王慶哲，張恩崇，宋永勝

0 引言

前列腺癌是發(fā)生于前列腺的上皮來(lái)源的惡性腫瘤，在男性惡性腫瘤中發(fā)病率最高[1]。前列腺癌具有高度異質(zhì)性，表現(xiàn)形式多種多樣，包括低度惡性、局部侵襲性以及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移性。雖然該疾病在絕大多數(shù)情況下表現(xiàn)為低度惡性，但是對(duì)患者的長(zhǎng)期健康具有不可忽視的危害[2-4]。對(duì)于局部前列腺癌，主要的治療手段有主動(dòng)監(jiān)測(cè)、手術(shù)以及放化療。為了減少?gòu)?fù)發(fā)，術(shù)后患者將接受雄激素去勢(shì)治療 (Androgen deprivation therapy,ADT)或者放療[5]。對(duì)于發(fā)生轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者，早期使用化療之后進(jìn)行ADT治療是主要的臨床選擇[6]。然而，當(dāng)患者接受ADT治療12個(gè)月之后病情往往會(huì)發(fā)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌 (Castration-resistant prostate cancer，CRPC)[7]。目前，阿比特龍和恩雜魯胺是全球公認(rèn)用來(lái)治療CRPC的藥物，但是治療效果并不理想[8]。因此，針對(duì)目前前列腺癌治療過(guò)程中面臨的挑戰(zhàn)，探索新型的治療靶點(diǎn)具有十分重要的意義[9]。

枸杞可以抑制PC-3細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)，促進(jìn)PC-3、DU-145細(xì)胞凋亡[10]。甘草可誘導(dǎo)LNCaP細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡蛋白酶依賴和自噬相關(guān)細(xì)胞的凋亡[11]。姜黃素是姜黃的一種天然成分，可以通過(guò)抑制H3K4me3以及JNK通路從而誘導(dǎo)LNCaP細(xì)胞的凋亡[12]。

本研究使用BATMAN-TCM (a Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine) 數(shù)據(jù)庫(kù)分別預(yù)測(cè)了枸杞、甘草、姜黃3種藥材所含化合物作用的靶蛋白[13]。從TCGA (The Cancer Genome Atlas Program) 數(shù)據(jù)庫(kù)下載前列腺癌患者的RNA-seq數(shù)據(jù)，篩選出腫瘤和癌旁組織間的差異表達(dá)基因(Differentially expressed genes, DEGs)。然后對(duì)之前3類(lèi)藥材都作用的靶蛋白基因和DEGs取交集，作為研究的候選核心基因。根據(jù)作用化合物的多少在Cytoscape 3.7.1中篩選出核心基因[14]。隨后對(duì)核心基因進(jìn)行生存分析，發(fā)現(xiàn)GRIN3A基因高表達(dá)提示患者的無(wú)病生存時(shí)間(Disease-free survival，DFS)更短。之后通過(guò)單基因GSEA (Gene Set Enrichment Analysis) 分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)GRIN3A高表達(dá)時(shí)，PI3K-Akt信號(hào)通路被激活[15-16]。該研究一方面從分子機(jī)制方面再次證實(shí)了枸杞、姜黃、甘草對(duì)前列腺癌治療的有效性，另一方面，也為前列腺癌的精準(zhǔn)靶向治療提供了一個(gè)新的研究靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 預(yù)測(cè)枸杞、甘草、姜黃的共同作用靶向蛋白 BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)是第1個(gè)研究傳統(tǒng)中藥分子機(jī)制的在線生物信息學(xué)分析工具。該數(shù)據(jù)庫(kù)可以預(yù)測(cè)中藥的潛在靶向蛋白，并對(duì)預(yù)測(cè)到的靶蛋白基因進(jìn)行Gene Ontology (GO) 分析以及 KEGG 通路功能富集分析[13]。在分別查詢枸杞、姜黃、甘草3類(lèi)藥材的靶基因后，我們選取三者共有的靶基因進(jìn)行后續(xù)核心基因的研究。

1.2 通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析差異表達(dá)基因 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù) (https://portal.gdc.cancer.gov/)是一個(gè)癌癥基因組學(xué)項(xiàng)目，從基因分子水平上展示了33種癌癥的2萬(wàn)多例原發(fā)性腫瘤及其配對(duì)癌旁組織樣本[13]。筆者從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載了前列腺癌患者的RNA-seq數(shù)據(jù)，然后在R 3.5.2 中使用DESeq2 R包處理RNA-seq數(shù)據(jù)，獲得腫瘤樣本和正常癌旁組織間的差異表達(dá)基因(DEGs)[17]。

1.3 對(duì)DEGs進(jìn)行功能富集分析 為了更好地理解前列腺癌的生物學(xué)行為，我們對(duì)前列腺癌中分析獲得的DEGs進(jìn)行了GO分析和KEGG通路富集分析。作為21世紀(jì)以來(lái)具有代表性的生物信息學(xué)分析工具，GO分析和KEGG通路富集分析通過(guò)大量的基因集合鎖定和該基因集相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程[18]。GO分析包括細(xì)胞組件 (Cellular component,CC)、生物過(guò)程 (Biological process,BP)、分子功能 (Molecular function,MF)。KEGG分析主要從信號(hào)通路方面解釋問(wèn)題，通過(guò)R 3.5.2 中的 clusterProfiler 軟件包實(shí)現(xiàn)[19]。我們選擇GO分析以及KEGG分析中排名前10位的項(xiàng)目。

1.4 通過(guò)Cytoscape篩選候選核心基因 既出現(xiàn)在DEGs又是枸杞、姜黃、甘草共同靶點(diǎn)的基因具有深度探索的生物學(xué)意義，因此，筆者對(duì)DEGs集合和3種藥材共同靶基因集合選取交集，將這類(lèi)基因稱作候選核心基因。將這些候選核心基因及通過(guò)BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)作用它們的化合物輸入到 Cytoscape 3.7.1 軟件中[14]。通過(guò)該軟件中的 CentiScaPe 2.2 插件計(jì)算出每一個(gè)基因的中心度，在網(wǎng)絡(luò)分析研究中，具有較高中心度的節(jié)點(diǎn)被認(rèn)為在網(wǎng)絡(luò)中具有重要意義。因此，我們選擇中心度排名前3位的基因作為候選核心基因。

1.5 利用GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia.cancer-pku.cn/)篩選核心基因 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)交互在線網(wǎng)頁(yè)，收集了TCGA項(xiàng)目和GTEx項(xiàng)目的基因組數(shù)據(jù)并利用廣泛認(rèn)可的生物信息學(xué)方法分析數(shù)據(jù)。我們將候選基因輸入到GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)行生存分析，檢驗(yàn)這些基因?qū)颊叩臒o(wú)病生存期 (Disease-free survival，DFS)是否具有提示作用，從而確定要研究的核心基因。

1.6 單基因GSEA分析確定核心基因相關(guān)的信號(hào)通路 為進(jìn)一步探索核心基因的生物學(xué)行為，我們通過(guò)單基因GSEA分析探索核心基因相關(guān)的信號(hào)通路。使用R 3.5.2 中的 clusterProfiler 軟件包進(jìn)行GSEA分析[19]，并用R 3.5.2 的DESeq2 軟件包獲取每個(gè)基因在腫瘤組織和正常癌旁組織間的差異倍數(shù)的對(duì)數(shù) (Logarithmic fold change,LFC)，將每個(gè)基因的LFC作為GSEA分析過(guò)程中的排序依據(jù)。從Molecular Signatures Database v7.0 (http://software.broadin stitute.org/gsea/msigdb/index.jsp) 中選擇C2 (curated gene sets) 作為分析用的基因集[15,20]。

1.7 COX回歸檢驗(yàn)核心基因能否成為前列腺癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素 為了探究核心基因能否成為前列腺癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素，首先對(duì)納入的各項(xiàng)臨床因素及核心基因的表達(dá)量進(jìn)行單因素COX回歸，然后選擇在單基因COX回歸中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)進(jìn)行多因素COX回歸，從而確定要研究的核心基因的生物學(xué)意義。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 在使用靶蛋白基因?qū)﹁坭健⒏什?、姜黃進(jìn)行GO分析以及 KEGG 通路功能富集分析時(shí)，設(shè)定P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在篩選DEGs過(guò)程中，設(shè)定P<0.05、|LFC|>2為篩選標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)DEGs進(jìn)行GO分析和KEGG通路富集分析時(shí)，設(shè)定P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。生存分析、單因素COX回歸、多因素COX回歸以及單基因GSEA分析中，均設(shè)定P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)枸杞、姜黃、甘草的分析結(jié)果 本研究分別對(duì)枸杞、甘草、姜黃在BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶蛋白的預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)枸杞含有90種化合物，956個(gè)靶蛋白；姜黃含有55種化合物，677個(gè)靶蛋白；甘草含有172種化合物，685個(gè)靶蛋白。3種藥材共有的靶蛋白為180個(gè)，見(jiàn)圖1。3種藥物的GO分析以及KEGG通路富集分析結(jié)果見(jiàn)圖2。從整體來(lái)看，結(jié)果表明，這3類(lèi)藥物與細(xì)胞的增殖以及死亡相關(guān)。

圖1 甘草、枸杞和姜黃靶向蛋白

2.2 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)篩選DEGs 從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載了539個(gè)樣本的RNA-seq數(shù)據(jù)，其中腫瘤樣本488個(gè)，癌旁樣本51個(gè)。提取出樣本中19 466個(gè)蛋白編碼基因的表達(dá)數(shù)據(jù)。經(jīng)過(guò)R 3.5.2 的DESeq2 R包處理后，得到649個(gè)DEGs。

2.3 DEGs的功能富集分析 對(duì)篩選得到的649個(gè)DEGs進(jìn)行GO分析和KEGG通路富集分析，選取每項(xiàng)排名前10位的項(xiàng)目，見(jiàn)圖2B。

GO分析中：BP方面提示DEGs主要與內(nèi)肽酶活性的負(fù)調(diào)控、甲狀腺激素代謝過(guò)程、肽酶活性的負(fù)調(diào)控、甲狀腺激素生成、調(diào)節(jié)甲狀腺激素的產(chǎn)生等方面相關(guān)；CC方面說(shuō)明，DEGs主要分布在乳糜微粒、質(zhì)膜頂端、高密度脂蛋白顆粒、血漿脂蛋白顆粒、血液微粒、蛋白脂質(zhì)復(fù)合體、極低密度脂蛋白顆粒、富含三酰甘油血漿脂蛋白顆粒、細(xì)胞頂端；MF方面揭示，DEGs主要與肽鏈內(nèi)切酶抑制劑活性、肽酶抑制劑活性、肽鏈內(nèi)切酶調(diào)節(jié)物活性、肽酶調(diào)節(jié)活性、近端啟動(dòng)子DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活子活性、酶抑制劑活性、半胱氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑的活性、鉀離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性、轉(zhuǎn)錄因子活性相關(guān)。綜上所述，通過(guò)GO分析，可以推測(cè)前列腺癌的發(fā)生過(guò)程主要與肽酶活性的抑制、內(nèi)分泌系統(tǒng)的激活以及DNA轉(zhuǎn)錄的調(diào)控相關(guān)，與前列腺癌相關(guān)的DEGs主要分布在血液脂蛋白顆粒中。KEGG通路富集分析表明，DEGs主要富集在藥物代謝通路(細(xì)胞色素P450及其他酶)、甾體類(lèi)激素生物合成、花生四烯酸代謝、視黃醇代謝、戊糖、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換、谷胱甘肽代謝、抗壞血酸和醛酸代謝、卟啉和葉綠素代謝等細(xì)胞通路。

2.4 通過(guò)化合物及作用靶蛋白網(wǎng)絡(luò)篩選候選核心基因 對(duì)3種藥物共同作用的靶蛋白基因和DEGs取交集，獲得了11個(gè)基因。這些基因既是3種藥物共同作用的靶基因，同時(shí)，其在腫瘤組織和癌旁組織之間的表達(dá)又存在顯著性差異，認(rèn)為這11個(gè)基因有繼續(xù)挖掘的價(jià)值。將這11個(gè)基因(PTGS2,GRIN3A,CACNA1D,PTGS1,SLC18A3,SCN11A,CYP19A1,CRP,CHRM2,CHRNA4,GATA3)及作用它們的化合物輸入到Cytoscape 3.7.1 中構(gòu)建分析網(wǎng)絡(luò)，然后得到每個(gè)基因在網(wǎng)絡(luò)中的中心度，結(jié)果見(jiàn)表1。根據(jù)結(jié)果，選擇Degree排名前3位的基因(PTGS2,GRIN3A,CACNA1D)作為候選核心基因。

表1 候選核心基因在相互作用網(wǎng)絡(luò)中的中心度

圖2 對(duì)于DEGs行GO分析和KEGG通路富集分析

2.5 生存分析篩選核心基因 在GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中，對(duì)PTGS2、GRIN3A、CACNA1D3個(gè)候選核心基因進(jìn)行生存分析。結(jié)果見(jiàn)圖3。當(dāng)GRIN3A基因高表達(dá)時(shí)，前列腺癌患者的無(wú)病生存時(shí)間顯著縮短，提示GRIN3A基因?qū)τ诨颊卟涣碱A(yù)后具有促進(jìn)作用。結(jié)果顯示,其他基因與患者生存結(jié)局的關(guān)系并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此，選定GRIN3A為本研究的核心基因。

2.6 對(duì)GRIN3A基因進(jìn)行單基因GSEA分析 為了探索核心基因GRIN3A相關(guān)的生物學(xué)事件，使用來(lái)自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)539個(gè)前列腺癌樣本的RNA-seq數(shù)據(jù)，其中腫瘤樣本488個(gè)，癌旁樣本51個(gè)。根據(jù)GRIN3A的表達(dá)量水平，選取表達(dá)量前1/4的樣本作為高表達(dá)組，表達(dá)量后1/4的樣本作為低表達(dá)組。然后利用R 3.5.2 中的DESeq2 軟件包分析了19 466個(gè)蛋白編碼基因在高表達(dá)組與低表達(dá)組之間差異表達(dá)的LFC。LFC作為單基因GSEA分析中基因列表排列順序，從Molecular Signatures Database v7.0 (http://software.broadin stitute.org/gsea/msigdb/index.jsp) 中選擇C2 (curated gene sets) 作為分析用的基因集。見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示，脂肪酸代謝、鈣離子信號(hào)通路、腫瘤中的信號(hào)通路在高表達(dá)組中激活；RNA降解、凋亡信號(hào)通路被抑制。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了GRIN3A在前列腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要性。

2.7 COX回歸檢驗(yàn)GRIN3A基因是否可以成為患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo) 為了進(jìn)一步探索GRIN3A基因的生物學(xué)意義，我們獲取了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)485位前列腺癌患者的臨床病理數(shù)據(jù)，見(jiàn)表2。在單因素COX回歸中，Gleason評(píng)分(HR=2.12，95%CI：1.02～4.41，P=0.045)、PSA(HR=1.04，95%CI:1.02～1.06，P<0.001)、病理腫瘤大小分級(jí)(HR=0.17，95%CI:0.03～0.89，P=0.036)、GRIN3A(HR=4.90，95%CI：1.41～31.96，P=0.037)這4項(xiàng)指標(biāo)對(duì)患者的生存時(shí)間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。其中Gleason評(píng)分、PSA水平、GRIN3A值越高提示患者生存預(yù)后越差，病理腫瘤大小分級(jí)值越高提示患者預(yù)后越佳。為了探索這些指標(biāo)能否成為前列腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，我們進(jìn)行了多因素COX回歸分析，結(jié)果顯示，PSA水平(HR=1.02，95%CI：1.00～1.05，P=0.041)以及GRIN3A(HR=2.13，95%CI：0.26～17.66，P=0.048)可以成為患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。上述單因素及多因素COX回歸結(jié)果見(jiàn)表3。綜上所述，PSA水平及患者GRIN3A基因的表達(dá)量可以是患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

中藥在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的治療中具有重要作用，但是缺乏明確的分子機(jī)制一直是中藥在治療中存在的問(wèn)題。筆者首先通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，枸杞、姜黃、甘草3類(lèi)藥材在前列腺癌相關(guān)研究中具有明顯的抑癌作用。因此，本研究通過(guò)BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)分別預(yù)測(cè)了枸杞、甘草、姜黃3種藥材所含的化合物及其作用的靶蛋白。

表2 本研究中患者的臨床病理指標(biāo)

本研究篩選得到PTGS2、GRIN3A、CACNA1D、PTGS1、SLC18A3、SCN11A、CYP19A1、CRP、CHRM2、CHRNA4、GATA3這11個(gè)基因。將這11個(gè)基因及作用它們的化合物輸入到Cytoscape 3.7.1 中構(gòu)建分析網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)結(jié)果，選擇Degree排名前3位的基因(PTGS2,GRIN3A,CACNA1D)作為候選核心基因。PTGS2在直腸腺癌組織中的表達(dá)量是正常組織的8～9倍[21]。CACNA1D基因突變可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的形成[22]。在GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中，對(duì)PTGS2、GRIN3A、CACNA1D3個(gè)候選核心基因進(jìn)行生存分析，當(dāng)GRIN3A基因高表達(dá)時(shí)，前列腺癌患者的無(wú)病生存時(shí)間顯著下降，提示GRIN3A基因?qū)τ诨颊卟涣碱A(yù)后具有促進(jìn)作用。結(jié)果顯示，其他基因和患者的生存結(jié)局并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)系。因此選定GRIN3A為本研究的核心基因。

為了探索核心基因GRIN3A相關(guān)的生物學(xué)事件，本研究進(jìn)行了單基因GSEA分析，發(fā)現(xiàn)脂肪酸代謝、鈣離子信號(hào)通路、腫瘤中的信號(hào)通路在高表達(dá)組中激活；RNA降解、凋亡信號(hào)通路被抑制。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了GRIN3A在前列腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要性。

圖3 無(wú)病生存時(shí)間生存分析

圖4 GRIN3A單基因GSEA分析

表3 臨床病理指標(biāo)及GRIN3A表達(dá)量的單因素、多因素COX回歸結(jié)果

臨床指標(biāo)單因素COX回歸HR95%CIP值多因素Cox回歸HR95%CIP值年齡0.990.88～1.100.8201.020.89～1.160.760Gleason評(píng)分2.121.02～4.410.0451.710.77～3.780.188PSA1.041.02～1.06<0.0011.021.00～1.050.041病理淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分級(jí)3.810.85～17.030.0813.210.48～21.370.227病理腫瘤大小分級(jí)0.170.03～0.890.0360.110.01～1.010.051腫瘤質(zhì)量1.000.99～1.000.4101.000.99～1.010.527GRIN3A表達(dá)量4.902.21～31.960.0372.130.26～17.660.048

綜上所述，通過(guò)對(duì)枸杞、姜黃、甘草進(jìn)行一系列的生物信息學(xué)分析，三者共同作用的核心基因GRIN3A可作為預(yù)測(cè)前列腺癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，并且在這3類(lèi)藥材對(duì)前列腺癌細(xì)胞的治療作用中發(fā)揮很大作用。GRIN3A參與激活脂肪酸代謝、鈣離子信號(hào)通路、腫瘤中的信號(hào)通路抑制RNA降解、凋亡信號(hào)通路。