閆翠敏 張亞安 傅 巖 孫柏旺

(1.東南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，江蘇 南京 211189；2.東南大學(xué)成賢學(xué)院制藥與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210088；3.東南大學(xué)教務(wù)處，江蘇 南京 211189)

疲勞是體力勞動(dòng)或腦力勞動(dòng)后的一個(gè)生理過(guò)程，涉及工作能力和活力的顯著下降[1]。這可能是由于能量資源消耗、身體內(nèi)部環(huán)境紊亂等原因造成的[2]。當(dāng)今社會(huì)的快速發(fā)展，給人們的生活和工作帶來(lái)了巨大的壓力，疲勞已成為一種嚴(yán)重的現(xiàn)象[3]。因此，有必要找到有效的緩解疲勞的方法。

肉蓯蓉作為補(bǔ)腎、補(bǔ)陽(yáng)、補(bǔ)血的滋補(bǔ)藥，在我國(guó)已有2000多年的歷史[4]。藥理研究表明，它們具有抗氧化、清除一氧化氮自由基[5]、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗衰老[6]、改善性功能、抗炎、神經(jīng)保護(hù)等多種生物學(xué)活性[7-10]。此外，先前的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，肉蓯蓉的甲醇提取物可提高心肌ATP生成能力[11]。

淫羊藿是“補(bǔ)腎”、“補(bǔ)骨”的著名中藥[12]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，淫羊藿提取物的主要活性成分是多糖、黃酮苷類(lèi)、木脂素、萜類(lèi)和厚樸生物堿[13]，可用于治療骨質(zhì)疏松癥、心血管疾病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[14]、性功能障礙和炎癥等[15，16]。此外，淫羊藿經(jīng)常與肉蓯蓉一起使用，以提高其療效[17]。

?；撬崾侨梭w內(nèi)最豐富的游離氨基酸之一。它可以在幾乎所有的組織中發(fā)現(xiàn)，特別是心臟、大腦、視網(wǎng)膜、骨骼肌和血小板等[18]。牛磺酸的生理功能有結(jié)合膽汁酸、抗氧化、解毒、滲透調(diào)節(jié)、膜穩(wěn)定、神經(jīng)調(diào)節(jié)等[19，20]。

鋅是人體不可缺少的微量元素之一，幾乎存在于人體所有的活性酶中[21]。它可以通過(guò)維持金屬硫蛋白[22]來(lái)保護(hù)生物結(jié)構(gòu)免受自由基誘導(dǎo)的損傷。在免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)、傷口愈合等方面也發(fā)揮著重要作用[23]。葡萄糖酸鋅具有生物利用度高、易于吸收等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用。

根據(jù)中藥配伍的原則，我們研究的復(fù)方管花肉蓯蓉片是肉蓯蓉、淫羊藿、?；撬岷推咸烟撬徜\的全新組合，它綜合這四種組成成分的功效，能增強(qiáng)抗疲勞效果。本試驗(yàn)通過(guò)強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)，為復(fù)方管花肉蓯蓉片的抗疲勞性能評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

復(fù)方管花肉蓯蓉片由管花肉蓯蓉提取物(折合生藥材4.0 g/d)、淫羊藿提取物(折合生藥材4.0 g/d)、牛磺酸(0.4 g/d)、葡萄糖酸鋅(折合鋅10 mg/d)組成。片劑折合劑量為0.066 g/kg.Bw。

1.2 主要儀器和試劑

BS-420全自動(dòng)生化分析儀(深圳邁瑞)、UV紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、JD500-2電子天平。

試劑盒(南京建成賽浩科技有限公司)、生化分析試劑(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)等。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物分組及劑量確定

SPF級(jí)雄性昆明種小鼠，體重18～22 g[東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(陜)2012-003，SCXK(京)2012-0001]。選取預(yù)游泳姿勢(shì)正確的小鼠160只，隨機(jī)分為4個(gè)試驗(yàn)組，每組40只。各試驗(yàn)組均設(shè)三個(gè)劑量組和陰性對(duì)照組，每劑量組小鼠各10只。試驗(yàn)一組負(fù)重游泳試驗(yàn)，試驗(yàn)二組血清尿素氮試驗(yàn)，試驗(yàn)三組肝糖原試驗(yàn)，試驗(yàn)四組血乳酸試驗(yàn)。

因人體每日推薦量為4.0 g/60 kg.Bw(0.066 g/kg.Bw)，故稱(chēng)取1.98 g、1.32 g、0.66 g樣品，分別加蒸餾水至20 mL，混合均勻，定為高、中、低劑量組，另設(shè)陰性(蒸餾水)對(duì)照組。試驗(yàn)組經(jīng)口給予相應(yīng)劑量藥品(1次/天)，灌胃體積為20 mL/kg.Bw。陰性對(duì)照組給予等體積蒸餾水，連續(xù)灌胃30天。然后，分別進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.4 方法

1.4.1小鼠負(fù)重游泳試驗(yàn)

末次給藥30 min后，在小鼠尾根部負(fù)荷5%體重的鉛皮，置于游泳箱中游泳(水深35 cm，水溫25℃)。記錄各組小鼠自游泳開(kāi)始至死亡的時(shí)間(沉至游泳箱底并停止張口呼吸)，以及小鼠試驗(yàn)前后體重變化。

1.4.2小鼠血清尿素氮測(cè)定

末次給藥30 min后，不負(fù)重的情況下置于游泳箱中游泳90 min(水溫30℃)，休息60 min后眼球采血0.5 mL，離心15 min，血清用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行血清尿素氮測(cè)定。

1.4.3小鼠肝糖原測(cè)定

末次給藥30 min后處死，解剖取出肝臟，用生理鹽水清洗干凈，濾紙吸干后按試劑盒要求進(jìn)行肝糖原測(cè)定。

1.4.4小鼠血乳酸測(cè)定

末次給藥30 min后，不負(fù)重的情況下置于游泳箱中游泳10 min(水溫30℃)，于游泳前、游泳后及休息20 min后，各采血三次(內(nèi)眥采血，20μL)，測(cè)定血乳酸含量。血乳酸曲線下的面積(AUC)[24]根據(jù)以下公式計(jì)算：

Cs是血乳酸曲線下的面積。C0、C1和C2分別是游泳前、游泳后和休息20 min后小鼠的血乳酸濃度。

1.4.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

2 結(jié)果

2.1 對(duì)體重的作用

試驗(yàn)過(guò)程中及時(shí)記錄小鼠體重，如表1。與對(duì)照組相比，各劑量組體重變化無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表1 復(fù)方管花肉蓯蓉片對(duì)小鼠體重的作用Table 1 Effects of CCTs on the body weight of mice

2.2 對(duì)小鼠耐力的作用

由圖1可見(jiàn)，飼喂復(fù)方管花肉蓯蓉片高、中、低劑量組的小鼠游泳力竭時(shí)間均得到不同程度的延長(zhǎng)，其中高劑量組小鼠游泳力竭時(shí)間與陰性對(duì)照組相比，呈極顯著差異(P<0.01)，說(shuō)明高劑量組可以顯著提高游泳力竭時(shí)間，小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力顯著增強(qiáng)。

2.3 對(duì)小鼠血清尿素氮的作用

由圖2可見(jiàn)，相較于陰性對(duì)照組，飼喂復(fù)方管花肉蓯蓉片低劑量組小鼠的血清尿素氮有所下降，但下降無(wú)顯著性差異(P>0.05)。而高、中劑量組比陰性對(duì)照組的血清尿素氮稍有升高，仍無(wú)顯著性差異。這說(shuō)明復(fù)方管花肉蓯蓉片對(duì)運(yùn)動(dòng)小鼠的血清尿素氮含量的影響不顯著。

圖2 復(fù)方管花肉蓯蓉片對(duì)小鼠血清尿素氮的作用Fig. 2 Effects of CCTs on BUN level mice

2.4 對(duì)小鼠肝糖原水平的作用

由圖3可見(jiàn)，飼喂復(fù)方管花肉蓯蓉片的高、中、低劑量組小鼠的肝糖原含量比陰性對(duì)照組均有不同程度的增加。其中高劑量組肝糖原含量的增加相較于對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05)。

圖3 復(fù)方管花肉蓯蓉片對(duì)小鼠肝糖原含量的作用(*表示P<0.05)Fig. 3 Effects of CCTs on hepatic glycogen level of mice(*P<0.05)

2.5 對(duì)小鼠血乳酸含量的作用

由表2可見(jiàn)，飼喂復(fù)方管花肉蓯蓉片的高、中、低劑量組小鼠的三個(gè)時(shí)間點(diǎn)血乳酸曲線下面積均小于陰性對(duì)照組，且高劑量組與陰性對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05)。

血乳酸含量(mmol/L)對(duì)照組低劑量組中劑量組高劑量組游泳前6.69±0.816.63±0.326.13±1.236.22±1.14游泳后0 min9.51±1.229.72±0.929.03±0.838.24±0.74游泳后20 min8.21±0.837.73±0.447.82±0.757.63±1.26血乳酸曲線下面積259.27±24.92256.60±10.73245.04±20.84231.62±20.65*

注：與陰性對(duì)照組比較，*表示P<0.05。

3 討論

疲勞是運(yùn)動(dòng)后機(jī)體產(chǎn)生的一種復(fù)雜的應(yīng)激性反應(yīng)。運(yùn)動(dòng)耐力宏觀反應(yīng)了機(jī)體抗疲勞的能力，而負(fù)重游泳時(shí)間的長(zhǎng)短直接體現(xiàn)了運(yùn)動(dòng)耐力的情況，對(duì)評(píng)價(jià)抗疲勞和運(yùn)動(dòng)耐力有重要意義[25]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)方管花肉蓯蓉片高、中、低劑量組都不同程度地增長(zhǎng)了力竭時(shí)間，特別是高劑量組更是顯著性的延長(zhǎng)了小鼠的力竭時(shí)間，提示復(fù)方管花肉蓯蓉片可以顯著提高機(jī)體的運(yùn)動(dòng)耐力，延緩疲勞的產(chǎn)生。

為了進(jìn)一步研究復(fù)方管花肉蓯蓉片的抗疲勞性能，測(cè)定了幾種與疲勞相關(guān)的生化指標(biāo)—肝糖原、血乳酸和血清尿素氮。

文獻(xiàn)報(bào)道[26]，運(yùn)動(dòng)衰竭是伴隨糖原的耗竭產(chǎn)生的。當(dāng)劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，血糖和肌糖原的消耗急劇上升，這時(shí)肝糖原就會(huì)轉(zhuǎn)化為血糖以維持機(jī)體的血糖平衡，因此，肝糖原的含量是反映機(jī)體疲勞程度的敏感指標(biāo)之一。試驗(yàn)中，飼喂復(fù)方管花肉蓯蓉片的各劑量組肝糖原的含量明顯比對(duì)照組高，特別是高劑量組相較于陰性對(duì)照組有顯著性差異，提示復(fù)方管花肉蓯蓉片可以維持運(yùn)動(dòng)后肝糖原的含量，使機(jī)體有較好的能量?jī)?chǔ)備，減緩疲勞的產(chǎn)生。

劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，機(jī)體代謝加快，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物乳酸進(jìn)入血液使肌肉酸痛，因此血乳酸水平可以直接反應(yīng)機(jī)體的疲勞程度。試驗(yàn)結(jié)果顯示飼喂復(fù)方管花肉蓯蓉片的劑量組運(yùn)動(dòng)后血乳酸水平比陰性對(duì)照組低，且高劑量組相較于對(duì)照組有顯著性差異，提示復(fù)方管花肉蓯蓉片可以顯著降低機(jī)體運(yùn)動(dòng)后血乳酸水平，從而延緩疲勞的產(chǎn)生。

蛋白質(zhì)和氨基酸代謝分解為尿素，來(lái)不及排泄時(shí)，堆積在體內(nèi)，影響機(jī)體內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定，從而使機(jī)體感到疲勞[27]。因此血清尿素氮含量的高低也是評(píng)價(jià)機(jī)體疲勞的重要指標(biāo)[28]。但是，一般程度的運(yùn)動(dòng)蛋白質(zhì)參與很少，只有當(dāng)糖和脂肪代謝不足以為機(jī)體提供足夠的能量時(shí)，蛋白質(zhì)與氨基酸的分解代謝才會(huì)加強(qiáng)，以補(bǔ)充機(jī)體對(duì)能量的需求。試驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于陰性對(duì)照組，飼喂復(fù)方管花肉蓯蓉片的各劑量組的血清尿素氮含量沒(méi)有顯著性差異。可能復(fù)方管花肉蓯蓉片對(duì)機(jī)體運(yùn)動(dòng)后血清尿素氮的清除沒(méi)有太大影響或者是因?yàn)楦翁窃瓋?chǔ)備量的增加導(dǎo)致參與代謝的蛋白質(zhì)和氨基酸變化不大，這需要更多的試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

過(guò)度運(yùn)動(dòng)會(huì)破壞氧化和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡[29]。氧化應(yīng)激已被證明與疲勞有關(guān)。藥理研究表明，復(fù)方管花肉蓯蓉片的組分具有不同程度的抗氧化和自由基清除作用，因此，能有效緩解氧化應(yīng)激，使其具有抗疲勞作用。