肖志剛, 楊國強, 楊 舒, 段玉敏, 張雪萍, 邱天昊

(1. 沈陽師范大學 糧食學院, 沈陽 110034; 2. 沈陽大學 生命科學與工程學院, 沈陽 110044)

0 引 言

磷脂(phospholipids)是一種含有磷酸的混合物質,在植物與動物中普遍存在,是構成生物膜的基本組成成分,也是生命基礎不可缺少的物質。大量研究表明磷脂具有豐富的營養(yǎng)價值,可以降低膽固醇、加快脂肪代謝速率、預防高血壓與心血管等疾病,但是我國對磷脂資源開發(fā)與加工程度不太高,生產(chǎn)技術的不成熟使得磷脂的營養(yǎng)與功能價值利用低,造成大量磷脂資源的廉價與浪費[1]?？梢?充分利用開發(fā)高附加值磷脂的產(chǎn)品尤為重要,已有研究表明以磷脂形式提供的脂肪酸在嬰兒大腦中的轉化吸收效率是甘油三酯(TAG)的2.1倍,且以磷脂形式提供的脂肪酸在肝、肺、血漿和紅細胞中也更易于吸收,也有人證實其在體內(nèi)的生物利用度高于TAG[2-4]。因此功能性磷脂產(chǎn)品的開發(fā)及其生理功能的研究已引起研究人員的高度重視,如Peng等[5]用固定化脂肪酶Lipozyme TLIM催化合成富含功能性磷脂,Marsaoui等[6]用固定化脂肪酶催化合成了富含多不飽和脂肪酸的磷脂。Kim等[7]分別用游離與固定化LecitaseUltra酶催化DHA/EPA 和磷脂酰膽堿制備富含DHA/EPA的磷脂酰膽堿。然而,關于功能性磷脂的合成手段及其結構、組成、生理功能等方面的研究進展鮮有報道。因此,本文對功能性磷脂的合成方法、組成分析方法、生理功能的最新的研究方向做了詳細的論述與探討,期望能夠為今后磷脂的研究方向提供一些思路與想法。

1 功能性磷脂的概述與發(fā)展

功能性磷脂是利用現(xiàn)代酶技術對磷脂進行結構組成與位置的改性,通過新的分離技術手段將目標產(chǎn)物分離所得到的產(chǎn)品,使其中的脂肪酸組成及其位置分布被具有特殊生理功能的脂肪酸替代,使其具有特殊的生理功能與價值。大量研究表明,功能性磷脂具有促進大腦神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、提高記憶力、降血脂、降低膽固醇、抗衰老、預防癌癥等眾多生理功能[8-9]。具有特殊的生理功能的脂肪酸因其在脂肪中的分子形式不同而有差異。以磷脂形式存在的功能性脂肪酸,不僅同時具有磷脂和功能性脂肪酸的生理功能,而且結構更穩(wěn)定、不易于發(fā)生氧化反應,更有利于人體的吸收與利用。在食品、化妝品、醫(yī)藥等多個領域,具有重要的開發(fā)應用價值。近年來,隨著酶工程技術和脂肪酶技術的發(fā)展,以脂肪酶為催化劑通過化學反應獲得具有功能型磷脂的產(chǎn)品成為可能。如國外Vikbjerg等[10]以固定化脂肪酶LipozymeTLIM為催化劑,在有機溶劑正己烷體系中催化大豆磷脂與癸酸的酯化反應,生成癸酸型磷脂。Reddy等[11]利用2種固定化脂肪酶LipozymeTLIM和Novozym435催化軟脂肪酸、硬脂酸分別與蛋黃卵磷脂及大豆卵磷脂進行酯交換反應,分別生成軟脂肪酸磷脂與硬脂肪酸磷脂。Svensson等[12]采用5種脂肪酶為工具酶,以卵磷脂與烯酸為原料進行酸解反應并進行比較,反應合成烯酸磷脂,最大的合成率達到30%。歐美和日本等國家功能性磷脂的生產(chǎn)技術比較成熟與完善,對比我國對功能性磷脂的制備與生產(chǎn)才剛開始發(fā)展階段,許多生產(chǎn)技術還尚在研究階段。如潘麗等[13]用固定化脂肪酶Novozym435催化在有機溶劑中讓大豆卵磷脂與EPA、DHA進行酯化反應生成EPA和DHA型磷脂。張苓花等[14]也利用酶法合成了含EPA和DHA的卵磷脂。目前,我國所得功能性磷脂產(chǎn)品的生產(chǎn)技術還不成熟與完善,功能性磷脂產(chǎn)品的質量與含量都比較低,與市場需求還有差距,今后對功能性磷脂的發(fā)展還有比較大的提升空間與力度,在未來還有更多的方向有待開發(fā),也有更廣闊的發(fā)展前景。

2 功能性磷脂的酶法合成

2.1 底物的選擇

功能性磷脂的結構是包含磷酸根的甘油三酯的統(tǒng)稱,含有脂肪酸鏈團的基本甘油結構部分和必需的磷酸基團部分,其分子結構通式與大豆磷脂相近,不同之處在于甘油骨架上脂肪酸組成的不同,功能性磷脂主要指具有特殊生理功能性的脂肪酸,如:CLA、LNA、DHA/EPA、ARA等,合成功能性磷脂底物的選擇是非常重要的一個環(huán)節(jié)。如Ghosh等[15]利用脂肪酶催化豆蔻酸、癸酸、月桂酸、及亞麻酸甲酯與大豆磷脂發(fā)生酯化反應,生成不同的功能性磷脂,實驗結果說明底物選擇的脂肪酸分子量越大,酯交換反應過程與磷脂的結合效果會越好,得到底物選擇的脂肪酸影響酯交換反應合成產(chǎn)物的反應速率。杜俊民等[16]以亞麻酸乙酯為酰基供體與磷脂進行酯交換反應,酯交換反應亞麻酸的合成率達到20%,它們選擇了底物不同的亞麻酸乙酯和亞麻籽油分別與磷脂發(fā)生酯化反應,比較研究發(fā)現(xiàn)亞麻酸乙酯與磷脂的合成效率最高。為了高效合成富含特殊生理功能性的脂肪酸,通常選擇富含功能性不飽和脂肪酸油與磷脂酰膽堿含量豐富的大豆磷脂與蛋黃卵磷脂等作為反應底物,選擇不一樣的底物?；w與磷脂發(fā)生酯化反應,在同一脂肪酶的催化下,合成功能性磷脂的效果會不同,因此,想得到一種有營養(yǎng)價值、生理功效特別高的功能性磷脂,通常選擇富含特殊功能性脂肪酸的底物作為?；w的來源,但由于功能性脂肪酸的不飽和鍵比較多在空氣中易于氧發(fā)生反應變質,所以,選擇底物富含多不飽和的油脂直接作為?；w與磷脂發(fā)生酯交換反應效果會好。

2.2 催化劑的選擇

催化劑是指在反應過程中能夠使化學反應速率發(fā)生改變,但自身只起到催化作用,不發(fā)生任何改變的物質。催化劑種類特別多,其中包括催化酯交換反應的脂肪酶。脂肪酶在生物體內(nèi)中存在,組成以蛋白質為主,結構中以氨基酸構成催化結構體[17]。與物理、化學催化劑相比較,脂肪酶具有反應速率快,專一性強,來源廣泛,利于環(huán)保等優(yōu)勢。選擇合適的脂肪酶催化劑可以促進酯交換反應的速率,將磷脂與?；w更好地結合起來。如今,市場上生產(chǎn)與研究應用多的固定化脂肪酶主要有LipozymeRMIM、LipozymeTLIM與Novozyme435,隨著生物工程技術的出現(xiàn),從微生物、植物中能夠提取到新的脂肪酶的催化效果非常明顯,提取的成本也比較低,有希望能夠更好地應用到合成功能性磷脂的制備與研發(fā)中。如:孫瑞清等[18]在有機溶劑體系中用LipozymeTLIM脂肪酶為催化劑催化磷脂與癸酸的酯化反應最終得到癸酸的合成率為6.5%。班婷婷等[19]利用固定化脂肪酶LipozymeTLIM為催化劑,以大豆磷脂與棕櫚酸為原料,對反應溫度、反應時間、底物摩爾比、磷脂濃度、酶添加量、加水量等條件進行了單因素優(yōu)化,得到棕櫚酸合成率為35%。

在酶法催化合成功能性磷脂中,選擇合適的脂肪酶作為催化劑,需要考慮到對脂肪酶的催化效果,影響的因素主要有:反應溫度、反應時間、反應環(huán)境pH、反應溶劑、含水量。研究發(fā)現(xiàn),多數(shù)脂肪酶反應溫度最適宜的范圍在40-60℃,反應溫度的過高與過低都不利于脂肪酶的催化效果。反應時間也是脂肪酶催化效果好壞的重要組成因素之一,大多數(shù)脂肪酶的催化時間不低于18h,反應時間的長短能夠促進酶的催化效果,對于脂肪酶的反應環(huán)境pH值因脂肪酶的種類不同而不同,微生物的脂肪酶一般接近于中性,而在植物與動物中提取的一些脂肪酶偏向于酸性與堿性。在脂肪酶催化速率中反應溶劑的有無與多少,可以直接影響反應得率與速率,一般來說,在有機溶劑中能夠加快反應的速率,有機溶劑能夠增大酶與底物接觸面積,使反應更快地進行。含水量主要指酶自身的水分與加的水量,研究表明,含水量在占酶量的3%～10%范圍內(nèi),反應速率和產(chǎn)物得率保持在較高的水平。在選擇合適的脂肪酶的時候,酶自身的穩(wěn)定性也是特別重要的一環(huán),需要針對酶的穩(wěn)定性做出研究與分析,對脂肪酶反應因素的研究旨在為選擇合適的脂肪酶做出指導與幫助,以提高脂肪酶催化速率為前提,最終使得酯化反應的得率提高,以期為脂肪酶應用到生產(chǎn)中提供幫助與基礎[20-23]。

2.3 酶法合成功能性磷脂的分類

功能性磷脂的合成是指利用脂肪酶為催化劑,在一定反應條件下,以底物磷脂和提供脂肪酸的?；w為原料,經(jīng)過酯化反應后生成不同類型的功能性磷脂。功能性磷脂合成的酯交換反應種類可以分為以下2個方面。

1) 脂肪酶催化磷脂同脂肪酸與脂肪酸酯的酯交換反應

脂肪酸與脂肪酸酯直接作為提供脂肪酸的?；w,在酯交換反應中是十分有效和常見的。首先第一種情況是大部分的研究主要在磷脂和脂肪酸的酯化反應上,能夠得到組成成分與功能不同的改性磷脂,脂肪酸與磷脂之間的反應也叫磷脂的酸解作用。如今有大量的研究集中在引入多不飽和脂肪酸與磷脂發(fā)生的酸解反應。如曾朝喜等[24]研究了以固定化脂肪酶Lipozyme RMIM為工具酶,催化卵磷脂與共軛亞油酸進行酸解反應,最終得到產(chǎn)物共軛亞油酸磷脂中共軛亞油酸的含量達到24%。Mustranta等[25]利用2種新型微生物脂肪酶催化了磷脂酰膽堿和油酸進行酯化反應,比較無溶劑體系與有機溶劑體系下催化效果,得到油酸磷脂的油酸得率達到35%。另一種情況是脂肪酸酯提供酰基供體與磷脂發(fā)生酯交換反應,將具有特殊功能的多不飽和脂肪酸結合到磷脂的甘油骨架上,如Park等[26]在有機溶劑下,利用磷脂酶A2為催化劑,催化?；w烯酸乙酯與卵磷脂的發(fā)生酯交換反應,研究了反應溫度、底物摩爾比等反應條件對酯交換反應的影響,反應結束后含EPA磷脂的合成率達到14%。

一般來說,脂肪酶催化磷脂同脂肪酸與脂肪酸酯的酯交換主要以磷脂的甘油三酯骨架與游離不飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸酯為酰基供體作為反應物,在脂肪酶催化下發(fā)生了組成成分與結構的變化,最后再考察功能性磷脂的肪酸酸組成及其分布、結構特性以及確定最佳反應條件。

2) 脂肪酶催化磷脂和甘油三酯的酯交換反應

甘油三酯是指由甘油與脂肪酸結合形成的酯類物質,與脂肪酸相比分子量大,在酯交換反應過程中由于分子含量高,產(chǎn)生的空間阻力會比較強,這會對酯交換反應過程造成一定的影響。如今,對于國內(nèi)外研究甘油三酯與磷脂發(fā)生酯交換反應還不夠多,且主要研究集中于磷脂和動物魚油的酯交換反應過程中。如Totani等[27]以沙丁魚油和磷脂為反應底物,以新型Candidacylindracea脂肪酶為催化劑時,催化它們發(fā)生酯交換反應后,得到磷脂的合成率為45%。Wang等[28]利用脂肪酶Rhizomucormiehei催化卵磷脂與魚油進行酯交換反應,研究了反應溫度、酶添加量、底物摩爾比等反應條件對酯交換過程的影響,在優(yōu)化的最優(yōu)條件下EPA/DHA磷脂的合成率達16%。

Arboleda等[29]利用固定化脂肪酶LipozymeTLIM催化磷脂分別與亞麻籽油和石榴籽油進行酯交換反應,合成富含共軛亞油酸的磷脂,其合成率分別達到5%和11%。

與脂肪酸和脂肪酸酯相比,甘油三酯的來源非常豐富,甘油三酯來源于天然的油,如魚油、亞麻籽油等油料,甘油三酯與磷脂直接進行酯交換反應過程,可以縮短反應的過程,節(jié)約資源,保護環(huán)境。

2.4 功能性磷脂的結構與組成分析方法

功能性磷脂是一種含磷酸的復合脂質,其分子結構是由甘油、磷酸以及脂肪酸結合的化合物[30]。它的化學結構通式為

圖1 功能性磷脂的化學結構式FIg.1 Chemical structure of functional phospholipids

結構式中存在磷酸基團,R1和R2代表著不同脂肪酸組成,X基團則代表了功能性磷脂的不同種類。

功能性磷脂的種類繁多,甘油磷脂是最常見的功能性磷脂,包括磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰絲氨酸(PS)等以甘油為骨架構成的磷脂,功能性磷脂中的—X基團如表1所示

表1 功能性磷脂的種類Table 1 Types of functional phospholipids

在酶法合成功能性磷脂的基礎上,目標產(chǎn)物的檢測分析對控制目標產(chǎn)物的質量非常重要。目前,主要對功能性磷脂組成分析方法包括產(chǎn)物薄層色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法及核磁共振等方法。

1) 薄層色譜法(TLC)

薄層色譜法又叫薄板層析,是利用各組成成分在某一物質中的吸附與溶解能力的不同差異,經(jīng)過反復吸附與溶解的過程,使得各個目標成分都達到分離開。如郭勍等[31]利用硅膠薄層板將大豆磷脂組成成分分開,并對磷脂各個組成成分分析與含量的測定。薄層色譜法操作簡單,使用方便,結果見效快,直接觀察方便,特別適用于揮發(fā)性小的化學物質。對磷脂組成成分進行定性分析,對磷脂組成成分含量高低不太容易定量。

2) 高效液相色譜(HPLC)

高效液相色譜法又叫高分離度的液相色譜法,根據(jù)分離原理的不同可以分為液-液分配色譜法、吸附色譜法、離子交換色譜法等色譜法。分離磷脂的組成成分常采用的是液-液分配色譜法,其原理主要利用磷脂組分在流動相中的分配系數(shù)的大小來決定分離的順序。Hanson等[32]利用NH2色譜柱、流動相以有機溶劑進行梯度分離洗脫,將蛋黃中的磷脂組成進行分離開來,對分離的組成成分進行定量定性的分析。高效液相色譜法能使PC、LPC、PE、LPE分離得完全與徹底。它的優(yōu)勢在于應用范圍廣,分析速度快,反復使用、樣品不易破壞、易回收等,適用于沸點高,極性強,穩(wěn)定性差的有機溶劑分離。

3) 氣相色譜法(GC)

氣相色譜法是指利用某些物質在高溫下易揮發(fā)為氣體但不會分解的特性,將其進行分離與分析的方法。氣相色譜的作用主要在于測定化合物的純度與分離各混合物的組成成分,根據(jù)原理可以分為吸附色譜與分配色譜2大類,前者的固定相主要是氣-固,后者為氣-液。氣相色譜法可以用于酯交換反應合成功能性磷脂脂肪酸成分與含量的測定。如楊力會等[33]用脂肪酶催化甘三酯與磷脂酰膽堿酯交換的研究,通過氣相色譜法對改性后亞麻酸磷脂的脂肪酸成分測定。氣相色譜法具有分離效率高,速度快,靈敏度高,節(jié)約樣品,選擇性高,應用范圍廣等優(yōu)勢,缺點是在進行定性與定量分析時需要根據(jù)已知樣品進行對比分析與校正。

4) 核磁共振法(NMR)

核磁共振技術的優(yōu)勢在于簡便、成本相對較低、分析速度快等特點。對樣品不需要進行甲酯化衍生化處理,而且核磁共振法分析脂肪酸組成的結果與氣相色譜法是相似的,它是不會破壞樣品的處理方式。應用于對油脂樣品成分的分析,核磁共振氫譜是指根據(jù)樣品化學結構中全部氫原子的信息,去計算脂肪酸在樣品中的含量,可用于研究油脂的穩(wěn)定性差異,鑒別油脂質量的好壞、分析油脂脂肪酸組成成分、探討油脂氧化機理過程等方面,在對油脂脂肪酸組成及含量測定中,由于因為核磁共振氫譜峰強度與對應的氫原子數(shù)量存在線性關系。因此對于脂肪酸組成成分結果以摩爾百分含量表示。李添寶[34]利用核磁共振法定量分析植物油中多種脂肪酸組成含量。

近年來,對功能性磷脂組成成分檢測分析達到了分子水平。但目前對磷脂分析還存在好多的困難,主要存在以下4個方面:1)不同生物樣本中的磷脂缺乏一套標準的提取方法,會導致不同提取方法測定結果存在著偏差;2)針對磷脂異構體的分離仍存在很多困難;3)對磷脂組成分析的精準定量也難以實現(xiàn);4)對于磷脂中微量成分發(fā)揮關鍵作用的測定也存在很大的困難。針對上述問題,研究一套標準化的磷脂提取和鑒定方法尤為必要,優(yōu)化樣品預處理技術、提高生物樣品的分析與分離技術,增加質譜儀器性能等是今后對磷脂分析方法研究的主要方向。

2.5 功能性磷脂的生理作用

功能性磷脂是人體細胞的構成成分之一,對神經(jīng)、生長、發(fā)育、代謝、激素等都有重要的影響,在醫(yī)藥與保健方面都有很大的價值。當代社會生活的節(jié)奏緊張與壓抑,容易導致許多身體與心理的疾病,科學研究發(fā)現(xiàn)功能性磷脂能夠作為一種預防各種疾病的保健食品,且其沒有副作用,在疾病的預防方面有積極的作用[35]。它的生理作用主要有以下幾個方面:

1) 對神經(jīng)與大腦的發(fā)育有促進作用。功能性磷脂自身就是神經(jīng)細胞與大腦的組成成分之一,研究發(fā)現(xiàn)長期服用它能夠對精神異常者起到恢復作用,在作用過程中會轉化為乙酰膽堿,對患者起到精神煥發(fā)的作用。如江波等[36]發(fā)現(xiàn)磷脂能夠增強神經(jīng)結構與大腦細胞生長旺盛,減慢它們的衰老與退化。因此,功能性磷脂具有延緩衰老,增強大腦發(fā)育的作用,還能預防神經(jīng)性的疾病。

2) 對高血脂、高膽固醇、動脈硬化、心血管疾病有促進作用。功能性磷脂在人體內(nèi)是生物膜的組成成分,會參與到脂肪和膽固醇的運輸,能夠加快代謝速率,減少脂肪與膽固醇的沉積。如崔潔等[37]研究發(fā)現(xiàn)DHA型磷脂能夠降低肥胖小鼠脂肪與膽固醇的含量,將脂肪與膽固醇排出體外,維持體內(nèi)的生理平衡。所以,功能性磷脂具有降血脂,預防高血脂、高膽固醇、動脈硬化、心血管等疾病的醫(yī)用價值。

3) 對肝臟有積極作用?，F(xiàn)如今,人們生活水平越來越高,經(jīng)常性的飲酒與高脂肪的食物飲食,會導致各種肝功能破壞,引發(fā)各種疾病。功能性磷脂具有乳化作用,能夠保護肝細胞不易損壞。如嚴玉澄等[38]研究磷脂能夠提高細胞的活性和生長能力,提升身體各部分對疾病的抵抗功能。

4) 對調節(jié)心理方面有積極作用。近年來社會競爭激烈,人們會處在緊張與壓力的環(huán)境下,會導致一些神經(jīng)紊亂,出現(xiàn)焦慮、急躁、易怒、失眠等癥狀,長期在這種狀態(tài)下人特別容易崩潰。經(jīng)常食用功能性磷脂,能夠補充營養(yǎng)物質,提高大腦細胞的活性,減少疲勞,提升身體機能,保持心情的愉悅。如何卓儒等[39]研究發(fā)現(xiàn)磷脂能起到修復凋亡因子與細胞的作用。

5) 具有活化細胞的作用。它是構成細胞膜的重要組成成分,對于細胞內(nèi)外物質交換與吸收起著重大責任。人每天所消耗的功能性磷脂得不到充足的補給,細胞就會處于一種營養(yǎng)缺失狀態(tài),細胞能量就會減少,導致細胞失活。磷脂的來源必須從飲食中攝取足夠量,如果缺少了磷脂,特別是三四十歲以后,人的肝臟細胞就會由于缺少磷脂,而導致快速衰老,還有是它可以加快人體神經(jīng)細胞和大腦細胞之間的信息傳遞速度,主要由于它能增加包覆細胞薄膜的強度,使其不易受損,有利于乙?；鶊F進入細胞間隙與膽堿結合。如馬婷等[40]研究羅非魚頭磷脂具有顯著的抑制破骨前體細胞分化和促進破骨細胞凋亡的作用。

功能性磷脂的營養(yǎng)價值與生理功能還有待進一步的開發(fā)與研究。在未來隨著以后對它的持續(xù)關注,不斷完善它的提取,精制,制備的技術,能夠使它在食品、醫(yī)用、化妝品等行業(yè)中應用越來越廣泛。

3 展 望

功能性磷脂有營養(yǎng)與生理作用的價值,未來將會有廣闊的應用前景。近年來在食品、醫(yī)藥、化妝品方面對功能性磷脂產(chǎn)品的需求與日俱增,使得生產(chǎn)技術與制備方法不斷取得突破,合成功能性磷脂的工藝條件趨于成熟與完善。隨著磷脂的需求越來越多,從大豆和蛋黃中提取磷脂資源有限,也不能滿足市場需求,尋找提取磷脂原料顯得尤為重要,目前數(shù)量多、種類豐富、磷脂含量豐富的海產(chǎn)品能夠作為未來提取磷脂的良好資源。酶促酯交換法由于反應速率快,專一性強,產(chǎn)物高等特性,未來仍然是研究的重點方向。生物技術的進步與發(fā)展將會為合成功能性磷脂提供了更多,更全面的發(fā)展前景,基因技術、發(fā)酵技術、酶工程等生物技術將會成為未來的主要研究方向。相信在人們的共同努力作用下,能夠推動合成功能性磷脂的生產(chǎn)技術與制備方法的進步,未來功能性磷脂將以更高營養(yǎng)與生理作用價值應用在各行各業(yè)中,能夠為人類的健康提供治療與預防服務。