王歡，楊密，蒲廣，范麗娟，高琛，牛培培，吳承武，周娟，黃瑞華,4，李平華,4,5*

(1. 南京農業(yè)大學養(yǎng)豬研究所,江蘇 南京 210095；2. 南京農業(yè)大學淮安研究院, 江蘇 淮安 223001；3. 淮安市淮陰種豬場, 江蘇 淮安 223322；4. 江蘇省現代農業(yè)(生豬)產業(yè)技術體系集成創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095；5. 淮安市南農大新農村發(fā)展研究有限公司，江蘇 淮安 223001)

近年來，隨著養(yǎng)豬業(yè)集約化的發(fā)展，養(yǎng)殖過程中會產生大量糞便，生產者往往追求動物最好的生產性能，但低效的飼料消化導致過量的營養(yǎng)素排放到環(huán)境中，由此產生的氮、磷及有害微生物對生態(tài)環(huán)境造成了嚴重的負面影響，已經制約了養(yǎng)豬業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1]。減少豬氮、磷以及有害微生物的過量排放，緩解對生態(tài)環(huán)境的壓力是養(yǎng)豬業(yè)正在關注的熱點[2]。研究表明日糧調控措施可以減少豬的氮、磷及有害微生物的排放，為解決畜禽污染問題提供了解決方案，主要包括降低日糧粗蛋白水平、提高日糧纖維(dietary fiber，DF)水平及使用日糧添加劑等[3-4]。Poulsen等[5]研究發(fā)現在菜籽粕、葵花籽粕、蠶豆及三者混合物中添加麥麩進行發(fā)酵增加了蛋白質和磷消化率，從而減少了豬和家禽的氮、磷排放；朱麗媛[6]指出隨著日糧纖維水平的增加，糞便氮排放量顯著降低。與此同時，許多研究表明，日糧纖維有利于有益細菌的增殖，抑制有害細菌的增殖。Laitat等[7]研究發(fā)現，飼糧補充24%的甜菜渣能夠顯著降低生長豬腸道大腸桿菌豐度。Kumar等[8]在感染沙門菌小鼠的飲食中加入10%和20%的米糠可顯著降低糞便中沙門菌脫落，增加乳酸桿菌豐度。畜牧業(yè)飼料原料資源短缺、人畜爭糧矛盾等日益凸顯，纖維性飼料原料因資源豐富、成本低廉等特點引起關注，在生豬生產及相關研究中的應用均呈增加態(tài)勢[9]。粗纖維的生理功能及在降低豬糞便中氮、磷含量以及腸道有害微生物上的潛在作用逐漸受到重視。

為了一定程度緩解養(yǎng)豬業(yè)環(huán)保及人畜爭糧壓力，選擇具有耐粗飼特性的蘇淮豬，以資源豐富、成本低廉的脫脂米糠為纖維源設計試驗。米糠是糙米精制過程產生的副產物，占水稻總重量的10%左右，包括種皮、果皮、糊粉層和胚乳層等[10]。通過溶劑萃取法從米糠中去除脂肪，可以生產脂肪濃度為2%至4%的脫脂米糠。在前期本課題組研究中，蒲廣等[11]用不同脫脂米糠替代水平的日糧飼喂蘇淮育肥豬發(fā)現，28%脫脂米糠替代水平的日糧仍不影響蘇淮豬育肥豬的生長性能。因此在不影響蘇淮豬生長性能的前提下，本試驗研究對照組，14%和28%脫脂米糠替代玉米的日糧對蘇淮豬直腸氮、磷及結腸總菌、大腸桿菌、產氣莢膜梭菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌豐度的影響，旨在從環(huán)保角度尋求脫脂米糠的適宜添加水平，為減少豬養(yǎng)殖糞便污染的研究提供一定理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗選擇體重相近(62.90±0.78)kg、健康的蘇淮閹公豬15頭，隨機分為3個處理組，每組5個重復，因使用奧飼本全自動生產性能測定系統(tǒng)進行飼喂，每個重復1頭豬，自由采食和飲水。試驗預試期10 d，所有豬飼喂基礎日糧；正試期28 d，對照組和試驗Ⅰ～Ⅱ組分別飼喂以基礎日糧，14%和28%脫脂米糠替代玉米日糧。中性洗滌纖維水平分別為8.89%、12.93%和17.94%。

1.2 試驗日糧

本試驗基礎日糧依照《豬飼養(yǎng)標準(NY/T 65-2004)60～90 kg肉脂型生長肥育豬標準》進行配置。該飼料由江蘇省淮安市正昌飼料有限公司生產。試驗組日糧設置14%、28%脫脂米糠替代玉米的梯度，旨在從環(huán)保角度尋求脫脂米糠的適宜添加水平，為減少蘇淮豬糞便污染的研究提供一定參考。因此，除纖維含量不同外，其余營養(yǎng)成分基本一致或相近，具體日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 日糧配方及營養(yǎng)水平(干物質基礎)

項目 組別 對照組試驗Ⅰ組試驗Ⅱ組原料組成/%玉米 68.6155.0041.00麩皮 15.4016.1517.21米糠粕 0.0014.0028.0046%豆粕 13.310.407.50豆油 0.001.833.7498.5%賴氨酸0.030.030.03鹽 0.300.300.30石粉0.820.850.85磷酸氫鈣0.750.650.5860%膽堿0.040.040.04預混料1)0.400.400.40營養(yǎng)水平2)消化能/(MJ·kg-1) 13.1313.1313.13粗蛋白/%15.616.1316.40中性洗滌纖維/%8.8912.9317.94酸性洗滌纖維/%5.536.538.13鈣/%0.550.550.55有效磷/%0.270.270.27賴氨酸/%0.650.650.65蛋氨酸+胱氨酸/% 0.450.460.47

注：1)預混料為每千克日糧提供：維生素A 8 000 U，維生素D31 500 U，維生素E 100 mg，維生素K34 mg，維生素B12 mg，維生素B28 mg，維生素B63 mg，維生素B120.04 mg，煙酸30 mg，泛酸35 mg，葉酸0.6 mg，生物素0.13 mg，膽堿150 mg，鐵60 mg，銅5 mg，鋅60 mg，錳10 mg，硒0.15 mg和碘0.1 mg。

2)粗蛋白、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維為測定值，其他營養(yǎng)水平為計算值。

1.3 飼養(yǎng)管理

整個試驗期間，所有豬全天自由采食，自由飲水。豬舍內通過安裝空氣源熱泵保障舍內環(huán)境的一致性，試驗期內豬舍溫度保持在15.5～19.6 ℃。所有試驗豬按常規(guī)免疫程序注射疫苗。試驗在南京農業(yè)大學淮安研究院試驗豬場進行。

1.4 樣品采集、指標測定

1.4.1 樣品采集

28 d所有豬電擊宰殺后，快速打開腹腔，分離出腸道。無菌操作，結腸中點處刮取黏膜于2 mL滅菌凍存管，迅速保存于液氮中，以用于微生物豐度的測定。采集直腸末端內容物，按每200 g樣品加15 mL的10%硫酸均勻混合于自封袋中，并且排盡空氣，保存在-20 ℃冰箱待測。

1.4.2 直腸內容物氮、磷含量測定

將直腸食糜樣品置于烘箱65℃溫度下烘干，氮、磷含量測定均以食糜干重為基礎。氮含量采用K1160全自動凱氏定氮儀(Hanon，中國)測定。磷含量采用鉬黃法進行測定，破壞樣品中的有機物，使磷游離出來，在酸性溶液中用釩鉬酸銨處理，再在波長420 nm下用分光光度計進行比色測定。

1.4.3 結腸微生物16S rRNA基因拷貝數量(豐度)測定

使用FastDNA?Spin Kit試劑盒(MP Biomedicals,美國)提取新鮮黏膜樣品微生物總DNA，表2是引物序列，由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司合成。構建標準質粒制作特定的標準曲線，利用純化試劑盒(OMEGA)對目標細菌的PCR反應產物進行純化，克隆到通用載體(TsingKe，中國)中。重組質粒細菌經過14 h擴培后，挑選陽性克隆菌液測序，對細菌基因序列比對分析(NCBI)，對比結果成功后含氨芐的LB液體培養(yǎng)基擴培14～16 h。用AxyPrepTMPlasmid Miniprep Kit (AXYGEN)提取重組質粒DNA，成功構建目標細菌的標準質粒。利用 ABI 7300 Real-time PCR 儀對細菌進行定量PCR，并制作標準曲線。細菌的拷貝數計算公式如下：

拷貝數=(6.023 3×1023×C)/(660×109×A),其中C：DNA濃度(ng/μL)，A：目的片段長度(bp)。

表2 定量PCR引物

引物序列(5'→3') 參考文獻總菌F:ACTCCTACGGGAGGCAGCAG[12]R:ATTACCGCGGCTGCTGG大腸桿菌F:CATGCCGCGTGTATGAAGAA[13]R:CGGGTAACGTCAATGAG-CAAA產氣莢膜梭菌F:CGCATAACGTTGAAAGATGG[14]R:CCTTGGTAGGCCGTTACCC乳酸桿菌F:GCAGCAGTAGGGAATCTTCCA[13]R:GCATTYCACCGCTACACATG雙歧桿菌F:CGGGTGAGTAATGCGTGACC[15]R:TGATAGGACGCGACCCCA

1.5 數據分析

試驗結果用Excel進行初步處理后，利用SPSS 20.0軟件對各指標進行單因素方差分析(One-way ANOVA)。數據以“平均值±標準誤”表示。

2 結果與分析

2.1 日糧纖維水平對蘇淮豬直腸內容物氮、磷含量的影響

由表3可見，在第28天，蘇淮豬直腸中氮的含量試驗Ⅰ組顯著(P<0.05)、試驗Ⅱ組極顯著(P<0.01)低于對照組；試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組蘇淮豬直腸中磷的含量與對照組沒有顯著差異(P>0.05)。

表3 日糧纖維水平對直腸內容物中氮、磷含量的影響10-2mg·g-1

項目對照組試驗Ⅰ組試驗Ⅱ組氮含量3.25±0.12Aa2.95±0.17ABb2.77±0.12Bb磷含量1.92±0.092.01±0.122.22±0.11

注：不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，同行數據肩標相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同

2.2 日糧纖維水平對蘇淮豬結腸總菌、大腸桿菌、產氣莢膜梭菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌豐度的影響

由表4可見，在第28天，與對照組相比，試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組蘇淮豬結腸總菌、大腸桿菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌豐度差異不顯著(P>0.05)。試驗Ⅰ組產氣莢膜梭菌豐度顯著低于對照組(P<0.05)。

表4 日糧纖維水平對總菌、大腸桿菌、產氣莢膜梭菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌豐度的影響

項目對照組試驗Ⅰ組試驗Ⅱ組總菌8.33±0.098.08±0.187.76±0.17大腸桿菌5.75±0.165.60±0.435.13±0.41產氣莢膜梭菌4.06±0.17a2.98±0.21b3.63±0.30ab乳酸桿菌6.97±0.156.51±0.266.31±0.26雙歧桿菌5.01±0.085.00±0.195.08±0.16

注：腸道細菌豐度以每克樣品拷貝數的lg對數計算。

3 討論

3.1 日糧纖維水平對蘇淮豬直腸內容物氮、磷含量的影響

研究表明，氮和磷對于豬來說是重要的元素，但在飼料中過量地添加氮磷會造成豬糞便中氮、磷元素的過量排放而破壞生態(tài)環(huán)境[1]。因此，利用營養(yǎng)調控措施(降低粗蛋白水平、提高日糧纖維水平及使用日糧添加劑等)來降低豬過量排泄氮磷帶來的環(huán)境污染，對保護生態(tài)環(huán)境具有重要的意義。目前，日糧纖維對減少豬的排泄污染的研究已成為一個新的研究熱點。Patrá?等[16]研究發(fā)現，飼料中添加纖維可以減少豬舍糞便氮的排放。本試驗發(fā)現，第28天試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組直腸氮含量均顯著低于對照組。推測一方面可能是脫脂米糠源的氨基酸組成和比例更有利于蘇淮豬對氮元素的吸收利用，另一方面可能是日糧纖維促進了蘇淮豬對氮的利用，但其促進機制有待深入研究。本研究結果說明了在蛋白能量滿足蘇淮豬蛋白能量需求時，增加日糧中脫脂米糠替代水平可以減少氮的排泄量從而緩解豬糞氮排放過量帶來的生態(tài)環(huán)境污染等問題。

磷是動物體必需的礦物質，對機體有重要的生理和代謝功能。但是，豬的胃腸道內缺少降解植酸磷的酶而無法充分利用植物飼料中的植酸磷，因此豬對磷的利用率極低[17]。為了滿足動物生長需要，在實際生產中經常人為在飼料中添加磷元素，但因磷過量添加導致糞磷含量高對生態(tài)環(huán)境造成污染。因此，如何充分提高植酸磷的利用率，降低糞便中磷的過量排泄、減少環(huán)境污染成為重大問題。前人研究表明，日糧纖維有利于提高磷消化率降低豬糞磷排放。Poulsen等[5]研究發(fā)現在菜籽粕、葵花籽粕、蠶豆及三者混合物中添加麥麩進行發(fā)酵減少了豬和家禽的氮、磷排放。Li等[9]發(fā)現提高日糧纖維素添加水平顯著降低生長豬內源性磷的糞便排泄率。本試驗結果發(fā)現，脫脂米糠替代水平的升高并沒有引起直腸磷排泄的增加，推測可能是因為脫脂米糠的有效磷含量比較高，蘇淮豬對高脫脂米糠日糧的吸收效果較好。日糧纖維水平如何影響豬對磷的吸收機制有待進一步研究。本試驗結果表明，28%的脫脂米糠替代玉米的日糧對蘇淮豬直腸內容物磷含量沒有影響，提示合理的脫脂米糠替代能夠滿足蘇淮豬對磷的需求，一定程度避免了糞磷污染。

3.2 日糧纖維水平對蘇淮豬結腸總菌、大腸桿菌、產氣莢膜梭菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌豐度的影響

腸道菌群對腸道健康非常重要，不僅因為腸道菌群的不平衡可能導致炎癥反應，而且可能與宿主爭奪營養(yǎng)[18]。乳酸桿菌和雙歧桿菌是哺乳動物腸道中的主要益生菌，它們通過多種機制對腸道病原體起到抑制作用。營養(yǎng)干預引起的大腸桿菌減少被認為在一定程度上對機體有益。由于畜禽糞便的隨意堆放，豬糞便中病原微生物如大腸桿菌(致病性)等致病細菌導致畜禽傳染病的蔓延與發(fā)展。致病微生物的大量繁殖，不僅污染各類農作物，而且經由灌溉或飲用水水源，最終對人和其他動物造成感染。因此降低豬糞便中有害微生物對保護我們的生存環(huán)境，特別是水資源的保護有重要意義。許多研究表明，日糧纖維有利于有益細菌的增殖，抑制有害細菌的增殖。張葉秋等[19]研究發(fā)現飼喂蘇淮豬34.8%的米糠高纖維日糧，在試驗第28天，高米糠日糧組乳酸桿菌、雙歧桿菌豐度與對照組相比均顯著增加。Yan等[20]研究發(fā)現，隨著纖維水平的增加，仔豬腸道大腸桿菌含量并沒有顯著變化，本試驗中結果與之基本一致，本試驗結果表明在不影響蘇淮豬生長性能的前提下，14%脫脂米糠的替代水平有效降低有害菌產氣莢膜梭菌的豐度，28%脫脂米糠的替代不會引起結腸大腸桿菌、產氣莢膜梭菌等有害菌的增加，脫脂米糠替代水平較為合理。

4 結論

從環(huán)保角度看，14%日糧脫脂米糠替代水平較好，能顯著降低結腸黏膜產氣莢膜梭菌豐度，極顯著降低直腸氮排放量，且對蘇淮育肥豬直腸磷排放量和結腸黏膜總菌、大腸桿菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌豐度沒有顯著影響。