姜忠麗, 滿朝坤, 張 歡

(沈陽師范大學(xué) 糧食學(xué)院, 沈陽 110034)

0 引 言

糙米是營養(yǎng)豐富的全谷物之一,具有降低心臟病、心血管病、癌癥等慢性疾病的作用[1-4],研究表明,這與谷物中的酚類物質(zhì)有關(guān),如酚酸、黃酮、香豆素、單寧、花青素等[5-8]。目前國內(nèi)外關(guān)于有色稻米多酚的報(bào)道多為黑米、紅米與普通米之間的比較,關(guān)于綠色米的研究報(bào)道很少[9-11],尚未檢測出有關(guān)黑、紫、紅、黃、綠5種顏色稻米的集中比較。本試驗(yàn)選取同一產(chǎn)地的5種顏色糙米,在前期試驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面分析法得到超聲酶解提取糙米多酚的最佳工藝,并采用HPLC法分析糙米中10種酚類物質(zhì)的含量和組成,初步探索糙米多酚組成的品種間差異性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑、紅、綠、黃、紫糙米:購自陜西洋縣;纖維素酶(≥6 000 U/mg);沒食子酸、兒茶素、對羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、香豆素(色譜純):購自南京源值生物有限公司(純度≥98%);石油醚(沸程60～90 ℃);福林酚、磷酸、無水碳酸鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉(分析純);甲醇(色譜純)。

1.2 儀器與設(shè)備

ESJ120-4B電子天平:沈陽龍騰電子有限公司;UV-1200S型紫外分光光度計(jì):翱藝儀器(上海)有限公司;RRHP-200型萬能粉碎機(jī):歐凱萊芙寶業(yè)公司;DHG-9146A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;15A481超聲清洗機(jī):寧波新芝生物科技有限公司;Avanti J高效離心機(jī):貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司;SPD-16型高效液相色譜儀紫外-可見檢測器:島津儀器(蘇州)有限公司。

1.3 超聲酶解提取糙米多酚的工藝優(yōu)化

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

配置0.1 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL標(biāo)準(zhǔn)液,加入1 mL福林酚和2 mL的15%Na2CO3溶液,搖勻,定容,避光2 h后測760 nm處的吸光度。以沒食子酸質(zhì)量濃度和吸光度繪制標(biāo)曲,得回歸方程:

Y=0.109 3X+0.024 1,R2=0.999 4。

1.3.2 樣品測定

以黑色糙米為工藝優(yōu)化原料。將脫脂后的樣品加入一定比例的纖維素酶和pH5.4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,超聲提取后離心。取上清液0.5 mL,按標(biāo)曲制作方法測定樣品中總酚含量。按下式計(jì)算多酚提取量:

式中:C為樣液中多酚質(zhì)量濃度,(μg/mL);V1為稀釋體積,mL;V2為樣液體積,mL;V3為取樣體積,mL;M為樣品質(zhì)量,g。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果,以料液比、酶添加量、超聲時(shí)間和超聲功率為自變量,以多酚提取量為響應(yīng)值,利用Box-Behnken設(shè)計(jì)原理進(jìn)行四因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)因素和水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平編碼表Table 1 Horizontal coding table of response surface test design factors

1.4 HPLC法對糙米中10種酚類化合物含量的鑒定

1.4.1 混標(biāo)及樣品溶液的制備

配置2 mg/mL的10種標(biāo)準(zhǔn)品母液。分別吸取各母液6 μL混合并定容至10 mL,得1.2 μg/mL的混標(biāo)溶液,將其稀釋成0.1、0.2、0.4、0.8 μg/mL,冷凍保存。樣品多酚的提取同1.3.2,將上清液冷凍保存。所有樣品經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后,作為待測液。

1.4.2 色譜條件

色譜柱:C18柱(250 mm×4.6 mm);紫外檢測器,檢測波長280 nm;流動(dòng)相A(甲醇)∶B(0.2%磷酸水)=24∶76;流速1.0 mL/min;柱溫35 ℃;進(jìn)樣量10 μL;檢測時(shí)間40 min。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為5次重復(fù)試驗(yàn)的平均值,應(yīng)用Microsoft Excel 97-2003、Design Expert.V8.0.6.1 和IBM SPSS Statistics 22軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面工藝優(yōu)化試驗(yàn)

2.1.1 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

以料液比、酶添加量、超聲時(shí)間和超聲功率為自變量,以糙米多酚提取量為響應(yīng)值,進(jìn)行四因素三水平的Box-Behnken優(yōu)化試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-behnken experimental design and results

2.1.2 模型建立與顯著性分析

通過Design-Expert.V8.0.6.1軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,獲得響應(yīng)值與4個(gè)因素的二次多項(xiàng)式的回歸模型如下:

為檢驗(yàn)該模型的有效性,進(jìn)行方差分析及顯著性檢驗(yàn),結(jié)果見表3。

由表3知,因素A、B、C、A2、B2、C2、D2對響應(yīng)值的影響極顯著,且影響因素的大小順序?yàn)?B>A>C>D。交互項(xiàng)AD的影響極顯著,BD、CD表現(xiàn)為顯著。從整體分析,該模型P值<0.000 1,表示極顯著,失擬項(xiàng)P=0.101 4>0.05,不顯著,表示模型可靠。R2=0.971 3,說明該模型與實(shí)際結(jié)果的擬合度良好。Radj2=0.942 6,說明該模型在94.26%的程度上可以用于解釋試驗(yàn)結(jié)果[12]。

2.1.3 響應(yīng)面優(yōu)化分析

通過Design-Expert.V8.0.6.1軟件獲得各因素交互作用的響應(yīng)面圖,如圖1所示。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of variance of regression model

注： **差異極顯著(P≤0.01);*差異顯著(P≤0.05)。

圖1 各因素交互作用對多酚提取量的響Fig.1 Interaction of various factors on the extraction amount of polyphenols

由圖1(a)知,料液比與酶添加量的交互作用不顯著。料液比為1∶25時(shí),隨酶添加量的增加,多酚提取量先增加后趨于平穩(wěn)。當(dāng)料液比變化到1∶35時(shí),提取量為先上升后下降。

由圖1(b)知,料液比與時(shí)間的交互影響不顯著。隨時(shí)間延長多酚提取量先增加后略有降低,在10 min提取量最大。

由圖1(c)知,料液比與功率的交互作用極顯著。溶劑量與功率較小時(shí),多酚提取量隨溶劑和功率的增加而明顯增加,當(dāng)溶劑超過30 mL、功率大于350 W時(shí),提取量下降。

由圖1(d)知,酶添加量與時(shí)間的交互作用不顯著。隨著酶量增加和時(shí)間的延長,提取量先增加后變化不大,在5.0%酶用量和10 min時(shí)提取量最大。

由圖1(e)知,酶添加量和功率間的交互作用顯著。隨著酶量、功率的增加,多酚提取量明顯增加,在酶添加量5.0%、350 W時(shí)達(dá)到最大值,而后呈明顯下降趨勢。

由圖1(f)知,超聲時(shí)間與功率的交互作用顯著。在時(shí)間和功率均較小時(shí),提取量隨之增大而明顯提高,達(dá)到最大值后逐漸下降。

2.1.4 最佳工藝的優(yōu)化

通過Design-Expert.V8.0.6.1軟件得出黑糙米的最佳多酚提取工藝:料液比1∶31.33(g/mL)、酶添加量5.45%、超聲時(shí)間12.03 min、超聲功率342.54 W,預(yù)測值為5.319 mg/g。結(jié)合實(shí)際,將其調(diào)整為料液比1∶30(g/mL)、酶添加量5.5%、超聲時(shí)間12 min、超聲功率340 W,進(jìn)行5次平行驗(yàn)證試驗(yàn)得到的實(shí)際平均提取量5.318 mg/g。

2.1.5 不同顏色糙米的總酚含量

經(jīng)過試驗(yàn),表明黑色糙米多酚的最佳提取工藝亦適合其他4種糙米。對所有樣品進(jìn)行多酚提取及含量測定,得到5種顏色糙米的總酚含量為:黑色5.318 mg/g>紫色3.892 mg/g>紅色3.874 mg/g>黃色3.425 mg/g>綠色3.136 mg/g,說明糙米顏色越深,其多酚含量越高。

2.2 HPLC分析檢測結(jié)果

2.2.1 色譜分離效果

對2.1.5得到的糙米多酚提取液進(jìn)行HPLC分析。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的色譜圖如圖2所示。

注: 1—沒食子酸; 2—兒茶素; 3—對羥基苯甲酸; 4—綠原酸; 5—香草酸;6—咖啡酸; 7—丁香酸; 8—對香豆酸; 9—阿魏酸; 10—香豆素

圖2(a)～圖2(f)分別為混標(biāo)溶液、黑糙米、紫糙米、紅糙米、黃糙米和綠糙米的液相色譜圖。由圖2(a)可知,該色譜條件下10種多酚化合物能較好分離且峰形良好。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo),峰面積(mV)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到10種酚類化合物的回歸方程及線性關(guān)系如表4所示。

表4 線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 4 Linear regression equation and correlation coefficient

2.2.2 精密度試驗(yàn)

將同一混標(biāo)溶液按色譜條件進(jìn)樣3次,連續(xù)測定5d,按出峰時(shí)間記錄10種酚類化合物的峰面積,測得日內(nèi)RSD分別為0.56%、1.20%、1.01%、1.51%、0.93%、1.41%、1.04%、1.44%、1.30%和0.90%,日間RSD分別為0.43%、0.77%、1.77%、1.04%、3.14%、1.52%、2.73%、0.71%、6.04%、2.87%,均小于10%,表明該色譜條件精密度良好,符合測定要求。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將待測樣品溶液分別在0、2、4、6、8h按色譜條件進(jìn)樣分析,記錄峰面積,測得10種酚類化合物的RSD按出峰順序分別為8.37%、6.85%、4.34%、4.95%、6.86%、5.15%、5.68%、0(未檢測出,下同)、6.34%、0,均小于10%,樣品在8h內(nèi)穩(wěn)定性良好,可以進(jìn)行定量分析。

2.2.4 回收率試驗(yàn)

以黑色糙米為回收試驗(yàn)樣品。在已知濃度的樣品中加入一定量的混標(biāo)溶液,按色譜方法重復(fù)5次進(jìn)樣分析,計(jì)算加標(biāo)回收率和RSD值,如表5所示,10種標(biāo)準(zhǔn)品的回收率在83.67%～100.17%,RSD值在1.39%～7.71%,說明回收率較高,結(jié)果較準(zhǔn)確。

表5 回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of recovery test

注： ND表示未檢測出。下同。

2.2.5 樣品測定

樣品圖見圖2(b)～圖2(f),可明顯看出總峰面積、出峰數(shù)量與糙米顏色呈正相關(guān)。各酚酸含量計(jì)算結(jié)果見表6。5種糙米中均含有沒食子酸、綠原酸和阿魏酸,且沒食子酸含量顯著高于其他9種酚酸含量,范圍在202.7～392.71 μg/g。兒茶素含量在紅色、紫色和黃色糙米中較高,范圍在94.92～151.56 μg/g,在黑色和綠色糙米中未檢測到。香草酸主要存在于黑色和紫色糙米中。咖啡酸和丁香酸在糙米樣品中含量較少。對香豆酸和香豆素在5種糙米中均未檢測出?？芍獙τ谒鶛z10種酚酸化合物,不同顏色糙米含量各不相同,多酚組成和含量與糙米品種間存在顯著性差異。

本試驗(yàn)結(jié)果與一些研究者的研究結(jié)果類似,總酚含量表現(xiàn)為黑米>紅米>普通大米[13-15],與Rao S等[16]的研究結(jié)果中紅色米多酚含量>紫色>黑色不同,這可能是與不同生長條件、栽培技術(shù)、提取工藝等因素有關(guān)[7],有待進(jìn)一步研究。

表6 不同顏色糙米中酚類物質(zhì)含量Table 6 Contents of phenols in brown rice with different colors

注： 同一列內(nèi)不同小寫字母表示差異顯著性在5%水平(P<0.05)。

3 結(jié) 論

本試驗(yàn)超聲酶解法提取糙米多酚的最佳工藝為:料液比1∶30(g/mL)、酶添加量5.5%、超聲時(shí)間12 min、超聲功率340 W、超聲溫度55 ℃,方差分析及顯著性檢驗(yàn)表明該回歸模型有效。得到5種糙米的總酚含量大小依次為黑色5.318 mg/g>紫色3.892 mg/g>紅色3.874 mg/g>黃色3.425 mg/g>綠色3.136 mg/g,且多酚含量與糙米顏色之間呈正相關(guān)。HPLC法結(jié)果表明,不同顏色糙米的酚類物質(zhì)組成和含量各不相同。黑色糙米以沒食子酸、香草酸和綠原酸為主;紫色和紅色糙米以沒食子酸、兒茶素、香草酸和阿魏酸為主;黃色糙米以沒食子酸、兒茶素、對羥基苯甲酸為主;綠色糙米主要含沒食子酸,對羥基苯甲酸、綠原酸和阿魏酸含量較少,其余酚酸均未檢測出,可知綠色糙米的酚酸組成最簡單,含量也最少。此外SPSS分析結(jié)果表明5種糙米樣品的酚酸組成及含量之間具有不同程度的差異性。