劉楠楠， 劉舒媛， 王輝， 張新文， 李傳印， 史荔， 張淑瓊**

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 & 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所 & 云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室， 云南 昆明 650118； 2.昆明市第三人民醫(yī)院， 云南 昆明 650118)

結(jié)核病(tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌引起的感染性疾病，是危害人類健康的主要傳染病之一[1]。據(jù)WHO《2019年全球結(jié)核報告》顯示，TB的患病率和死亡率一直高居不下。目前全球約有25%的人口感染了結(jié)核分枝桿菌，但只有5%～10%的感染者會發(fā)展成為有臨床癥狀的TB患者，表明TB的發(fā)生還與個體的遺傳因素相關(guān)[2-3]，研究發(fā)現(xiàn)宿主遺傳因素對TB的發(fā)生發(fā)展具有重要的作用。低相對分子量蛋白酶體(low molecular weight proteasome，LMP)又稱為β蛋白酶體亞單位(proteasome subunit beta，PSMB)，位于6號染色體MHC-Ⅱ類基因座區(qū)域，由LMP2(PSMB9)和LMP7(PSMB8)組成[4]。LMP2和LMP7是蛋白酶體β亞基家族的成員，編碼蛋白酶體復(fù)合物的催化亞基，參與內(nèi)源性或外源性抗原的降解[5]。LMP可將抗原水解為合適的肽段，水解后的肽段經(jīng)抗原相關(guān)轉(zhuǎn)運體(TAP)轉(zhuǎn)運后與MHCⅠ類分子連接，表達(dá)于細(xì)胞表面供CD8+T細(xì)胞識別[6]。因此LMP基因位點的突變可能會導(dǎo)致LMP基因表達(dá)異常從而影響自身免疫應(yīng)答。目前已有多項研究發(fā)現(xiàn)LMP基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)與感染性疾病[7-8]、自身免疫性疾病[9]和癌癥[10-13]相關(guān)。本研究選取LMP2基因的3個SNP位點rs1351383、rs17587、rs2127675和LMP7基因的1個SNP位點rs2071543，并分析LMP基因多態(tài)性與云南漢族人群TB病的相關(guān)性，報告如下。

1 資料與方法

1.1 樣本收集

根據(jù)知情同意原則，選取2018-2019年在昆明市第三人民醫(yī)院就診并確診為TB的449例患者作為病例組。病例組的納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)國家肺TB診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS288-2017)標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)、結(jié)核抗酸染色和影像學(xué)檢查確診為TB；(2)無合并感染或其他疾?。?3)臨床資料完整。根據(jù)我國TB分類標(biāo)準(zhǔn)(WS196-2017)將病例組再分為肺結(jié)核組和肺外結(jié)核組，肺TB指病變發(fā)生在肺、氣管、支氣管或胸膜等部位，肺外TB指病變發(fā)生在肺以外的部位；根據(jù)治療史，將病例組再分為初治組和復(fù)治組。選取同期參加體檢的367例健康人群作為對照組。對照組的納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)痰涂片結(jié)核抗酸檢查為陰性的個體；(2)既往無TB史；(3)無其他疾病；(4)臨床資料完整。所有受試者均為居住于云南地區(qū)的無親緣關(guān)系的漢族個體。

1.2 方法

1.2.1樣本DNA提取 采集研究對象靜脈血5 mL(EDTA抗凝)，使用全血基因組DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit，德國QIAGEN公司，貨號 51106)提取外周血基因組DNA，超微量紫外可見分光光度計 (Multiskan GO，美國ThermoFisher Scientific公司)檢測DNA的濃度及純度后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2LMP基因SNPs位點的選擇 結(jié)合文獻(xiàn)報道和Ensemble數(shù)據(jù)庫(http://asia.ensembl.org/index.html)查詢，納入在東亞洲人群中最低等位基因頻率>0.1的位點進(jìn)行研究。

1.2.3LMP基因SNP檢測 設(shè)計SNP位點特異性的擴增引物和延伸引物，擴增引物和延伸引物信息見表1。擴增體系為模板DNA (25 ng)、上下游引物(10 μmol/L)各2 μL、TSINGKE金牌Mix 45 μL，總反應(yīng)體系50 μL。PCR擴增反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性 2 min，98 ℃變性10 s、60 ℃退火10 s、72 ℃延伸10 s(共30個循環(huán))。PCR產(chǎn)物經(jīng)SAP消化(37 ℃ 1 h、75 ℃ 15 min)后進(jìn)行單鏈延伸，延伸體系：SAP消化后模板 2 μL、ABI SnapShot multiplex Mix 2 μL、SNP對應(yīng)引物1 μL；延伸反應(yīng)條件：98 ℃ 10 s、50 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s(25個循環(huán))。經(jīng)測序儀(Applied Biosystems，3730XL)檢測后通過峰的移動位置確定該延伸產(chǎn)物對應(yīng)的SNP位點，根據(jù)峰的顏色可得知滲入的堿基種類，從而確定該樣本的基因型。LMP2和LMP7基因的擴增引物和延伸引物信息見表1。

表1 LMP2和LMP7基因的引物序列Tab.1 Primer sequences for LMP2 and LMP7 genes

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，分別采用t檢驗和χ2檢驗對病例組和對照組中的年齡和性別的分布進(jìn)行比較，哈迪-溫伯格平衡用goodness-of-fitχ2檢驗進(jìn)行計算。病例組和對照組間各SNP的等位基因、基因型頻率差異用χ2檢驗進(jìn)行比較。使用SHEsis[14]在線軟件計算各SNP位點間的連鎖不平衡，根據(jù)連鎖不平衡(linkage disequilibrium, LD)結(jié)果構(gòu)建單倍型，兩位點間的LD關(guān)系用D′表示，D′>0.8認(rèn)為位點間強連鎖。病例組和對照組間的單倍型分布差異用χ2檢驗進(jìn)行比較。采用SNPStats[15]在線軟件對LMP基因的SNP位點進(jìn)行遺傳模式分析，根據(jù)赤池信息量準(zhǔn)則(akaike information criterion,AIC)和貝葉斯信息準(zhǔn)則(bayesian information criterions,BIC)的數(shù)值來確定每個位點的最優(yōu)遺傳模式，即具有AIC、BIC最小值的遺傳模式。用于分析的遺傳模式共包括5種：共顯性遺傳模式(codominant model)、顯性遺傳模式(dominant model)、隱性遺傳模式(recessive model)、超顯性遺傳模式(overdominant model)及加性遺傳模式(log-additive model)。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果當(dāng)P<0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義；多重比較的統(tǒng)計學(xué)結(jié)果使用Bonferroni校正，設(shè)定P<0.05/n(n=4)具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病例及對照組基本信息

本研究病例組共納入TB患者449例，對照組納入健康對照367例，病例組與對照組的性別和年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.095、0.340)。納入研究對象的基本特征見表2。

2.2 納入研究的位點及Hardy-Weinberg平衡檢驗

本研究納入LMP2基因的3個SNP位點rs1351383(A>C)、rs17587(G>A)、rs2127675(A>G)和LMP7基因1個SNP位點rs2071543(G>T)；各SNPs位點信息見表3。4個SNP的基因型在病例組(P=0.843、0.394、0.864和0.827)和對照組(P=0.433、0.531、0.994和0.941)中的分布均符合Hardy-Weinberg 平衡檢驗(P>0.05)，說明本研究所選取的樣本是具有群體代表性的隨機樣本。

表2 研究對象基本特征Tab.2 Basic characteristics of the subjects

表3 LMP基因4個SNPs的位點信息Tab.3 The information of 4 SNPs of LMP gene

2.3 等位基因和基因型頻率

結(jié)果顯示，4個SNP位點的等位基因和基因型頻率在病例組與對照組間比較，差異經(jīng)Bonferroni校正后均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.012 5)。見表4。

2.4 遺傳模式分析

共顯性遺傳模式、顯性遺傳模式、隱性遺傳模式、超顯性遺傳模式和加性遺傳模式分析結(jié)果顯示：4個SNP位點在其最優(yōu)遺傳模式下差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.0125)。見表5。

2.5 LMP基因4個SNP構(gòu)建的單倍型分析

對LMP基因的4個SNP位點進(jìn)行連鎖不平衡分析，結(jié)果顯示4個位點間存在強連鎖(D′>0.8)，構(gòu)建rs1351383-rs17587-rs2127675-rs2071543單倍型并分析頻率>3%的單倍型在病例組和對照組中的分布差異，單倍型C-G-G-G在病例組中的頻率顯著高于對照組(P=0.004，OR=1.671，95%CI為1.176～2.372)。見表6。

表4 病例組和對照組LMP基因的4個SNP位點的等位基因和基因型頻率比較Tab.4 The frequencies of alleles and genotypes of 4 SNPs of LMP gene in TB group and control group

注：經(jīng)Bonferroni校正后，當(dāng)P<0.012 5時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表5 病例組和對照組中4個SNP位點的遺傳模式分析Tab.5 Analysis of inheritance models of 4 SNPs in TB group and control group

注：加性遺傳模式表示TT×2+GT的基因型與GG基因型進(jìn)行比較(多態(tài)性位點如為G>T的變異)，經(jīng)Bonferroni校正后，設(shè)置P<0.012 5有統(tǒng)計學(xué)意義。

表6 病例組和對照組 LMP基因4個SNP位點單倍型頻率比較Tab.6 Comparison of haplotypic frequency of 4 SNPs of LMP gene in TB group and control group

注：經(jīng)Bonferroni校正后，當(dāng)P<0.01有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.6 分層分析

將病例組又分為肺結(jié)核組、肺外結(jié)核組、初治組和復(fù)治組進(jìn)行分層分析。運用邏輯回歸模型校正性別和年齡差異后結(jié)果顯示：rs1351383的C等位基因在肺外結(jié)核組的頻率顯著高于對照組，2組間等位基因頻率分布具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.010，OR=1.377, 95%CI為 1.030～1.841)；在最優(yōu)遺傳模式——加性遺傳模式下，rs1351383的基因型分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.008，OR=1.520，95%CI為1.120～2.080)。復(fù)治組與對照組、復(fù)治組與初治組的4個SNP等位基因和基因型頻率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表7。構(gòu)建LMP2基因的單倍型分析結(jié)果顯示：rs1351383-rs17587-rs2127675-rs2071543單倍型C-G-G-G在肺外結(jié)核組中的頻率(0.131)顯著高于對照組中的頻率(0.070)(P=0.003，OR=1.982，95%CI為1.246～3.154)，經(jīng)Bonferroni校正后，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表7 肺外結(jié)核組和對照組中rs1351383的等位基因、基因型頻率比較Tab.7 The frequencies of alleles and genotypes of rs1351383 in EPTB group and control group

注：經(jīng)Bonferroni校正后，當(dāng)P<0.0125有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

LMP是1982年Monaco在分析鼠MHC-Ⅱ類分子的免疫沉淀復(fù)合物時得到的產(chǎn)物，因其分子量較MHC-Ⅰ、Ⅱ類分子低而得名[16]?；蚯贸∈髮嶒炞C明了LMP2和LMP7的作用，在LMP2基因突變小鼠的CD8+T淋巴細(xì)胞水平降低至野生型小鼠的60%～70%[17]；在LMP7基因敲除小鼠中，細(xì)胞表面MHC Ⅰ類分子的表達(dá)水平適度降低至正常水平的55%～90%[18]。這些結(jié)果均表明LMP在抗原提呈過程中起著重要作用，LMP可以識別細(xì)胞內(nèi)感染，降解內(nèi)源性抗原肽，產(chǎn)生合適的C-端氨基酸殘基[5]，并通過MHC Ⅰ類分子和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞在人體免疫監(jiān)測中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因此LMP基因多態(tài)性可能會影響其自身功能的完整性，從而影響抗原的加工提呈，最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生[19]。

有研究發(fā)現(xiàn)LMP基因多態(tài)性與TB的發(fā)生發(fā)展具有關(guān)聯(lián)性，因此，本研究對LMP基因4個SNP位點的多態(tài)性與云南漢族人群TB病的發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個SNP位點的等位基因及基因型頻率在病例組和對照組中的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，進(jìn)行分層分析時發(fā)現(xiàn)，rs1351383的C等位基因頻率在肺外結(jié)核組中的頻率顯著高于對照組，在加性遺傳模式下攜帶rs1351383的C等位基因的有增加患肺外TB發(fā)生風(fēng)險的趨勢。進(jìn)一步的單倍型分析顯示rs1351383-rs17587-rs2127675-rs2071543單倍型C-G-G-G在病例組、肺外結(jié)核組中的頻率均顯著高于對照組。有研究報道，rs1351383的CC基因型顯著增加了黑色素瘤的患病風(fēng)險(CC vs AA：P=1.93×10-3,OR=1.590,95%CI為1.190～2.120)，rs1351383可能參與并影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合和LMP2基因的表達(dá)，從而影響黑色素瘤的易感性[20]。Wang等[21]在黎族人群肺TB的研究顯示：rs2071543的AA(P=0.002，OR=3.770，95%CI為1.600～8.890)和AC(P=0.0001，OR=2.970，95%CI為1.800～4.900)是肺TB發(fā)生的風(fēng)險性因素。在rs2071543與癌癥風(fēng)險相關(guān)性的薈萃分析中發(fā)現(xiàn)AA基因型的個體比具有CC基因型的個體患癌癥的風(fēng)險高2.6倍(AA vs CC：P= 0.001，OR= 2.602，95%CI為 1.780～0.803)，并在亞洲人群中觀察到罹患癌癥風(fēng)險顯著增加，但在白種人群中未發(fā)現(xiàn)rs2071543與癌癥的相關(guān)性[13]。rs17587的多態(tài)性可影響LMP2基因的功能也在青少年高血壓、多發(fā)性硬化癥、糖尿病和結(jié)核桿菌感染的研究中均有報道[20]。LMP在抗原提呈過程中發(fā)揮著重要作用，LMP基因突變將導(dǎo)致MHCⅠ類分子不能負(fù)載抗原肽，使MHC I類分子表達(dá)下調(diào)[4]。已知LMP2基因rs17587和LMP7基因rs2071543是錯義突變位點，研究表明rs17587和rs2071543的多態(tài)性會導(dǎo)致LMP的功能改變，從而削弱抗原加工能力，使細(xì)胞表面MHC I類分子和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的表達(dá)水平降低，影響自身免疫應(yīng)答導(dǎo)致機體免疫監(jiān)測失敗進(jìn)而影響機體對疾病的易感性[12,19]，因此LMP的異常表達(dá)會導(dǎo)致多種疾病和惡性腫瘤的發(fā)生。但本研究中未發(fā)現(xiàn)rs17587和rs2071543的基因型與TB病相關(guān)。造成上述各研究結(jié)果差異的原因可能是多態(tài)性位點的等位基因頻率在不同人群中的分布差異所導(dǎo)致，也可能與納入研究的樣本量或疾病類型有關(guān)。

綜上所述，云南漢族人群中LMP2基因的rs1351383-C等位基因及其構(gòu)建的單倍型rs1351383-rs17587-rs2127675-rs2071543單倍型C-G-G-G可能增加肺外TB的患病風(fēng)險。進(jìn)一步擴大樣本量研究及功能驗證，將為TB病的治療及預(yù)后提供新的依據(jù)。