張皓然 門燕娟 徐鳳 陳全剛

摘?要：GC33是一種重組的全人源化單克隆抗體，可與磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3，GPC3）結(jié)合。為構(gòu)建人源化GPC3抗體的CAR-T細(xì)胞，試驗選擇已有的GC33單鏈抗體序列成功構(gòu)建了人源化GPC3-CAR分子，即GC33-CAR分子，并通過Western Blot對該CAR的表達(dá)進(jìn)行驗證，通過免疫熒光檢查CAR的細(xì)胞定位。結(jié)果表明：GCC33-CAR分子能在T細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)且且該CAR表達(dá)后可被定位于細(xì)胞膜上。CAR-T細(xì)胞中CAR的人源化有望提升其治療效果，本研究為下一步的臨床研究提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：嵌合抗原受體細(xì)胞;肝細(xì)胞肝癌;人源化;磷脂同醇蛋白聚糖-3

引言

肝細(xì)胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）目前是世界第5大腫瘤，也是癌癥致死的第3大因素。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3，GPC3）是一種硫酸乙酰肝素糖蛋白（heparin sulfate proteoglycans，HSPGs），在大多數(shù)的肝癌組織中呈特異性高表達(dá)，是一種較為理想的腫瘤治療靶點。以GPC3為靶點治療肝細(xì)胞癌的研究廣泛開展，目前利用GPC3-CAR-T細(xì)胞治療晚期肝細(xì)胞癌的Ⅰ期臨床試驗已正式啟動（受理號：CXSL 1700203）。相關(guān)研究表明，鼠源scFV序列的免疫原性會導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)無法活化及持續(xù)存在。在卵巢癌及腎細(xì)胞癌的治療過程中，針對鼠源scFV制備的CAR-T細(xì)胞的免疫應(yīng)答導(dǎo)致了CAR-T細(xì)胞在輸入患者體內(nèi)后很快耗竭，持久性差，影響了治療效果。GC33是一種重組的可與GPC3結(jié)合的全人源化單克隆抗體，一期臨床試驗結(jié)果顯示GC33在HCC中有良好的耐受性，且與靶向GPC3的抗體相比喪失了對人類的免疫原性，因此，本研究構(gòu)建了GC33-CAR-T細(xì)胞并對其進(jìn)行了初步驗證，為其后期應(yīng)用于臨床治療奠定了基礎(chǔ)。

1 材料

293T細(xì)胞為本實驗室保存。RPM11640，DMEM，100x青霉素/鏈霉素，胎牛血清（GIBCO，美國），DNA聚合酶，DNA Maker，蛋白Maker，淋巴細(xì)胞分離液（GE，美國），抗人CD3抗體（eBio-science，美國），IL-2（PeproTech，美國），生物素標(biāo)記的羊抗人IgG、HRP羊抗小鼠的二抗（Jackson，美國）。

2 方法

2.1 人源化GPC3抗體的構(gòu)建

選擇已有的靶向GPC3的單鏈抗體序列GC33作為胞外區(qū)，CD8α作為鉸鏈區(qū)，CD28的跨膜結(jié)構(gòu)域作為跨膜區(qū)，CD3ζ和共刺激分子CD28、CD137組成傳導(dǎo)信號的胞內(nèi)信號區(qū)，通過基因合成上述序列，并插入至pRRL慢病毒載體，共同組成可以穩(wěn)定表達(dá)于T細(xì)胞上的GC33-CAR分子。

2.2?攜帶人源化GPC3-CAR慢病毒的制備

使用分子克隆技術(shù)按上述設(shè)計將識別GPC3抗原的單鏈抗體GC33與共刺激分子CD28、CD137和CD3ζ鏈的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域進(jìn)行基因重組，隨后通過人工合成和拼接技術(shù)，獲得靶向GPC3抗原的GC33-CAR基因片段。以XbaⅠ和BamHⅠ限制性酶切位點為克隆位點，利用亞克隆技術(shù)將GCC33-CAR基因片段插入慢病毒表達(dá)載體中，最終獲得攜帶GCC33-CAR基因片段的慢病毒表達(dá)載體pRRL-GC33-CAR。同時構(gòu)建不含單鏈抗體區(qū)段的對照pRRL-control-CAR。293T細(xì)胞匯合度70%～80%時用更換含10%胎牛血清的DMEM新鮮培養(yǎng)基。將構(gòu)建的慢病毒包裝質(zhì)粒及輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)16 h后棄掉上清液并加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后熒光顯微鏡觀察綠色熒光的發(fā)光情況，48 h后收取上清液，于4℃條件下12000×g離心20 min，0.45 μm濾器過濾后用1.5 mlEP管分裝后-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.3?人外周血單核細(xì)胞（PBMC）的制備及人源化GPC3-CAR慢病毒感染T細(xì)胞。

抽取健康志愿者外周血，經(jīng)Ficoll-hypaque（葡聚糖-泛影葡胺）密度梯度離心法獲取單個核細(xì)胞（PBMC）后用培養(yǎng)基重懸。將細(xì)胞接種于6孔板中，加人IL-2和抗CD3抗體，置于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)過夜，觀察PBMC狀態(tài)，加入攜帶人源化GC33 CAR的重組慢病毒、對照病毒及聚凝胺。感染后的T細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)后離心，吸棄1/2上清，再加入等量的新鮮培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況，確定大部分PBMC被慢病毒感染，即為CAR-T細(xì)胞或?qū)φ誘細(xì)胞。

2.4?Western blot檢測GPC3-CAR分子在T細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

將上述收集的GC33-CAR-T細(xì)胞、未轉(zhuǎn)染的T細(xì)胞分別加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，將提取的蛋白經(jīng)10%的SDS-PAGE進(jìn)行分離后，恒流轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，并用5%的脫脂奶粉封閉，孵育Flag蛋白以及β-actin抗體4℃孵育過夜。用PBST洗滌3遍，每次5min，用HRP羊抗小鼠的二抗（1：2500）室溫孵育1 h。加人顯色劑化學(xué)發(fā)光后用印記顯影系統(tǒng)采集圖像。

3. 結(jié)果

3.1 高親和力人源化GPC3 scFv的構(gòu)建。

將已有的靶向GPC3的單鏈抗體序列GC33，CD8α鉸鏈區(qū)，CD28，CD38鏈和共刺激分子CD28、CD137，通過連接鏈將這些結(jié)構(gòu)串聯(lián)在一起，構(gòu)建可以穩(wěn)定表達(dá)于T細(xì)胞上的GC33-CAR分子（圖1）。

3.2 慢病毒包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率鑒定

將構(gòu)建的的慢病毒包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，通過熒光顯微鏡觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率，從而確定病毒包裝情況。結(jié)果顯示，90%以上細(xì)胞呈現(xiàn)GFP陽性。

3.3?GC33-CAR分子在CAR-T細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。

包裝好的慢病毒分別侵染人T細(xì)胞，并添加IL-2促進(jìn)T細(xì)胞增殖。72 h后通過Western Blot檢測各CAR的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在Control-CAR-T中可同時檢測到內(nèi)源性CD3ζ和大小在40 KD左右的對照CAR條帶;而在GC33-CAR-T細(xì)胞中可見內(nèi)源性CD3ζ和分子質(zhì)量約55 kD的GC33 CAR的表達(dá)。提示構(gòu)建的CAR可成功在T細(xì)胞中表達(dá)。

3.4?CAR的亞細(xì)胞定位鑒定

使用包裝好的Control-CAR及GC33-CAR慢病毒感染Hela細(xì)胞，通過使用myc抗體檢測CAR的亞細(xì)胞定位情況，結(jié)果顯示，Control-CAR及GC33-CAR均呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞膜定位。

結(jié)論

本研究利用已知的GC33 scFv與其他序列連接構(gòu)建出人源化CAR結(jié)構(gòu)。經(jīng)慢病毒包裝、感染，從而獲得了GC33-CAR-T細(xì)胞。并通過Western Blot證實了該CAR可成功在T細(xì)胞中表達(dá)，通過免疫熒光證實表達(dá)的CAR具有細(xì)胞膜定位的特性，進(jìn)而成功構(gòu)建了靶向GPC3的人源化CAR-T細(xì)胞的構(gòu)建，為肝細(xì)胞癌的CAR-T治療提供了新的可行性手段。

參考文獻(xiàn)

[1]?謝春梅、徐偉文，GPC-3在肝癌診治中的價值及存在的問題，分子診斷與治療雜志2016.1第八卷第一期。

[2]?戴順志.人源化單抗在初期臨床試驗中能解決某些免疫原性問題[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，1992（01）：83-84.