徐夢(mèng)迪，李文倩，楊盛，孫雪婧，陳秋生

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

鴨坦布蘇病毒(duck Tembusu virus，DTMUV)最早在1955年首次從馬來西亞庫蚊體內(nèi)分離得到[1]。自2010年春季在我國東南沿海地區(qū)暴發(fā)，因其傳播速度快，發(fā)病率高，很快波及其他省份，給我國養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的損失[2]。DTMUV是一種單股正鏈RNA病毒，歸屬于黃病毒科，黃病毒屬，恩塔亞病毒群。DTMUV與其他致病性黃病毒有著高度的同源性，其基因組長度大約為11 kb，包括1個(gè)3′端非編碼、1個(gè)5′端非編碼區(qū)和1個(gè)中間開放閱讀框[3]。研究表明DTMUV不僅可以感染不同品種的鴨，如北京鴨、櫻桃谷鴨、金定麻鴨等，還可以引起鵝、雞、麻雀等禽類發(fā)病[4]。該病毒主要導(dǎo)致肉鴨采食量減少，精神沉郁，生長遲緩等；引起產(chǎn)蛋鴨卵巢發(fā)炎、出血，卵泡破裂造成產(chǎn)蛋量大幅度下降甚至停產(chǎn)，故又命名為“出血性卵巢炎”[5]。

黃病毒可以通過血液循環(huán)造成病毒血癥，脾臟位于血液循環(huán)通路上，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)DTMUV感染過程中脾臟是病毒集聚且大量復(fù)制的器官之一，是DTMUV主要的靶器官之一[6]。鴨的脾臟具有一定的特殊性，缺乏邊緣區(qū)，由紅髓和白髓構(gòu)成，于白髓增加了橢球周圍淋巴鞘(periellipsoidal lymphatic sheaths，PELS)。血-脾屏障(blood-spleen barrier，BSB)位于白髓，主要由鞘毛細(xì)血管、網(wǎng)狀細(xì)胞、網(wǎng)狀纖維以及橢球相關(guān)巨噬細(xì)胞組成，是脾臟的重要組成部分，能夠過濾并呈遞血源性抗原，在機(jī)體抵抗抗原入侵的過程中起著重要的作用[7]。

凋亡是病毒感染后細(xì)胞程序性死亡的一種重要方式[8]。病毒感染誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡對(duì)于機(jī)體來說就像一把“雙刃劍”，一方面病毒可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡將子代病毒釋放和傳播給宿主，另一方面宿主也可以通過啟動(dòng)細(xì)胞凋亡來消滅感染的細(xì)胞從而起到防御作用[9]。已研究報(bào)道西尼羅河病毒、登革熱病毒以及寨卡病毒都可以通過激活死亡受體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。但對(duì)于DTMUV體內(nèi)誘導(dǎo)脾臟內(nèi)細(xì)胞凋亡的研究較少，且未見超微形態(tài)學(xué)方面的報(bào)道。

很多病毒感染引起機(jī)體病變的嚴(yán)重程度都與患畜的年齡有關(guān)，如禽流感病毒[11]、西尼羅河病毒[12]等。DTMUV的感染與發(fā)病同樣如此，日齡越小的鴨越易感，臨床癥狀也越嚴(yán)重。前人多集中于DTMUV對(duì)不同日齡鴨致病性的宏觀研究，然而關(guān)于感染該病毒對(duì)不同日齡鴨BSB及周圍組織損傷對(duì)比的詳細(xì)研究未見報(bào)道。本試驗(yàn)以7日齡雛鴨與6月齡成年鴨為研究對(duì)象，注射相同劑量的DTMUV，通過電鏡和光鏡技術(shù)對(duì)DTMUV引起不同日齡鴨BSB及周圍組織病理學(xué)變化進(jìn)行詳細(xì)比較，從形態(tài)學(xué)的角度為DTMUV侵入機(jī)體的免疫機(jī)制以及疾病的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株與試驗(yàn)動(dòng)物

鴨坦布蘇病毒XZ-2012純化株，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病診斷與免疫課題組贈(zèng)與。

7日齡、6月齡健康麻鴨購自南京特給力種植專業(yè)合作社，DTMUV陰性鴨用于試驗(yàn)。2個(gè)年齡組都分為3組，每組10只麻鴨，其中5只以105TCID50的劑量腿部肌肉注射病毒，其余5只作為對(duì)照組注射相同體積的滅菌生理鹽水。分別于感染后3、7、11 d(3、7、11 dpi)給試驗(yàn)鴨以25 mg/kg的劑量靜脈注射戊巴比妥鈉后頸靜脈放血處死，迅速采集脾臟，一部分置于4%多聚甲醛溶液用于制作石蠟切片，另一部分修成橫截面為1 mm2的長條狀固定于4 ℃ 2.5%戊二醛溶液。

1.2 HE染色

取固定好的脾臟制作常規(guī)石蠟切片，厚度為6 μm。切片經(jīng)二甲苯脫蠟后酒精下行入水后，蘇木精染色50 s，流水沖5 min，伊紅染色5 s，上行脫水后透明，中性樹膠封片，用光學(xué)顯微鏡觀察切片。

1.3 免疫組化(IHC)

取固定好的脾臟制作常規(guī)石蠟切片，厚度6 μm。切片經(jīng)二甲苯脫蠟后梯度酒精下行至水；3%過氧化氫孵育12 min，蒸餾水洗3次，5 min/次；于枸櫞酸鈉緩沖溶液中抗原修復(fù)，高溫加熱后煮沸2 min，冷卻至室溫后0.02 mol/L PBS洗3次，5 min/次；5% BSA 37 ℃封閉30 min；滴加100倍稀釋兔抗DTMUV(實(shí)驗(yàn)室自制兔多抗)4 ℃過夜；0.02 mol/L PBS洗5次，5 min/次，滴加即用型羊抗兔二抗37 ℃孵育2 h；0.02 mol/L PBS洗5次，5 min/次，DAB顯色5 min，蒸餾水洗3次，3 min/次；蘇木精復(fù)染20 s，流水沖洗5 min，梯度酒精上行脫水，中性樹膠封片。

1.4 網(wǎng)狀纖維染色

取固定好的脾臟制作常規(guī)石蠟切片，厚度10 μm。切片經(jīng)脫蠟下行入水，1%高錳酸鉀水溶液氧化3 min，蒸餾水洗3次，3 min/次；1%草酸水溶液漂白3 min，蒸餾水洗5次，3 min/次；2.5%鐵銨礬水溶液媒染14 min，蒸餾水洗5次，3 min/次；銀氨水溶液浸銀5 min，蒸餾水快速蘸洗3次，再洗3次，3 min/次；10%甲醛水溶液還原2 min，蒸餾水洗3次，3 min/次；0.2%氯化金調(diào)色10 s，蒸餾水洗3次，3 min/次；5%硫代硫酸鈉水溶液除銀沉淀3 min，蒸餾水洗3次，3 min/次；梯度酒精上行至二甲苯透明封片，用光學(xué)顯微鏡觀察切片。

1.5 透射電鏡樣品的制備與觀察

取固定于2.5%戊二醛溶液中的脾臟組織，浸入1%四氧化鋨溶液中60 min，乙醇溶液梯度脫水后用Epon812包埋。制作超薄切片后用檸檬酸鉛和醋酸鈾染色20 min，切片用日立Hitach-7650透射電鏡進(jìn)行觀察。

1.6 數(shù)據(jù)分析

切片的半定量分析用Image-Proplus 6.0測量積分光密度值(IOD)值，用IBM SPSS Statistics 20分析數(shù)據(jù)，采用t檢驗(yàn)分析，P<0.05為顯著性差異，用GraphPad Prism 5.0作圖。數(shù)值用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 感染DTMUV不同日齡鴨BSB及周圍組織病理學(xué)變化差異

6月齡對(duì)照組鴨脾臟紅、白髓界限清晰，橢球和PELS發(fā)育完善(圖1b)。7日齡鴨脾臟橢球直徑和PELS的體積比6月齡鴨小(圖1a)。隨著日齡增加，7日齡鴨3～7 dpi對(duì)照組橢球直徑和PELS體積增加，脾臟結(jié)構(gòu)不斷發(fā)育(圖1c～圖1e)。6月齡鴨脾臟已發(fā)育成熟，感染后，對(duì)照組鴨脾臟組織結(jié)構(gòu)無明顯變化。3 dpi，2個(gè)年齡組鴨脾臟紅、白髓界限模糊，7日齡鴨脾臟橢球、PELS結(jié)構(gòu)難辨，較多細(xì)胞壞死，細(xì)胞數(shù)量明顯減少(圖1f)；而6月齡鴨脾臟橢球和PELS內(nèi)少量細(xì)胞壞死(圖1i)。7 dpi，7日齡鴨脾臟橢球周圍仍有空泡變性現(xiàn)象(圖1g)；而6月齡鴨脾臟組織結(jié)構(gòu)已開始恢復(fù)，但橢球和PELS結(jié)構(gòu)不清晰(圖1j)。11 dpi，7日齡鴨脾臟橢球和PELS結(jié)構(gòu)仍不清晰(圖1h)；而6月齡鴨脾臟紅、白髓明顯，橢球和PELS基本恢復(fù)正常(圖1k)。

RP.紅髓；E.橢球；SC.鞘毛細(xì)血管；→.細(xì)胞壞死；▲.空泡變性；標(biāo)尺=20 μm

2.2 不同日齡鴨脾臟內(nèi)DTMUV的分布比較

7日齡、6月齡鴨對(duì)照組DTMUV呈陰性(圖2a和2b)。3 dpi，脾臟內(nèi)病毒都集中于橢球外圍和PELS，但7日齡鴨脾臟內(nèi)病毒的分布與陽性反應(yīng)都強(qiáng)于6月齡鴨(圖2c和2d)。7 dpi，7日齡鴨脾臟病毒陽性除分布于紅髓，在橢球外圍和PELS仍有陽性分布(圖2e)；而6月齡鴨脾臟內(nèi)病毒陽性主要分布于紅髓(圖2f)。11 dpi，7日齡鴨脾臟紅髓和PELS仍有病毒陽性分布，且強(qiáng)于6月齡鴨(圖2g)；而6月齡鴨脾臟紅髓僅出現(xiàn)較弱病毒陽性(圖2h)。脾臟內(nèi)DTMUV的半定量結(jié)果如圖3，在3～11 dpi，7日齡鴨脾臟內(nèi)DTMUV陽性都顯著強(qiáng)于6月齡鴨(P<0.05)。

RP.紅髓；SC.鞘毛細(xì)血管；→.DTMUV陽性；標(biāo)尺=20 μm(a，b，e，f，g，h)，標(biāo)尺=10 μm(c，d)

圖2 不同日齡鴨脾臟內(nèi)DTMUV的分布比較(IHC)

2.3 感染DTMUV對(duì)不同日齡鴨BSB網(wǎng)狀纖維損傷的比較

6月齡對(duì)照組鴨BSB網(wǎng)狀纖維主要分布于鞘毛細(xì)血管基膜、橢球、PELS和PELS與紅髓交界處；而7日齡鴨BSB橢球壁與6月齡相比略不發(fā)達(dá)，PELS與紅髓交界處網(wǎng)狀纖維未形成(圖4a和4b)。隨著日齡增加，7日齡鴨3～7 dpi對(duì)照組BSB網(wǎng)狀纖維不斷增加(圖4c～圖4e)。7 dpi，對(duì)照組鴨脾臟PELS與紅髓交界處網(wǎng)狀纖維形成(圖4d)。6月齡鴨脾臟已發(fā)育成熟，感染后，對(duì)照組鴨BSB網(wǎng)狀纖維分布無明顯變化。3 dpi，7日齡BSB網(wǎng)狀纖維損害嚴(yán)重，橢球壁、PELS內(nèi)網(wǎng)狀纖維大量減少甚至消失(圖4f)；而6月齡鴨脾臟橢球壁和PELS內(nèi)網(wǎng)狀纖維遭到輕微破壞，PELS與紅髓交界處網(wǎng)狀纖維破壞消失(圖4i)。7 dpi，2個(gè)年齡組鴨BSB網(wǎng)狀纖維都增多，但7日齡鴨BSB網(wǎng)狀纖維排列更紊亂(圖4g和4j)。11 dpi，7日齡鴨BSB網(wǎng)狀纖維仍較多，排列略紊亂，且PELS與紅髓交界處網(wǎng)狀纖維仍未形成(圖4h)；而6月齡鴨BSB網(wǎng)狀纖維基本恢復(fù)正常(圖4k)。感染DTMUV鴨BSB網(wǎng)狀纖維的半定量結(jié)果如圖5，在3～7 dpi，7日齡鴨BSB網(wǎng)狀纖維的相對(duì)含量顯著低于6月齡鴨；在11 dpi，7日齡鴨BSB網(wǎng)狀纖維的相對(duì)含量顯著高于6月齡鴨(P<0.05)。

不同天數(shù)組間比較，不同字母表示差異顯著(P<0.05)，字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。下同

圖3 脾臟內(nèi)DTMUV的IOD值

2.4 DTMUV對(duì)不同日齡鴨脾臟內(nèi)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)破壞的比較

對(duì)照組7日齡、6月齡鴨脾臟內(nèi)細(xì)胞形態(tài)完整(圖6a和6b)。3 dpi，7日齡鴨脾臟內(nèi)大部分細(xì)胞核膜嚴(yán)重皺縮，細(xì)胞質(zhì)空泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、線粒體嵴斷裂、消失(圖6c)；6月齡鴨脾臟內(nèi)大部分細(xì)胞核膜完整，部分細(xì)胞核膜輕度皺縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體腫脹，線粒體嵴斷裂甚至消失(圖6d)，相比而言7日齡鴨脾臟內(nèi)細(xì)胞病變更嚴(yán)重。7 dpi，2個(gè)年齡組鴨脾臟內(nèi)細(xì)胞都出現(xiàn)染色質(zhì)聚集，細(xì)胞核固縮或崩解呈“月牙形”，為典型的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象(圖6e和6f)。11 dpi，7日齡鴨脾臟內(nèi)仍有細(xì)胞內(nèi)有脂質(zhì)(圖6g)，而6月齡鴨脾內(nèi)臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)基本恢復(fù)正常(圖6h)。

RP.紅髓；SC.鞘毛細(xì)血管；→.PELS與紅髓交界處網(wǎng)狀纖維，紅色剪頭表示有網(wǎng)狀纖維，綠色表示沒有網(wǎng)狀纖維；▲.橢球壁；標(biāo)尺=20 μm

圖4 感染DTMUV對(duì)不同日齡鴨BSB網(wǎng)狀纖維損傷的比較(網(wǎng)狀纖維染色)

圖5 感染DTMUV鴨BSB網(wǎng)狀纖維相對(duì)IOD值

3 討論

通過對(duì)照組HE、網(wǎng)狀纖維染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與6月齡鴨相比7日齡鴨脾臟橢球直徑小，PELS體積小，橢球壁、PELS與紅髓交界處網(wǎng)狀纖維發(fā)育不完善，表明7日齡鴨脾臟和BSB都未發(fā)育成熟。本試驗(yàn)以BSB發(fā)育不成熟的7日齡鴨與BSB發(fā)育成熟的6月齡鴨為研究對(duì)象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DTMUV感染雛鴨脾臟病變更嚴(yán)重，致病性更強(qiáng)，說明BSB可能對(duì)病毒有一定的阻擋能力。

脾臟是機(jī)體最大的外周免疫器官，在過濾、抵抗病原微生物入侵中起著重要的作用，而這些主要依賴于BSB[7]。結(jié)合HE與IHC結(jié)果發(fā)現(xiàn)：3 dpi時(shí)，7日齡鴨脾臟橢球、PELS內(nèi)細(xì)胞壞死及病毒陽性分布明顯比6月齡鴨嚴(yán)重。因7日齡鴨脾臟未發(fā)育成熟，免疫功能不完善，對(duì)病毒的抵抗力弱，組織病變更嚴(yán)重。有研究報(bào)道DTMUV感染時(shí)脾臟是最早發(fā)病的器官，感染6 d后開始有一定的恢復(fù)[13]。本試驗(yàn)7～11 dpi，6月齡鴨脾臟結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)，病毒陽性不斷減弱，但7日齡鴨脾臟在7 dpi時(shí)仍有空泡變性現(xiàn)象，病毒陽性減弱較慢。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，DTMUV主要感染橢球外圍PELS內(nèi)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞[14]。我們認(rèn)為由于7日齡鴨脾臟和BSB未發(fā)育成熟，過濾和呈遞抗原的功能不完善，清除病毒的速度慢且病毒造成的損傷持久。

ER.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；Mi.線粒體；直箭頭.核膜皺縮；彎箭頭.染色質(zhì)凝集；▲.脂質(zhì)；標(biāo)尺=4 μm(b，c，e，f，h)；標(biāo)尺=6 μm(a，d，g)

圖6 DTMUV對(duì)不同日齡鴨脾臟超微結(jié)構(gòu)破壞的比較

網(wǎng)狀纖維是BSB的網(wǎng)絡(luò)支架，在淋巴細(xì)胞遷移[15-16]以及機(jī)械性抵抗外源物質(zhì)的過程中有著重要的作用[17]。網(wǎng)狀纖維的增加、減少以及排列方式的改變都有一定臨床診斷意義[18]。本試驗(yàn)結(jié)果表明：3 dpi時(shí)，2個(gè)年齡組鴨BSB網(wǎng)狀纖維都減少，7日齡鴨脾BSB網(wǎng)狀纖維損傷更嚴(yán)重。Weiss等[19]研究發(fā)現(xiàn)瘧原蟲感染小鼠后，網(wǎng)狀細(xì)胞被激活并通過增加其分支來保護(hù)機(jī)體免受寄生蟲危害。7 dpi時(shí)，2個(gè)年齡組鴨BSB的網(wǎng)狀纖維都增加，但排列紊亂。此時(shí)網(wǎng)狀纖維增加可保護(hù)機(jī)體，同時(shí)可能有利于淋巴細(xì)胞的遷移和歸巢，促進(jìn)脾臟的恢復(fù)。11 dpi時(shí)，6月齡鴨BSB網(wǎng)狀纖維基本恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)，但7日齡鴨BSB網(wǎng)狀纖維仍然較多排列略紊亂。再次表明感染前期，雛鴨由于BSB發(fā)育不成熟，網(wǎng)狀纖維支架遭到的破壞嚴(yán)重，也影響感染后期脾臟和BSB的恢復(fù)速度。11 dpi時(shí)，7日齡鴨脾臟PELS與紅髓交界處網(wǎng)狀纖維仍未形成，這表明DTMUV阻礙了BSB的正常發(fā)育。

細(xì)胞水腫是一種可復(fù)性損傷，主要表現(xiàn)為線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，但水腫嚴(yán)重會(huì)造成細(xì)胞死亡。電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 dpi，2個(gè)年齡組鴨脾臟內(nèi)細(xì)胞水腫，但7日齡鴨脾臟內(nèi)核膜明顯皺縮。可見DTMUV引起雛鴨脾臟內(nèi)細(xì)胞水腫程度嚴(yán)重，這可能是導(dǎo)致雛鴨脾臟內(nèi)細(xì)胞死亡較多的原因之一。凋亡是一種病毒誘導(dǎo)所引起的細(xì)胞死亡方式，機(jī)體在遭到病毒入侵時(shí)，凋亡很可能是細(xì)胞的一種自我防御手段。本試驗(yàn)在7 dpi時(shí)，2組鴨脾臟內(nèi)細(xì)胞都出現(xiàn)典型的凋亡現(xiàn)象。我們推測此時(shí)脾臟內(nèi)細(xì)胞通過凋亡的方式清除病毒來達(dá)到保護(hù)機(jī)體的作用。細(xì)胞凋亡有3條信號(hào)通路，分別是線粒體通路，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路和死亡受體通路，對(duì)于DTMUV通過哪條信號(hào)通路誘導(dǎo)凋亡需要進(jìn)一步研究。11 dpi時(shí)，7日齡鴨脾臟內(nèi)仍有細(xì)胞內(nèi)殘存脂質(zhì)，脂質(zhì)的異常會(huì)影響細(xì)胞的正常生命活動(dòng)，說明7日齡鴨脾臟仍未恢復(fù)。

綜上所述，與6月齡成年鴨相比，7日齡雛鴨脾臟和BSB未發(fā)育成熟，DTMUV對(duì)BSB及周圍組織的破壞更嚴(yán)重，脾臟和BSB排除病毒和恢復(fù)也較慢。同時(shí)DTMUV誘導(dǎo)鴨脾臟內(nèi)細(xì)胞凋亡，為DTMUV的發(fā)病與防御機(jī)制的研究提供思路。