王 羿，周 雪，聶毓恬，苓 麗，沈祥春，陶 玲*

0 引言

舒血寧注射液是由銀杏葉提取物精制而成的中藥注射劑，其活性成分主要包含黃酮苷、銀杏內(nèi)酯等，具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用，適用于冠心病、心絞痛、腦栓塞、腦血管痙攣、缺血性心腦血管等疾病的治療[1-3]，是臨床應(yīng)用較廣泛的中藥注射液之一。

近年來，隨著舒血寧注射劑在臨床中的廣泛應(yīng)用，其不良反應(yīng)也日益增多，嚴(yán)重影響治療效果[4]。研究顯示，該藥的不良反應(yīng)除了與患者個(gè)體差異、滴注速度、制備工藝、單次劑量和使用說明書外的方法有關(guān)外，還與配伍液配伍后引起穩(wěn)定性發(fā)生變化的因素有關(guān)[5-6]。目前，在舒血寧注射液與溶媒配伍后穩(wěn)定性的研究方面，既往研究主要集中于溶媒種類、放置時(shí)間的影響，且均是通過單因素來進(jìn)行考察，忽視了溫度、溶媒體積等因素的影響[7]。藥物的穩(wěn)定性受多種因素的影響，而對(duì)于多因素共同作用下舒血寧注射液溶媒配伍穩(wěn)定性研究至今未見文獻(xiàn)報(bào)道。

為了保證臨床用藥安全，提高成品輸液質(zhì)量，本課題采用單因素結(jié)合多因素設(shè)計(jì)，以槲皮素、異鼠李素、山奈素成分為指標(biāo)，優(yōu)選最佳調(diào)配方法，并考察該方案下配伍液0～4 h內(nèi)不溶性微粒數(shù)，為舒血寧注射液靜脈用藥的合理性提供數(shù)據(jù)支持，為調(diào)配后的輸液劑質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Ultimate 3000高效液相色譜儀(美國(guó)賽默飛公司)；ME104/02型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；UPW-UP-10型超純水機(jī)(成都天莘寧有限公司)；色譜柱：LP-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；GWF-5J智能微粒檢測(cè)儀(天河醫(yī)療儀器有限公司)；DZKW-4型電熱恒溫水浴鍋(上?？莆鲈囼?yàn)儀器廠)。

1.2 試劑 舒血寧注射液(規(guī)格：2 ml，黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：A04171004058)；槲皮素對(duì)照品(規(guī)格：20 mg，批號(hào)：HQ231704198，純度≥98%)，山奈素對(duì)照品(20 mg，批號(hào)：HA06211819，純度≥98%)，異鼠李素對(duì)照品(規(guī)格：20 mg，批號(hào)：HI086347198，純度≥98%)，均購(gòu)自寶雞市晨光生物科技有限公司；0.9%氯化鈉注射液(規(guī)格：100 ml，NS，批號(hào)：E218082702)、5%葡萄糖注射液(規(guī)格：100 ml，5%Gs，批號(hào)：E218020107)、10%葡萄糖注射液(規(guī)格：500 ml，10%Gs，批號(hào)：E17082403)，均購(gòu)自貴州科倫有限公司；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性 色譜條件：Ultimate?LP-C18柱(4.6 mm×250 mm，0.5 μm)，流動(dòng)相:甲醇(A)-0.3%磷酸(B)=53∶47，柱溫為35 ℃，流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm，進(jìn)樣量20 μl。

系統(tǒng)適應(yīng)性：在上述色譜條件下，槲皮素、異鼠李素、山奈素峰的出峰時(shí)間分別為9.7、17.5、32.9 min，理論塔板數(shù)按槲皮素計(jì)不低于8 000；相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，空白對(duì)照未見干擾，見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取槲皮素、異鼠李素、山奈素對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 ml含0.2 mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液1 ml于10 ml容量瓶中，加甲醇-0.3%磷酸(1∶1)混合溶液定容，制成每1 ml含20 μg的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 模擬舒血寧注射液臨床用量，精密量取舒血寧注射液及溶媒進(jìn)行配伍，將配伍液取2 ml放置于圓底燒瓶中，加甲醇-30%鹽酸(3∶1)混合溶液4 ml，85 ℃回流60 min，冷卻至室溫，將所得液體吸入10 ml容量瓶中，甲醇定容，得供試品溶液。

2.2.3 空白對(duì)照溶液的制備 未加舒血寧注射液的溶媒按照供試品溶液制備方法制備所得。

2.3 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下各對(duì)照品溶液，分別置于5 ml容量瓶中，用甲醇-0.3磷酸(1∶1)混合溶液定容。此時(shí)濃度分別為：槲皮素0.24、0.48、0.96、1.92、3.84、7.68 mg/L，異鼠李素0.16、0.32、0.64、1.28、2.56、5.12 mg/L，山奈素0.56、1.12、1.68、2.24、2.8、3.36 mg/L。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以對(duì)照品濃度(X，mg/L)為橫坐標(biāo)，各色譜峰的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。結(jié)果表明，槲皮素、異鼠李素、山奈素的濃度在各自范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。見表1。

表1 3種成分的回歸方程與線性范圍

2.4 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下各對(duì)照品溶液適量，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣，測(cè)定6次，記錄色譜峰面積。結(jié)果顯示，槲皮素、異鼠李素、山奈素色譜峰RSD分別為1.5%、1.7%、2.6%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取舒血寧注射液20 ml，分別加入100 ml的5%Gs、10%Gs、NS中，按“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，取各溶液于0、2、4、6、8、24 h按照色譜條件依次進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，6 h及之前測(cè)量時(shí)，各成分RSD均在要求范圍內(nèi)；6 h后，5%Gs中山奈素RSD為5.5%，大于要求范圍，故供試品溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.6 加樣回收率試驗(yàn) 用5%Gs、10%Gs、NS分別配制9份主要成分含量已知的溶液，分別加入低、中、高(50%、100%、150%)3個(gè)不同劑量的對(duì)照品，各3份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確可靠。見表2。

表2 加樣回收率檢測(cè)結(jié)果(n=3)

2.7 含量測(cè)定

2.7.1 正交試驗(yàn) 以槲皮素、異鼠李素、山奈素含量為考察指標(biāo)，選擇溫度、溶媒種類和溶媒體積3個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平按L9(34)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表3。

表3 因素水平表

2.7.2 含量測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果及方差分析 精密吸取舒血寧注射液，按表3正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和表4試驗(yàn)方案安排試驗(yàn)，將所得配伍液按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，分別進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積并計(jì)算相對(duì)含量。以槲皮素、異鼠李素、山奈素相對(duì)含量為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用主觀權(quán)重系數(shù)法來進(jìn)行權(quán)重系數(shù)分配。根據(jù)各指標(biāo)對(duì)注射液藥效貢獻(xiàn)的大小給予權(quán)重系數(shù)分配，均為1/3。結(jié)果見表4，方差分析見表5。

結(jié)果表明，各因素對(duì)舒血寧注射液與溶媒配伍穩(wěn)定性的影響均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，影響大小為C>A>B，確定最佳配伍方案為A2B1C2，即溫度25 ℃，5%Gs注射液250 ml作為溶媒。

2.8 驗(yàn)證試驗(yàn) 按照正交試驗(yàn)優(yōu)選的配伍條件，配制3份供試品溶液，分別于0、2、4、6、8 h測(cè)定槲皮素、異鼠李素、山奈素相對(duì)含量(以表4中各成分最高含量為100%計(jì))，結(jié)果見表6。0 h測(cè)量結(jié)果表明，選出的配伍方案穩(wěn)定，重現(xiàn)性良好；4 h后測(cè)量，槲皮素和山奈素的相對(duì)含量下降超出10%。

2.9 不溶性微粒檢測(cè) 按照2015年版《中國(guó)藥典》四部微粒檢查法中的光阻法[8]，用智能微粒檢測(cè)儀檢查不溶性微粒。

2.9.1 空白試驗(yàn) 根據(jù)正交試驗(yàn)優(yōu)選的配伍條件，取舒血寧注射液和5%Gs，各3份測(cè)定其不溶性微粒，取平均值。結(jié)果見表7，表明本次試驗(yàn)所用注射液和溶媒均符合規(guī)定。

2.9.2 樣品溶液微粒測(cè)定 根據(jù)配伍方案制備供試品溶液，于4 h內(nèi)進(jìn)行不溶性微粒檢測(cè)，每個(gè)供試品重復(fù)3次，取平均值，結(jié)果見表7。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

注：以各成分最高含量為100%計(jì)算相對(duì)含量

表5 方差分析

注：F0.05(2,2)=19，F(xiàn)0.01(2,2)=99

結(jié)果表明，4 h內(nèi)配伍液的不溶性微粒數(shù)無明顯變化，均符合臨床用藥要求。結(jié)合“2.8”項(xiàng)下結(jié)果，為保證臨床用藥的有效性及經(jīng)濟(jì)性，建議臨床對(duì)舒血寧注射液與5%Gs配伍的使用最好是在4 h內(nèi)滴完。

表6 不同時(shí)刻各主要成分含量(n=3)

注：A.槲皮素，B.異鼠李素，C.山奈素

表7 兩藥配伍前后不同時(shí)間點(diǎn)不溶性微粒數(shù)(n=3，個(gè)/ml)

3 討論

中藥注射液的穩(wěn)定性與其臨床應(yīng)用密切相關(guān)[9]。中藥注射液成分復(fù)雜，穩(wěn)定性低，當(dāng)與溶媒配伍后，容易發(fā)生氧化、水解、聚合反應(yīng)，或者由于配伍引起pH值變化而析出，形成不溶性微粒，導(dǎo)致有效性及安全性均受影響，從而影響臨床用藥，所以對(duì)于中藥注射液使用的溶媒選擇及配伍后的存放要求較高[10-11]。

本試驗(yàn)首先通過多因素的正交試驗(yàn)得出，對(duì)于舒血寧配伍液中3個(gè)主要成分含量，溶媒體積、溫度、溶媒種類對(duì)其影響均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中溶媒體積的影響最大。初步優(yōu)選的配伍條件為25 ℃下用5%Gs 250 ml配制。在此基礎(chǔ)上，單因素考察放置時(shí)間對(duì)有效成分含量的影響。依據(jù)《藥品注射劑使用指南》2008年版有關(guān)規(guī)定，在靜脈注射液中大于10%的有效成分被分解，則認(rèn)為該藥品與輸液不宜配伍。結(jié)果顯示，舒血寧注射液在與5%Gs配伍4 h后，其有效成分含量下降超出10%，說明4 h后的配伍液不穩(wěn)定，建議該配伍液在4 h內(nèi)滴注完畢。最后，通過檢測(cè)4 h內(nèi)優(yōu)選配伍條件下供試品溶液的不溶性微粒數(shù)量，結(jié)果顯示，4 h內(nèi)溶液不溶性微粒在藥典規(guī)定的范圍內(nèi)，說明該配伍滿足注射液質(zhì)量要求。

綜上所述，對(duì)于臨床舒血寧注射液使用最優(yōu)配伍方案為25 ℃下用5%Gs 250 ml配制，建議4 h內(nèi)使用完畢。該方案與藥品說明書基本一致，所以在藥品使用過程中，應(yīng)該嚴(yán)格按照說明書用藥，尤其是老年患者，大多數(shù)具有多種疾病，臟器功能減弱，對(duì)藥物代謝能力差，更易發(fā)生不良反應(yīng)[12-13]。

本試驗(yàn)通過多因素的正交試驗(yàn)結(jié)合單因素優(yōu)選配伍方案，避免了因單因素考察而忽略多因素之間的共同作用。雖然說明書有明確的配伍方案，但臨床上很多醫(yī)生并沒有按照說明書使用該藥而引起不良反應(yīng)，也可能影響其療效。本文除了對(duì)說明書上的使用方法提供科學(xué)依據(jù)以外，還補(bǔ)充了說明書上沒有的配伍后最佳使用時(shí)間的范圍，為該藥臨床使用的安全性及有效性提供了一定的參考價(jià)值，指導(dǎo)臨床醫(yī)務(wù)人員合理用藥，減少不良反應(yīng)的發(fā)生，同時(shí)在一定程度上也降低了醫(yī)務(wù)人員對(duì)患者疾病治療上的難度，利于治療時(shí)間的縮短，降低患者治療成本。