李笑峰 張玲秀 趙二勞

(1.忻州師范學(xué)院化學(xué)系，山西 忻州 034000;2.忻州師范學(xué)院生物系，山西 忻州 034000)

纖維素能夠轉(zhuǎn)化為乙醇、可溶性糖以及一些其它工業(yè)化合物等可利用物[1]，而利用纖維素酶水解纖維素實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化是一條環(huán)保、高效、無(wú)污染的有效途徑[2]。在酒精發(fā)酵時(shí)添加纖維素酶可顯著提高酒精或白酒生產(chǎn)中的原料利用率[3]，利用纖維素酶分解農(nóng)作物秸稈可充分、有效利用農(nóng)作物秸稈。因此，纖維素酶的生產(chǎn)對(duì)人類(lèi)社會(huì)發(fā)展具有重要的意義。但纖維素酶生產(chǎn)周期長(zhǎng)、成本相對(duì)較高，且產(chǎn)率和活力相對(duì)較低，所以其工業(yè)化應(yīng)用受到限制[4]。因此，選育產(chǎn)生纖維素酶的新菌種，從而降低成本、提高纖維素酶產(chǎn)量和活力受到廣泛關(guān)注[5]。粗糙脈孢菌能夠合成纖維素酶、半纖維素酶和木質(zhì)素酶，同時(shí)可避免由纖維二糖積累引起的反饋抑制[6]。本研究在前期對(duì)粗糙脈孢菌產(chǎn)纖維素酶工藝優(yōu)化研究[5]的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究溫度、pH及金屬離子Zn2+、Mg2+、K+和Cu2+等對(duì)所產(chǎn)纖維素酶活力的影響，為深入研究粗糙脈孢菌產(chǎn)纖維素酶的機(jī)制及其工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料與試劑：粗糙脈孢菌(NeurosporacrassaQF)(實(shí)驗(yàn)室保存)，酒石酸鉀鈉，3,5-二硝基水楊酸，Sephadex G-75，葡萄糖，磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣、七水硫酸鐵和七水硫酸鋅等，均為國(guó)產(chǎn)分析純，蛋白胨、酵母浸粉和麥芽糖等為國(guó)產(chǎn)生化試劑。

儀器：UV-2102C型紫外分光光度計(jì)(尤尼柯上海儀器有限公司), PHSJ-5型pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司), HC-3018高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司),FA2004N電子天平(上海箐海儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌種活化

保存菌種連續(xù)轉(zhuǎn)接PDA試管斜面活化三次。

1.2.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用DNS法，并參考文獻(xiàn)[5]的方法繪制。

1.2.3粗酶液的制備

在250 mL的錐形瓶中裝入80 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基，接入5%菌種，在28 ℃、150 r/min的搖床中培養(yǎng)5天。取培養(yǎng)液于4 ℃高速離心10分鐘，上清液即為粗酶液。

1.2.4鹽析

按60%、70%和90%不同硫酸銨飽和度進(jìn)行分級(jí)沉淀，根據(jù)純化結(jié)果，分析比較出最佳硫酸銨液飽和度。

1.2.5層析

試驗(yàn)采取Sephadex G-75分子篩層析技術(shù)對(duì)酶進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。

1.2.6纖維素酶活力的測(cè)定

在酶催化下，每1 mL酶1 min產(chǎn)生0.01 mg葡萄糖定義為一個(gè)酶活單位。取層析后酶液1.0 mL，再加入1 cm×1 cm的濾紙片，加入0.5 mL pH4.8醋酸緩沖液，反應(yīng)30 min后，加入DNS溶液2 .0 mL，搖勻后沸水浴5 min，以10000 r/min 離心5 min，取上清液在波長(zhǎng)550 nm處測(cè)定吸光值。

1.2.7溫度對(duì)酶活力的影響

分別在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下測(cè)定纖維素酶活力，研究溫度對(duì)酶活力的影響。

1.2.8pH對(duì)酶活力的影響

分別在pH 4.0、4.4、4.8、5.2、5.6條件下，測(cè)定纖維素酶活力，研究pH對(duì)酶活力的影響。

1.2.9金屬離子Zn2+、Mg2+、Cu2+和K+離子濃度對(duì)酶活力的影響

酶反應(yīng)系統(tǒng)中調(diào)整各離子濃度分別為0.0 mg/mL、0.004 mg/mL、0.04 mg/mL、0.08 mg/mL、0.12 mg/mL、0.16 mg/mL、0.20 mg/mL，測(cè)定不同離子濃度下纖維素酶活力，研究離子及其濃度對(duì)酶活力的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，其吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)工作曲線如圖1。求得工作曲線方程為：A=0.504C-0.039 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.994 0。可知，在葡萄糖質(zhì)量濃度為0.2～1.2 mg/mL的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Standard curve glucose

2.2 鹽析和層析結(jié)果

測(cè)定不同飽和度的硫酸銨溶液分別沉淀粗糙脈孢菌所產(chǎn)胞外纖維素酶的活力，結(jié)果如圖2所示。由圖可知，70%飽和度硫酸銨溶液所得纖維素酶活力最高。

圖2 不同硫酸銨飽和度沉淀纖維素酶的活力Fig. 2 Activity of cellulase precipitated by different ammonium sulfate saturation

為了檢測(cè)所獲酶純度，將上述步驟獲得的纖維素酶，進(jìn)行透析脫鹽后再通過(guò)Sephadex G-75層析，如圖3所示其純度較好，重新收集40 min～87 min的收集液，再經(jīng)無(wú)水乙醇沉淀即獲得較純纖維素蛋白酶。

圖3 70%飽和度硫酸銨沉淀蛋白層析效果Fig. 3 Result of the chromatography of protein precipitated by ammonium sulfate at 70% saturation

2.3 溫度對(duì)纖維素酶活力的影響

分別選取30℃、40℃、50℃、60℃、70℃進(jìn)行酶的活力測(cè)定，研究溫度對(duì)所產(chǎn)纖維素酶活力的影響，結(jié)果如圖4?？梢?jiàn)溫度為50℃時(shí)，所產(chǎn)纖維素酶活力最強(qiáng)，與其他溫度相比有顯著差異(P< 0.05)。

圖4 溫度對(duì)纖維素酶活力的影響Fig. 4 Effect of temperature on cellulase activity

2.4 pH對(duì)纖維素酶活力的影響

酶的催化活力與環(huán)境pH有關(guān)，在pH分別為4、4.4、4.8、5.2和5.6時(shí)，測(cè)其酶的活力，結(jié)果如圖5。

圖5 pH對(duì)纖維素酶活力的影響Fig. 5 Effect of pH on cellulase activity

由圖5可知，隨著pH值的上升，纖維素酶活力呈先升后降趨勢(shì)，pH為4.8時(shí)，纖維素酶的活力最高。

2.5 金屬離子對(duì)纖維素酶活力的影響

測(cè)定金屬離子Zn2+、Mg2+、Cu2+和K+對(duì)纖維素酶活力的影響如表1。由表1可知，Zn2+、Mg2+和Cu2+對(duì)所產(chǎn)纖維素酶活力具有一定的抑制作用，且有劑量效應(yīng)。K+對(duì)纖維素酶活力具有一定的激活作用，在0.16 mg/mL時(shí)激活作用最強(qiáng)。一般來(lái)說(shuō)，金屬離子對(duì)纖維素酶活力的影響有兩種作用，即激活和抑制，原因可能是通過(guò)配位機(jī)理穩(wěn)定過(guò)渡態(tài)或引起pKa改變，對(duì)酶活力的促進(jìn)作用也可能是因?yàn)槠渑c酶活性中心結(jié)合后更易于纖維素的結(jié)合，增強(qiáng)水解效果，發(fā)揮了協(xié)助功能[7]。

表1 金屬離子對(duì)纖維素酶活力的影響

3 討論

我國(guó)作為一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，農(nóng)作物秸稈極為豐富，但由于處理費(fèi)用高且經(jīng)濟(jì)效益差，往往不能很好的利用。每年春季，農(nóng)田中焚燒秸稈造成嚴(yán)重的空氣污染。為了解決這一問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外目前采用首先將秸桿前期處理，即通過(guò)化學(xué)、物理、酶、微生物發(fā)酵等方法將其降解為次級(jí)產(chǎn)品，再經(jīng)酵母發(fā)酵最終生產(chǎn)乙醇等產(chǎn)品。其中秸稈前期處理首選酶法，因?yàn)槠渚哂泄I(yè)化程度高，降解效率高等優(yōu)點(diǎn)，但是酶相對(duì)價(jià)格較高、穩(wěn)定性差，導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高，制約了其的推廣應(yīng)用。研究?jī)r(jià)廉高效的纖維素酶生產(chǎn)成為人們極感興趣的課題。

本實(shí)驗(yàn)以一株粗糙脈孢菌為材料，其所產(chǎn)纖維素酶活力高于里氏木酶，具有一定的應(yīng)用潛能。通過(guò)對(duì)所產(chǎn)纖維素酶催化條件分析，以期提高其活力，降低其生產(chǎn)成本。

4 結(jié)論

經(jīng)硫酸銨分級(jí)鹽析，葡聚糖凝膠層析純化的粗糙脈孢菌所產(chǎn)纖維素酶，在溫度50℃、pH 4.8條件下，活力最高。Zn2+、Mg2+和 Cu2+抑制所產(chǎn)纖維素酶活力，K+可激活所產(chǎn)纖維素酶活力。