徐夢迪，李文倩，楊盛，孫雪婧，陳秋生

(南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，江蘇 南京 210095)

鴨坦布蘇病毒(duck Tembusu virus，DTMUV)最早在1955年首次從馬來西亞庫蚊體內(nèi)分離得到[1]。自2010年春季在我國東南沿海地區(qū)暴發(fā)，因其傳播速度快，發(fā)病率高，很快波及其他省份，給我國養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的損失[2]。DTMUV是一種單股正鏈RNA病毒，歸屬于黃病毒科，黃病毒屬，恩塔亞病毒群。DTMUV與其他致病性黃病毒有著高度的同源性，其基因組長度大約為11 kb，包括1個3′端非編碼、1個5′端非編碼區(qū)和1個中間開放閱讀框[3]。研究表明DTMUV不僅可以感染不同品種的鴨，如北京鴨、櫻桃谷鴨、金定麻鴨等，還可以引起鵝、雞、麻雀等禽類發(fā)病[4]。該病毒主要導致肉鴨采食量減少，精神沉郁，生長遲緩等；引起產(chǎn)蛋鴨卵巢發(fā)炎、出血，卵泡破裂造成產(chǎn)蛋量大幅度下降甚至停產(chǎn)，故又命名為“出血性卵巢炎”[5]。

黃病毒可以通過血液循環(huán)造成病毒血癥，脾臟位于血液循環(huán)通路上，同時研究發(fā)現(xiàn)DTMUV感染過程中脾臟是病毒集聚且大量復制的器官之一，是DTMUV主要的靶器官之一[6]。鴨的脾臟具有一定的特殊性，缺乏邊緣區(qū)，由紅髓和白髓構(gòu)成，于白髓增加了橢球周圍淋巴鞘(periellipsoidal lymphatic sheaths，PELS)。血-脾屏障(blood-spleen barrier，BSB)位于白髓，主要由鞘毛細血管、網(wǎng)狀細胞、網(wǎng)狀纖維以及橢球相關(guān)巨噬細胞組成，是脾臟的重要組成部分，能夠過濾并呈遞血源性抗原，在機體抵抗抗原入侵的過程中起著重要的作用[7]。

凋亡是病毒感染后細胞程序性死亡的一種重要方式[8]。病毒感染誘導細胞凋亡對于機體來說就像一把“雙刃劍”，一方面病毒可以通過誘導細胞凋亡將子代病毒釋放和傳播給宿主，另一方面宿主也可以通過啟動細胞凋亡來消滅感染的細胞從而起到防御作用[9]。已研究報道西尼羅河病毒、登革熱病毒以及寨卡病毒都可以通過激活死亡受體途徑誘導細胞凋亡[10]。但對于DTMUV體內(nèi)誘導脾臟內(nèi)細胞凋亡的研究較少，且未見超微形態(tài)學方面的報道。

很多病毒感染引起機體病變的嚴重程度都與患畜的年齡有關(guān)，如禽流感病毒[11]、西尼羅河病毒[12]等。DTMUV的感染與發(fā)病同樣如此，日齡越小的鴨越易感，臨床癥狀也越嚴重。前人多集中于DTMUV對不同日齡鴨致病性的宏觀研究，然而關(guān)于感染該病毒對不同日齡鴨BSB及周圍組織損傷對比的詳細研究未見報道。本試驗以7日齡雛鴨與6月齡成年鴨為研究對象，注射相同劑量的DTMUV，通過電鏡和光鏡技術(shù)對DTMUV引起不同日齡鴨BSB及周圍組織病理學變化進行詳細比較，從形態(tài)學的角度為DTMUV侵入機體的免疫機制以及疾病的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株與試驗動物

鴨坦布蘇病毒XZ-2012純化株，由南京農(nóng)業(yè)大學動物傳染病診斷與免疫課題組贈與。

7日齡、6月齡健康麻鴨購自南京特給力種植專業(yè)合作社，DTMUV陰性鴨用于試驗。2個年齡組都分為3組，每組10只麻鴨，其中5只以105TCID50的劑量腿部肌肉注射病毒，其余5只作為對照組注射相同體積的滅菌生理鹽水。分別于感染后3、7、11 d(3、7、11 dpi)給試驗鴨以25 mg/kg的劑量靜脈注射戊巴比妥鈉后頸靜脈放血處死，迅速采集脾臟，一部分置于4%多聚甲醛溶液用于制作石蠟切片，另一部分修成橫截面為1 mm2的長條狀固定于4 ℃ 2.5%戊二醛溶液。

1.2 HE染色

取固定好的脾臟制作常規(guī)石蠟切片，厚度為6 μm。切片經(jīng)二甲苯脫蠟后酒精下行入水后，蘇木精染色50 s，流水沖5 min，伊紅染色5 s，上行脫水后透明，中性樹膠封片，用光學顯微鏡觀察切片。

1.3 免疫組化(IHC)

取固定好的脾臟制作常規(guī)石蠟切片，厚度6 μm。切片經(jīng)二甲苯脫蠟后梯度酒精下行至水；3%過氧化氫孵育12 min，蒸餾水洗3次，5 min/次；于枸櫞酸鈉緩沖溶液中抗原修復，高溫加熱后煮沸2 min，冷卻至室溫后0.02 mol/L PBS洗3次，5 min/次；5% BSA 37 ℃封閉30 min；滴加100倍稀釋兔抗DTMUV(實驗室自制兔多抗)4 ℃過夜；0.02 mol/L PBS洗5次，5 min/次，滴加即用型羊抗兔二抗37 ℃孵育2 h；0.02 mol/L PBS洗5次，5 min/次，DAB顯色5 min，蒸餾水洗3次，3 min/次；蘇木精復染20 s，流水沖洗5 min，梯度酒精上行脫水，中性樹膠封片。

1.4 網(wǎng)狀纖維染色

取固定好的脾臟制作常規(guī)石蠟切片，厚度10 μm。切片經(jīng)脫蠟下行入水，1%高錳酸鉀水溶液氧化3 min，蒸餾水洗3次，3 min/次；1%草酸水溶液漂白3 min，蒸餾水洗5次，3 min/次；2.5%鐵銨礬水溶液媒染14 min，蒸餾水洗5次，3 min/次；銀氨水溶液浸銀5 min，蒸餾水快速蘸洗3次，再洗3次，3 min/次；10%甲醛水溶液還原2 min，蒸餾水洗3次，3 min/次；0.2%氯化金調(diào)色10 s，蒸餾水洗3次，3 min/次；5%硫代硫酸鈉水溶液除銀沉淀3 min，蒸餾水洗3次，3 min/次；梯度酒精上行至二甲苯透明封片，用光學顯微鏡觀察切片。

1.5 透射電鏡樣品的制備與觀察

取固定于2.5%戊二醛溶液中的脾臟組織，浸入1%四氧化鋨溶液中60 min，乙醇溶液梯度脫水后用Epon812包埋。制作超薄切片后用檸檬酸鉛和醋酸鈾染色20 min，切片用日立Hitach-7650透射電鏡進行觀察。

1.6 數(shù)據(jù)分析

切片的半定量分析用Image-Proplus 6.0測量積分光密度值(IOD)值，用IBM SPSS Statistics 20分析數(shù)據(jù)，采用t檢驗分析，P<0.05為顯著性差異，用GraphPad Prism 5.0作圖。數(shù)值用“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 感染DTMUV不同日齡鴨BSB及周圍組織病理學變化差異

6月齡對照組鴨脾臟紅、白髓界限清晰，橢球和PELS發(fā)育完善(圖1b)。7日齡鴨脾臟橢球直徑和PELS的體積比6月齡鴨小(圖1a)。隨著日齡增加，7日齡鴨3～7 dpi對照組橢球直徑和PELS體積增加，脾臟結(jié)構(gòu)不斷發(fā)育(圖1c～圖1e)。6月齡鴨脾臟已發(fā)育成熟，感染后，對照組鴨脾臟組織結(jié)構(gòu)無明顯變化。3 dpi，2個年齡組鴨脾臟紅、白髓界限模糊，7日齡鴨脾臟橢球、PELS結(jié)構(gòu)難辨，較多細胞壞死，細胞數(shù)量明顯減少(圖1f)；而6月齡鴨脾臟橢球和PELS內(nèi)少量細胞壞死(圖1i)。7 dpi，7日齡鴨脾臟橢球周圍仍有空泡變性現(xiàn)象(圖1g)；而6月齡鴨脾臟組織結(jié)構(gòu)已開始恢復，但橢球和PELS結(jié)構(gòu)不清晰(圖1j)。11 dpi，7日齡鴨脾臟橢球和PELS結(jié)構(gòu)仍不清晰(圖1h)；而6月齡鴨脾臟紅、白髓明顯，橢球和PELS基本恢復正常(圖1k)。

RP.紅髓；E.橢球；SC.鞘毛細血管；→.細胞壞死；▲.空泡變性；標尺=20 μm

2.2 不同日齡鴨脾臟內(nèi)DTMUV的分布比較

7日齡、6月齡鴨對照組DTMUV呈陰性(圖2a和2b)。3 dpi，脾臟內(nèi)病毒都集中于橢球外圍和PELS，但7日齡鴨脾臟內(nèi)病毒的分布與陽性反應(yīng)都強于6月齡鴨(圖2c和2d)。7 dpi，7日齡鴨脾臟病毒陽性除分布于紅髓，在橢球外圍和PELS仍有陽性分布(圖2e)；而6月齡鴨脾臟內(nèi)病毒陽性主要分布于紅髓(圖2f)。11 dpi，7日齡鴨脾臟紅髓和PELS仍有病毒陽性分布，且強于6月齡鴨(圖2g)；而6月齡鴨脾臟紅髓僅出現(xiàn)較弱病毒陽性(圖2h)。脾臟內(nèi)DTMUV的半定量結(jié)果如圖3，在3～11 dpi，7日齡鴨脾臟內(nèi)DTMUV陽性都顯著強于6月齡鴨(P<0.05)。

RP.紅髓；SC.鞘毛細血管；→.DTMUV陽性；標尺=20 μm(a，b，e，f，g，h)，標尺=10 μm(c，d)

圖2 不同日齡鴨脾臟內(nèi)DTMUV的分布比較(IHC)

2.3 感染DTMUV對不同日齡鴨BSB網(wǎng)狀纖維損傷的比較

6月齡對照組鴨BSB網(wǎng)狀纖維主要分布于鞘毛細血管基膜、橢球、PELS和PELS與紅髓交界處；而7日齡鴨BSB橢球壁與6月齡相比略不發(fā)達，PELS與紅髓交界處網(wǎng)狀纖維未形成(圖4a和4b)。隨著日齡增加，7日齡鴨3～7 dpi對照組BSB網(wǎng)狀纖維不斷增加(圖4c～圖4e)。7 dpi，對照組鴨脾臟PELS與紅髓交界處網(wǎng)狀纖維形成(圖4d)。6月齡鴨脾臟已發(fā)育成熟，感染后，對照組鴨BSB網(wǎng)狀纖維分布無明顯變化。3 dpi，7日齡BSB網(wǎng)狀纖維損害嚴重，橢球壁、PELS內(nèi)網(wǎng)狀纖維大量減少甚至消失(圖4f)；而6月齡鴨脾臟橢球壁和PELS內(nèi)網(wǎng)狀纖維遭到輕微破壞，PELS與紅髓交界處網(wǎng)狀纖維破壞消失(圖4i)。7 dpi，2個年齡組鴨BSB網(wǎng)狀纖維都增多，但7日齡鴨BSB網(wǎng)狀纖維排列更紊亂(圖4g和4j)。11 dpi，7日齡鴨BSB網(wǎng)狀纖維仍較多，排列略紊亂，且PELS與紅髓交界處網(wǎng)狀纖維仍未形成(圖4h)；而6月齡鴨BSB網(wǎng)狀纖維基本恢復正常(圖4k)。感染DTMUV鴨BSB網(wǎng)狀纖維的半定量結(jié)果如圖5，在3～7 dpi，7日齡鴨BSB網(wǎng)狀纖維的相對含量顯著低于6月齡鴨；在11 dpi，7日齡鴨BSB網(wǎng)狀纖維的相對含量顯著高于6月齡鴨(P<0.05)。

不同天數(shù)組間比較，不同字母表示差異顯著(P<0.05)，字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。下同

圖3 脾臟內(nèi)DTMUV的IOD值

2.4 DTMUV對不同日齡鴨脾臟內(nèi)細胞超微結(jié)構(gòu)破壞的比較

對照組7日齡、6月齡鴨脾臟內(nèi)細胞形態(tài)完整(圖6a和6b)。3 dpi，7日齡鴨脾臟內(nèi)大部分細胞核膜嚴重皺縮，細胞質(zhì)空泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、線粒體嵴斷裂、消失(圖6c)；6月齡鴨脾臟內(nèi)大部分細胞核膜完整，部分細胞核膜輕度皺縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體腫脹，線粒體嵴斷裂甚至消失(圖6d)，相比而言7日齡鴨脾臟內(nèi)細胞病變更嚴重。7 dpi，2個年齡組鴨脾臟內(nèi)細胞都出現(xiàn)染色質(zhì)聚集，細胞核固縮或崩解呈“月牙形”，為典型的細胞凋亡現(xiàn)象(圖6e和6f)。11 dpi，7日齡鴨脾臟內(nèi)仍有細胞內(nèi)有脂質(zhì)(圖6g)，而6月齡鴨脾內(nèi)臟細胞結(jié)構(gòu)形態(tài)基本恢復正常(圖6h)。

RP.紅髓；SC.鞘毛細血管；→.PELS與紅髓交界處網(wǎng)狀纖維，紅色剪頭表示有網(wǎng)狀纖維，綠色表示沒有網(wǎng)狀纖維；▲.橢球壁；標尺=20 μm

圖4 感染DTMUV對不同日齡鴨BSB網(wǎng)狀纖維損傷的比較(網(wǎng)狀纖維染色)

圖5 感染DTMUV鴨BSB網(wǎng)狀纖維相對IOD值

3 討論

通過對照組HE、網(wǎng)狀纖維染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與6月齡鴨相比7日齡鴨脾臟橢球直徑小，PELS體積小，橢球壁、PELS與紅髓交界處網(wǎng)狀纖維發(fā)育不完善，表明7日齡鴨脾臟和BSB都未發(fā)育成熟。本試驗以BSB發(fā)育不成熟的7日齡鴨與BSB發(fā)育成熟的6月齡鴨為研究對象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DTMUV感染雛鴨脾臟病變更嚴重，致病性更強，說明BSB可能對病毒有一定的阻擋能力。

脾臟是機體最大的外周免疫器官，在過濾、抵抗病原微生物入侵中起著重要的作用，而這些主要依賴于BSB[7]。結(jié)合HE與IHC結(jié)果發(fā)現(xiàn)：3 dpi時，7日齡鴨脾臟橢球、PELS內(nèi)細胞壞死及病毒陽性分布明顯比6月齡鴨嚴重。因7日齡鴨脾臟未發(fā)育成熟，免疫功能不完善，對病毒的抵抗力弱，組織病變更嚴重。有研究報道DTMUV感染時脾臟是最早發(fā)病的器官，感染6 d后開始有一定的恢復[13]。本試驗7～11 dpi，6月齡鴨脾臟結(jié)構(gòu)逐漸恢復，病毒陽性不斷減弱，但7日齡鴨脾臟在7 dpi時仍有空泡變性現(xiàn)象，病毒陽性減弱較慢。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，DTMUV主要感染橢球外圍PELS內(nèi)淋巴細胞和巨噬細胞[14]。我們認為由于7日齡鴨脾臟和BSB未發(fā)育成熟，過濾和呈遞抗原的功能不完善，清除病毒的速度慢且病毒造成的損傷持久。

ER.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；Mi.線粒體；直箭頭.核膜皺縮；彎箭頭.染色質(zhì)凝集；▲.脂質(zhì)；標尺=4 μm(b，c，e，f，h)；標尺=6 μm(a，d，g)

圖6 DTMUV對不同日齡鴨脾臟超微結(jié)構(gòu)破壞的比較

網(wǎng)狀纖維是BSB的網(wǎng)絡(luò)支架，在淋巴細胞遷移[15-16]以及機械性抵抗外源物質(zhì)的過程中有著重要的作用[17]。網(wǎng)狀纖維的增加、減少以及排列方式的改變都有一定臨床診斷意義[18]。本試驗結(jié)果表明：3 dpi時，2個年齡組鴨BSB網(wǎng)狀纖維都減少，7日齡鴨脾BSB網(wǎng)狀纖維損傷更嚴重。Weiss等[19]研究發(fā)現(xiàn)瘧原蟲感染小鼠后，網(wǎng)狀細胞被激活并通過增加其分支來保護機體免受寄生蟲危害。7 dpi時，2個年齡組鴨BSB的網(wǎng)狀纖維都增加，但排列紊亂。此時網(wǎng)狀纖維增加可保護機體，同時可能有利于淋巴細胞的遷移和歸巢，促進脾臟的恢復。11 dpi時，6月齡鴨BSB網(wǎng)狀纖維基本恢復正常結(jié)構(gòu)，但7日齡鴨BSB網(wǎng)狀纖維仍然較多排列略紊亂。再次表明感染前期，雛鴨由于BSB發(fā)育不成熟，網(wǎng)狀纖維支架遭到的破壞嚴重，也影響感染后期脾臟和BSB的恢復速度。11 dpi時，7日齡鴨脾臟PELS與紅髓交界處網(wǎng)狀纖維仍未形成，這表明DTMUV阻礙了BSB的正常發(fā)育。

細胞水腫是一種可復性損傷，主要表現(xiàn)為線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，但水腫嚴重會造成細胞死亡。電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 dpi，2個年齡組鴨脾臟內(nèi)細胞水腫，但7日齡鴨脾臟內(nèi)核膜明顯皺縮?？梢奃TMUV引起雛鴨脾臟內(nèi)細胞水腫程度嚴重，這可能是導致雛鴨脾臟內(nèi)細胞死亡較多的原因之一。凋亡是一種病毒誘導所引起的細胞死亡方式，機體在遭到病毒入侵時，凋亡很可能是細胞的一種自我防御手段。本試驗在7 dpi時，2組鴨脾臟內(nèi)細胞都出現(xiàn)典型的凋亡現(xiàn)象。我們推測此時脾臟內(nèi)細胞通過凋亡的方式清除病毒來達到保護機體的作用。細胞凋亡有3條信號通路，分別是線粒體通路，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路和死亡受體通路，對于DTMUV通過哪條信號通路誘導凋亡需要進一步研究。11 dpi時，7日齡鴨脾臟內(nèi)仍有細胞內(nèi)殘存脂質(zhì)，脂質(zhì)的異常會影響細胞的正常生命活動，說明7日齡鴨脾臟仍未恢復。

綜上所述，與6月齡成年鴨相比，7日齡雛鴨脾臟和BSB未發(fā)育成熟，DTMUV對BSB及周圍組織的破壞更嚴重，脾臟和BSB排除病毒和恢復也較慢。同時DTMUV誘導鴨脾臟內(nèi)細胞凋亡，為DTMUV的發(fā)病與防御機制的研究提供思路。