能(Boehm, 2003)。胸腺組織結(jié)構(gòu)的分化在硬骨魚(yú)類中是高度可變的，在許多魚(yú)類中胸腺的皮質(zhì)和髓質(zhì)沒(méi)有明顯的分化(Liu, 2004)。25 dph胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)區(qū)分明顯，髓質(zhì)可以看成是一個(gè)次級(jí)淋巴器官，因?yàn)?，它可以被外源性抗原和淋巴?xì)胞所利用(Schuurman, 1997)。不同的魚(yú)類其免疫能力存在差異可能與胸腺的組織結(jié)構(gòu)特征有一定的關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)，在四指馬鲅早期發(fā)育過(guò)程中，胸腺外周有一些分散的淋巴細(xì)胞；胸腺與頭腎互相靠攏，有細(xì)胞“橋”連接。同樣，在金頭鯛()、羅非魚(yú)(spp)、虹鳉()、鰈()等魚(yú)類中也有關(guān)于胸腺與頭腎存在細(xì)胞“橋”相連的報(bào)道(Jósefsson, 1993)。 3 dph時(shí)，四指馬鲅頭腎原基中未分化的造血干細(xì)胞在形態(tài)特征與胸腺的干細(xì)胞相似，此時(shí)，胸腺和頭腎均未開(kāi)始淋巴化；5 dph時(shí)胸腺淋巴細(xì)胞有往頭腎遷移的跡象，頭腎的造血干細(xì)胞開(kāi)始分化，出現(xiàn)淋巴樣組織。這為“頭腎的淋巴細(xì)胞是從胸腺遷移而來(lái)”這一觀點(diǎn)提供佐證(Jósefsson, 1993; Bowden, 2005)。但與斜帶石斑魚(yú)(吳金英等, 2003)及卵形鯧鲹() (蔡文超等, 2012)的研究結(jié)果不盡相同，可見(jiàn)不同的魚(yú)類其頭腎淋巴細(xì)胞的起源存在差別。四指馬鲅頭腎在發(fā)育早期有較多的腎小管，隨著魚(yú)體的生長(zhǎng)，淋巴細(xì)胞增多，18 dph時(shí)腎小管開(kāi)始退化，直到53 dph腎小管才完全消失，后來(lái)主要由淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞和血細(xì)胞等填充，此時(shí)頭腎形成了具有免疫和造血功能的淋巴樣器官。這與牙鲆、斜帶石斑魚(yú)、草魚(yú)、鱖()、黃顙魚(yú)()等多種魚(yú)類的研究結(jié)果類似(吳金英等, 2003; 雷雪彬等, 2013; 田敬云等, 2005; 劉小玲等, 2009)。20 dph時(shí)頭腎開(kāi)始出現(xiàn)少量巨噬細(xì)胞和腎上腺細(xì)胞，巨噬細(xì)胞可吞噬和消滅入侵的病原體，還有助于釋放對(duì)宿主免疫應(yīng)答啟動(dòng)起重要作用的促炎細(xì)胞因子，表明此時(shí)四指馬鲅的頭腎可能開(kāi)始具有免疫防御功能(Pressley, 2005; Nayak, 2007; Fishelson, 2010)。25 dph時(shí)頭腎淋巴細(xì)胞增多，邊緣出現(xiàn)大量黃褐色或黑色的嗜鉻細(xì)胞團(tuán)，而成熟的嗜鉻細(xì)胞和腎上腺細(xì)胞可分泌兒茶酚胺類激素和皮質(zhì)類固醇激素，從而參與水鹽代謝及應(yīng)激反應(yīng)(Geven, 2017)。脾臟原基在7 dph時(shí)出現(xiàn)，淋巴化的時(shí)間最遲，30 dph時(shí)有黑色素–巨噬細(xì)胞聚集中心出現(xiàn)，往后不斷增多，因其有從循環(huán)系統(tǒng)中清除可溶性和顆粒物質(zhì)的作用，常被廣泛用作監(jiān)測(cè)水質(zhì)和魚(yú)體健康狀況的生物標(biāo)記(劉小玲等, 2009)。53 dph時(shí)紅髓與白髄相間排列，區(qū)分不明顯，此時(shí)，脾臟尚未具備強(qiáng)大的造血和免疫功能，需要繼續(xù)發(fā)育完善。在脾臟發(fā)育過(guò)程中，紅細(xì)胞較為活躍，數(shù)量明顯增長(zhǎng)，血管系統(tǒng)發(fā)達(dá)，表明脾臟具有很強(qiáng)的造血、血液過(guò)濾及儲(chǔ)存功能(區(qū)又君等, 2015)。相對(duì)于胸腺和頭腎，脾臟淋巴化過(guò)程較為緩慢，淋巴細(xì)胞也明顯少于胸腺和頭腎，可見(jiàn)脾臟在體液免疫中處于相對(duì)次要的地位(Rauta, 2012)。

對(duì)于脊椎動(dòng)物而言，免疫活性的建立依賴于免疫淋巴器官的發(fā)育成熟。研究表明，魚(yú)類淋巴細(xì)胞的出現(xiàn)并不代表其功能成熟，而淋巴細(xì)胞的功能成熟往往比淋巴器官的出現(xiàn)遲，一般要到幼魚(yú)期以后才發(fā)育完成，而免疫功能的完善則更遲(吳金英等, 2003)。此外，魚(yú)類淋巴器官的形態(tài)及功能發(fā)育受營(yíng)養(yǎng)及環(huán)境的影響較大，如環(huán)境溫度會(huì)影響胸腺形態(tài)結(jié)構(gòu)的發(fā)育以及淋巴細(xì)胞的生成(Bowden, 2005)，礦物質(zhì)缺乏(如鐵、磷、硒)會(huì)損害幼魚(yú)免疫器官的功能和結(jié)構(gòu)完整性(Guo, 2017; Chen, 2017; Lin, 2018)；擁擠應(yīng)激會(huì)對(duì)魚(yú)類的非特異性免疫反應(yīng)產(chǎn)生負(fù)面影響，增加脾臟的不適當(dāng)?shù)蛲?，使魚(yú)類更易受到病原體的侵襲，最終影響魚(yú)類的生存(Zheng, 2018)。相對(duì)其他魚(yú)類而言，四指馬鲅淋巴器官原基出現(xiàn)的時(shí)間較早，胸腺淋巴化也較迅速，但頭腎和脾臟發(fā)育較滯后。四指馬鲅從出膜經(jīng)過(guò)仔魚(yú)期、稚魚(yú)期再到幼魚(yú)期需要較長(zhǎng)的一段時(shí)間過(guò)渡。從稚魚(yú)到幼魚(yú)這一變態(tài)發(fā)育階段，魚(yú)體的形態(tài)結(jié)構(gòu)與器官的發(fā)育尚處于演變和完善過(guò)程，加上環(huán)境因子和營(yíng)養(yǎng)因素對(duì)免疫淋巴器官結(jié)構(gòu)及功能發(fā)育的影響，導(dǎo)致其免疫防御機(jī)能較弱，這可能是變態(tài)期間魚(yú)苗脆弱，容易患病，死亡率高的主要原因。針對(duì)該問(wèn)題亟待進(jìn)一步往免疫調(diào)控機(jī)制方面深入研究，這對(duì)苗種培育和成魚(yú)健康養(yǎng)殖具有重要意義。

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曾鳴：企業(yè)的在線化，包括中后臺(tái)、傳統(tǒng)供應(yīng)鏈環(huán)節(jié)的在線化，是未來(lái)很大的發(fā)展領(lǐng)域。在這個(gè)意義上，B2B肯定是有巨大的發(fā)展?jié)摿Φ摹５艺J(rèn)為不能機(jī)械地把B2C和B2B的合作割裂開(kāi)。B2C的發(fā)展會(huì)拉動(dòng)B2B市場(chǎng)的發(fā)展。B2B市場(chǎng)的發(fā)展又會(huì)推動(dòng)B2C市場(chǎng)的創(chuàng)新。這兩者會(huì)是一個(gè)波浪式的螺旋上升的過(guò)程，任何時(shí)候都有新的機(jī)會(huì)。

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Histological Observations on the Early Development of Lymphoid Organs in

LAN Junnan1,2, WEN Jiufu1, LI Junwei1, OU Youjun1①, ZHOU Hui1, LI Jiaer1，LI Huo3

(1. Key Laboratory of South China Sea Fishery Resources Exploitation &Utilization, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300; 2. Shanghai Ocean University, Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Education; National Demonstration Center for Experimental Fisheries, Science Education; Key Laboratory of Marine Animal Taxonomy and Evolution, Shanghai 201306;3. Maoming Jinyang Tropical Fish Breeding Co. Ltd, Maoming 525444)

This work focused on the histological study of the ontogeny of lymphoid organs by paraffin tissue sections and HE staining techniques in, from 1 to 60 dph (day post hatching). The results showed that in the conditions of salinity 9.0±0.5 and water temperature (28±2)℃, thymus primordium appears at 3 dph that composed of 4~6 layers of undifferentiated stem cells and lymphocyte-like cells; thymus differentiated rapidly and mainly filled with lymphocytes; at 25 dph, the cortex and medulla are clearly distinguished and thymus development was basically completed. Similarly, the head kidney primordium formed at 3 dph, it consists of pronephric tubules and a few of hematopoietic stem cells; at 5 dph, the head kidney began to lymphatize when the thymic lymphocytes migrate there, and hematopoietic stem cells differentiated into different types of cells as the fish grew; at 18 dph, pronephric tubules began to degenerate and disappeared completely until 53 dph, when the head kidney is mainly composed of lymphopoietic tissue supported by reticular endothelial system. At 7 dph, the spleen primordium appears and begins to lymphatize obviously until 16 dph. The endothelial system of spleen is more developed than that of head kidney, but its development speed is significantly slower than thymus and head kidney, and lymphocytes are less than in the thymus and head kidney. These observations suggested that the respective lymphoid organs primordium becomes the thymus, head kidney and spleen successively. The structure and function of the lymphatic organs inhave not been fully developed and maybe one of the main causes of high mortality during the metamorphosis period. This study is of great significance for optimizing breeding conditions, improving juvenile cultivation and healthy aquaculture technology.

; Lymphoid organs; Development; Histology

Q954.6

A

2095-9869(2020)03-0070-08

10.19663/j.issn2095-9869.20190314003

區(qū)又君，研究員，E-mail: ouyoujun@126.com

2019-03-14,

2019-04-03

* 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“藍(lán)色糧倉(cāng)科技創(chuàng)新”重點(diǎn)專項(xiàng)(2018YFD0900200)、廣東省“揚(yáng)帆計(jì)劃”引進(jìn)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2016YT03H038)、廣東省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2017B020204002)和廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(海水魚(yú)產(chǎn)業(yè))創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)專項(xiàng)資金(2019KJ143)共同資助 [This work was supported by Special Fund for "Blue Granary Science and Technology Innovation" of National Key Research and Development Program (2018YFD0900200), Guangdong “Yang Fan” Innovative & Entrepreneurial Research Team Program (2016YT03H038), Provincial Science and Technology Project of Guangdong Province (2017B020204002), and Guangdong Provincial Special Fund For Modern Agriculture Industry Technology (Marine Fish Industry) Innovation Teams(2019KJ143)]. 藍(lán)軍南，E-mail: ljn009@126.com

http://www.yykxjz.cn/

藍(lán)軍南, 溫久福, 李俊偉, 區(qū)又君, 周慧, 李加兒, 李活. 四指馬鲅淋巴器官發(fā)育組織學(xué)觀察. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2020, 41(3): 70–77

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OU Youjun, E-mail: ouyoujun@126.com

(編輯 馬璀艷)