蔣湘媛，楊大偉，張立強，郭凡溪, 李穎, 余祖功*

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2. 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；3. 寧夏農(nóng)墾賀蘭山奶業(yè)有限公司，寧夏 銀川 750001)

奶牛乳房炎是乳業(yè)生產(chǎn)中最常見的疾病之一，會致牛奶產(chǎn)量和品質(zhì)下降，造成巨大的經(jīng)濟損失[1]。細菌感染是主要病因之一，其中約30%的乳房炎與金黃色葡萄球菌(金葡菌)感染有關(guān)[2]。防治以乳房注入抗菌藥物為主。其中干奶期預(yù)防，每乳區(qū)注入1～2次，維持整個干奶期(60～65 d)；泌乳期治療，療程往往3～6 d或更長，棄奶期常需4～9 d，仍難以有效清除病原菌[3]。有研究顯示金葡菌能夠形成生物被膜，可逃逸抗菌藥物的抑殺[1]。

金葡菌生物被膜是由金葡菌和其產(chǎn)生的胞外基質(zhì)形成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，胞外基質(zhì)包括多糖細胞間黏附素(polysaccharide intracellular adhesin, PIA)、細胞外DNA(extracellular DNA，eDNA)和蛋白質(zhì)，可黏附于生物和非生物表面，一方面保護細菌免受抗生素殺滅，產(chǎn)生耐藥性，另一方面又相當于“細菌庫”長期不斷釋放細菌，致感染遷延為慢性[1]。有研究表明，亞抑菌濃度抗菌藥物與細菌長期接觸，能夠促進或抑制生物被膜形成，如β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類等[4]。利福昔明屬于利福霉素類抗生素，抗菌譜廣，抗菌作用強，已批準于干奶期應(yīng)用防治奶牛乳房炎[5]。利福昔明乳房注入后，長期存留于乳區(qū)中，存在以亞抑菌濃度與細菌長期接觸的可能，是否對病原菌生物被膜的形成有促進或抑制作用，尚未見報道，值得研究。

植物精油是由植物的揮發(fā)性次代謝物和芳香物質(zhì)等組成的多組分天然混合物，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、或免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[6]。Hemaiswarya等[7]發(fā)現(xiàn)植物精油與氨芐西林、紅霉素、諾氟沙星等多種抗菌藥物有協(xié)同殺菌作用。食品工業(yè)與醫(yī)藥臨床均發(fā)現(xiàn)精油有阻抑細菌生物被膜形成的作用[8-9]。因此，本試驗測定了利福昔明與精油單獨、聯(lián)合對金葡菌的抑菌活性，并初步研究了兩者單獨和聯(lián)合對強成膜菌株生物被膜形成的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

利福昔明對照品，購自中國食品藥品檢定研究院，批號為130542-200601；3種精油：薄荷油、桉葉油和魚腥草油，購自吉水華源香精有限公司；水解酪蛋白(MH)肉湯培養(yǎng)基，胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基，瓊脂糖購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；結(jié)晶紫、甲醇、冰醋酸、PBS、葡萄糖等試劑均為分析純。

1.2 菌株

金葡菌ATCC29213；9株金葡菌臨床分離株，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)藥理學(xué)和毒理學(xué)實驗室從乳房炎患牛乳汁中分離、鑒定并保存。

1.3 藥品貯備液的制備

利福昔明溶液的配制：精密稱取利福昔明適量，用甲醇溶解，配成25 mL濃度為1 280 μg·mL-1的藥液，過濾分裝，保存于-20 ℃冰箱。

精油溶液的配制：精油、乙醇和吐溫-80以體積比例2∶1∶1配比溶解，配置得到50%的精油溶液，過濾分裝，常溫保存。

1.4 菌液制備

將凍存的菌株接種于5 mL TSB培養(yǎng)基復(fù)蘇后，接種劃線于胰蛋白胨大豆固體(TSA)培養(yǎng)基，置37 ℃過夜培養(yǎng)；挑取平板上的單菌落接種于3 mL TSB培養(yǎng)基中，置37 ℃搖床震蕩孵育10～12 h，用MH肉湯稀釋菌液使其OD595 nm約為0.1，即菌液濃度為1×108CFU/mL，再用MH肉湯或TSB-g培養(yǎng)基(添加1%葡萄糖的TSB)倍比稀釋菌液至得所需濃度。

1.5 利福昔明和精油對金葡菌最低抑菌濃度(MIC)的測定

用MH肉湯將藥液稀釋至所需濃度，加200 μL至第1列，無菌96孔板第2～11列加入MH肉湯100 μL，逐次倍比稀釋得系列梯度濃度藥液；將菌液用MH肉湯稀釋100倍，第1～11列加入稀釋完成的菌液100 μL；第12列前4孔每孔加入200 μL MH肉湯為陰性對照，后4孔每孔加入200 μL菌液為陽性對照。每個菌設(shè)置2個平行。培養(yǎng)板置于37 ℃培養(yǎng)18～22 h，觀察結(jié)果。陰性對照孔無菌生長，陽性對照孔生長良好，試驗有效；試驗孔中細菌生長程度與陽性對照孔進行對比，能夠明顯抑制細菌生長的最小藥物濃度定為MIC。試驗重復(fù)3次。

1.6 利福昔明和精油聯(lián)合的藥敏試驗

將利福昔明和精油用MH肉湯稀釋至8倍MIC(8 MIC)，并分別在2塊96孔板中倍比稀釋得到8、4、2、1、1/2、1/4 MIC的藥液。取其中1塊96孔板，第1～6排的第1加入50 μL的8、4、2、1、1/2、1/4 MIC的利福昔明，第1～6列的1～6孔加入50 μL的8、4、2、1、1/2、1/4 MIC的精油；將菌液用MH肉湯稀釋100倍，第1～6列加入稀釋完成的菌液100 μL；最終藥液濃度梯度為2、1、1/2、1/4、1/8、1/16 MIC；第7行每孔加入200 μL滅菌MH肉湯為陰性對照，第8行每孔加入200 μL菌液為陽性對照。每個菌設(shè)置3個平行。培養(yǎng)板置于37 ℃培養(yǎng)18～22 h，觀察結(jié)果，并計算聯(lián)合抑菌指數(shù)(FICI)。精油聯(lián)合MIC為精油與利福昔明聯(lián)合時精油的MIC值，利福昔明聯(lián)合MIC亦是。FICI =精油聯(lián)合MIC/單獨MIC + 利福昔明聯(lián)合MIC/單獨MIC。結(jié)果判斷: FICI≤0.5為協(xié)同；0.52為拮抗。試驗重復(fù)3次。

1.7 利福昔明和精油對金葡菌的最低抑膜濃度(MBIC)測定

無菌96孔板最外圍加入滅菌的TSB-g培養(yǎng)基200 μL封閉。用滅菌的TSB-g培養(yǎng)基將藥液稀釋至所需濃度，加200 μL至第2列，無菌96孔板第2～9列加入TSB-g培養(yǎng)基100 μL，逐次倍比稀釋得系列梯度濃度藥液；將菌液用TSB-g培養(yǎng)基稀釋10倍，第2～9列加入稀釋完成的菌液100 μL；第10列每孔加入200 μL滅菌TSB-g培養(yǎng)基為陰性對照，第11列每孔加入200 μL菌液為陽性對照。每個菌設(shè)置3個平行。培養(yǎng)板置于37 ℃培養(yǎng)48 h。

棄去懸浮液，PBS輕柔地洗2次，加入200 μL甲醇將被膜固定10 min。棄去甲醇，干燥，加入200 μL 0.1%的結(jié)晶紫染色5 min，棄去染色液，PBS輕柔地洗2次，干燥。加入200 μL 33%乙酸，振搖10 min，測定OD595 nm。試驗孔中OD595 nm值與陰性對照孔OD595 nm值一致的最低藥物濃度定為MBIC。試驗重復(fù)3次。

1.8 利福昔明和薄荷油單獨應(yīng)用對生物被膜形成的影響

因薄荷油的抑菌效果和與利福昔明的聯(lián)合效果最好，故采用薄荷油與利福昔明進行生物被膜的抑制試驗。結(jié)晶紫染色試驗顯示，菌株S.a-2的OD595 nm大于其他菌株，且大于陰性對照OD595 nm的4倍，判定為強成膜株，故選其進行生物被膜影響試驗。

無菌96孔板最外圍加入TSB-g培養(yǎng)基200 μL封閉。將精油用滅菌的TSB-g培養(yǎng)基稀釋至MIC，加100 μL至第2列，無菌96孔板第2～5列加入TSB-g培養(yǎng)基100 μL，逐次倍比稀釋的系列梯度濃度藥液；第6列加入1 MIC利福昔明100 μL；將菌液用滅菌的TSB-g培養(yǎng)基稀釋10倍，第2～6列加入稀釋完成的菌液100 μL；第7列每孔加入200 μL TSB-g培養(yǎng)基為陰性對照，第8列每孔加入200 μL菌液為無藥對照。每個菌株各3個平行。培養(yǎng)板置于37 ℃培養(yǎng)48 h，結(jié)晶紫染色觀察結(jié)果。設(shè)置3個復(fù)孔，試驗重復(fù)3次。抑制率=(試驗組OD-陰性對照組OD)/(無藥對照組OD-陰性對照組OD)×100%。

1.9 利福昔明和薄荷油聯(lián)合應(yīng)用對生物被膜形成的影響

無菌96孔板最外圍加入滅菌的TSB-g培養(yǎng)基200 μL封閉。將精油用滅菌的TSB-g培養(yǎng)基稀釋至4 MIC，加200 μL至第2列，無菌96孔板第2～5列加入TSB-g培養(yǎng)基50 μL，逐次倍比稀釋的系列梯度濃度藥液；第2～5列加入2 MIC利福昔明50 μL；將菌液用滅菌的TSB-g培養(yǎng)基稀釋10倍，第2～5列加入稀釋完成的菌液100 μL；第7列每孔加入200 μL TSB-g培養(yǎng)基為陰性對照，第8列每孔加入200 μL菌液為無藥對照。培養(yǎng)板置于37 ℃培養(yǎng)48 h，結(jié)晶紫染色觀察結(jié)果。設(shè)置3個復(fù)孔，試驗重復(fù)3次。

1.10 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析由SPSS 19.0進行，采用單因素方差分析(ANOVA)檢驗差異。數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標準差”形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 利福昔明和精油對浮游菌的抑制作用

利福昔明和精油對9株金葡菌的MIC見表1，利福昔明和精油的聯(lián)合抑菌作用見表2。桉葉油對金葡菌的MIC為0.63%～5.00%。魚腥草油對菌株S.a-3的MIC大于5.00%，對其他金葡菌的MIC為1.25%～5.00%。薄荷油對金葡菌的MIC為0.16%～2.50%。利福昔明對金葡菌的MIC為0.016～4.00 μg·mL-1。薄荷油和利福昔明聯(lián)合顯示相加作用，桉葉油和魚腥草油與利福昔明顯示無關(guān)聯(lián)作用。3種精油中薄荷油的抑菌效果最強，且和利福昔明聯(lián)合效果最好。

表1 利福昔明和精油對金葡菌MIC的測定結(jié)果

菌株桉葉油/%魚腥草油/%薄荷油/%利福昔明/(μg·mL-1)S.a-11.255.001.250.03S.a-22.501.250.160.03S.a-35.00>5.002.500.03S.a-45.005.001.250.016S.a-50.635.002.500.03S.a-61.255.000.634.00S.a-75.002.501.250.03S.a-82.502.500.310.03S.a-92.502.500.160.016

2.2 薄荷油與利福昔明對金葡菌的MBIC

MBIC結(jié)果見表3，桉葉油和魚腥草油的抑膜效果較差，桉葉油5株對金葡菌的MBIC高于5.00%，魚腥草油對9株金葡菌的MBIC均大于等于5.00%。薄荷油對于生物被膜的抑制作用較好，MBIC為0.31%～5.00%，4～8號菌株的MBIC/MIC值均為1，而其他精油對于這5株菌的部分MBIC/MIC值可達2～4倍。利福昔明對金葡菌的MBIC為0.06～8.00 μg·mL-1，利福昔明對菌株的MBIC/MIC值多為2或4。利福昔明和薄荷油對菌株S.a-9的MBIC/MIC值最高，均為8。

表2 利福昔明和精油對金葡菌菌株S.a-2號的聯(lián)合藥敏試驗結(jié)果

A藥單獨MIC/(μg·mL-1)聯(lián)合MIC/(μg·mL-1)倍數(shù)B藥單獨MIC/%聯(lián)合MIC/%倍數(shù)FICI作用利福昔明0.0310.0311桉葉油2.501.250.51.50無關(guān)0.0080.25魚腥草油1.251.2511.25無關(guān)0.0080.25薄荷油0.160.080.50.75相加

注：聯(lián)合MIC指A藥與B藥聯(lián)合用藥的MIC；倍數(shù)=聯(lián)合MIC/單獨MIC。

表3 利福昔明和精油對金葡菌MBIC的測定結(jié)果

菌株桉葉油/%魚腥草油/%薄荷油/%利福昔明/(μg·mL-1)S.a-12.505.005.000.06S.a-21.255.000.630.06S.a-3>5.00>5.005.000.06S.a-4>5.00>5.001.250.06S.a-52.50>5.002.500.13S.a-62.50>5.000.638.00S.a-7>5.00>5.001.250.13S.a-8>5.005.000.310.03S.a-9>5.00>5.001.250.13

2.3 薄荷油與利福昔明單獨和聯(lián)合對生物被膜形成的影響

亞抑菌濃度的薄荷油與1/2 MIC的利福昔明單獨和聯(lián)合對菌株S.a-2被膜形成的影響通過結(jié)晶紫染色測定，結(jié)果如圖1。結(jié)果顯示，與無藥對照組相比，利福昔明與薄荷油單獨和聯(lián)合作用時對被膜形成的抑制作用均顯示差異極顯著(P<0.01)。1/2 MIC利福昔明對生物被膜的抑制率為40%；1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC的薄荷油對于生物被膜的抑制率分別為61%、53%、37%、41%。

無藥對照組的抑制率為0。**表示與1/2 MIC利福昔明組相比差異極顯著(P<0.01)；#表示與同濃度薄荷油組相比差異顯著(P<0.05)，##表示差異極顯著(P<0.01)

圖1 利福昔明與薄荷油單獨和聯(lián)合對金葡菌生物被膜形成的影響

1/2 MIC、1/8 MIC的薄荷油與利福昔明聯(lián)合對菌株S.a-2生物被膜形成的抑制率為90%和51%，極顯著高于1/2 MIC、1/8 MIC薄荷油組及利福昔明組(P<0.01)。1/4 MIC薄荷油與利福昔明聯(lián)合的抑制率為62%，極顯著高于利福昔明組(P<0.01)，顯著高于1/4 MIC薄荷油組(P<0.05)；1/16 MIC的薄荷油與利福昔明聯(lián)合的抑制率為44%，與1/16 MIC薄荷油組及利福昔明組差異不顯著(P>0.05)。

3 討論

利福昔明作用機制為不可逆與RNA聚合酶β-亞單位結(jié)合，抑制細菌RNA合成，達到殺菌目的[10]。本試驗中，利福昔明對大部分奶牛乳房炎源金葡菌的MIC與其對標準株的MIC相近，僅對6號菌除外，其MIC達4.00 μg·mL-1，表明利福昔明對乳房炎源金葡菌有較強的體外抗菌活性。

精油具有強疏水性，可作用于細菌的細胞膜或線粒體膜結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)成分，改變膜滲透性，導(dǎo)致細胞內(nèi)物質(zhì)的漏出，是其抗菌機制之一[6]。李鳳清[11]報道桉葉油和薄荷油對金葡菌MIC范圍為1.49%和2.97%。Hacioglu等[12]發(fā)現(xiàn)薄荷草藥對耐甲氧西林金葡菌的MIC為0.62%。對于本試驗中乳房炎源臨床分離株而言，薄荷油作用強于桉葉油和魚腥草油，MIC范圍分別為0.16%～2.50%、0.63%～5.00%和1.25%～5.00%。

Kifer等[13]研究顯示，薄荷油與莫匹羅星聯(lián)合對金葡菌有相加作用。本試驗中，薄荷油和利福昔明聯(lián)合對金葡菌也有相加作用，但桉葉油、魚腥草油與利福昔明聯(lián)合表現(xiàn)為無關(guān)作用，推測可能由于不同精油有多種不同成分，并且其抗菌作用往往涉及不同機制或靶點[14]。因薄荷油單獨及聯(lián)合利福昔明抑菌作用最好，故采用薄荷油與利福昔明進行后續(xù)生物被膜的抑制試驗。

生物被膜是一種高度組織化的多細胞聚合物，菌體封閉其中能避免與抗菌藥物接觸[1]。本文利福昔明和精油對大部分金葡菌的MBIC大于MIC，最大可達8倍。有報道，抗生素可對生物被膜有抑制或誘導(dǎo)作用。Liu等[15]發(fā)現(xiàn)金葡菌臨床分離株用1/4 MIC的氨芐西林處理后，生物被膜形成量顯著增加。Silva等[16]發(fā)現(xiàn)用1/2 MIC的慶大霉素處理乳房炎源大腸桿菌，被膜形成量顯著升高。Kamaruzzaman 等[17]發(fā)現(xiàn)15 μg/mL的恩諾沙星能使金葡菌強成膜株的被膜形成量降低10%～27%。本試驗中，1/2 MIC的利福昔明能抑制40%的金葡菌生物被膜形成。

精油的抑膜效果與其成分組成和成分的正辛醇-水分配系數(shù)有關(guān)，例如薄荷油的成分主要包括百里酚、薄荷醇和1,8-桉樹腦，百里酚和薄荷醇的正辛醇-水分配系數(shù)大于3，具有較高的細胞膜穿透力[13]。Poli等[18]檢測了12種EOs對生物被膜的影響，發(fā)現(xiàn)薄荷油對生物被膜形成的抑制作用最強，且抑制過程受群體感應(yīng)信號系統(tǒng)調(diào)控。本試驗中，薄荷油在各亞抑菌濃度(1/2 MIC～1/16 MIC)都顯示對金葡菌生物被膜有明顯抑制作用。本試驗研究也發(fā)現(xiàn)利福昔明聯(lián)合薄荷油對菌株生物被膜形成的抑制作用，較利福昔明單獨作用時明顯增強,當精油以1/2 MIC濃度聯(lián)合時作用最強，可抑制90%的生物被膜形成，且抑制效果均強于兩者單獨組，但當薄荷油的濃度降低為1/16 MIC時，與單獨組無顯著差異，提示兩者聯(lián)合的抑膜效果與薄荷油濃度相關(guān)。

本試驗發(fā)現(xiàn)薄荷油、利福昔明單獨和聯(lián)合應(yīng)用對金葡菌生物被膜形成有抑制作用，為后續(xù)探討二者對生物被膜形成的抑制作用機理奠定了基礎(chǔ)。