趙中華，張?zhí)姨?，?慧

0 引言

大腦缺血時誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，釋放脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物、谷氨酸、興奮性氨基酸及炎性因子，加重腦組織損傷[1-2]。神經(jīng)細(xì)胞損傷后不可逆，因此，盡快恢復(fù)腦組織血流、保證腦組織氧供對神經(jīng)元突觸的重塑及存活有著重要意義。燈盞花素(Scutellarin)是臨床常用的腦保護(hù)劑，具有減輕組織水腫、改善微循環(huán)、抗氧化、擴(kuò)張血管的作用[3-4]。

缺血性腦卒中是一個復(fù)雜的病理生理過程，涉及神經(jīng)細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等多個環(huán)節(jié)。Bcl-2蛋白屬膜整合蛋白，能夠阻止細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，從而抑制細(xì)胞凋亡。Bax是重要的促細(xì)胞凋亡基因之一，其過度表達(dá)可拮抗Bcl-2的保護(hù)效應(yīng)而使細(xì)胞趨于死亡。本實(shí)驗(yàn)采用缺氧/復(fù)氧模式模擬在體腦缺血再灌注損傷，以原代培養(yǎng)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元為研究對象，研究燈盞花素對神經(jīng)元的保護(hù)作用及機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)資料。

1 材料與方法

1.1 材料 燈盞花素(美國Sigma公司，純度>99%)，DMEM培養(yǎng)基(北京索萊寶科技有限公司)，CCK-8試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，LDH、SOD、MDA試劑盒(南京建成生物試劑公司)，2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2′,7′-dichlorodi hydrofluorescein diacetate，H2DCFDA)熒光探針(美國BD公司)，F(xiàn)ITC Annexin V凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)，Bcl-2及Bax抗體(上海碧云天公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取出生24 h內(nèi)SD大鼠，置于培養(yǎng)皿中，無菌條件下取大腦皮層，快速剪碎后置于含0.125%胰蛋白酶的PBS液中，37 ℃消化15 min，制備細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清液后將細(xì)胞接種于塑料培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～5 d換液1次。

1.2.2 缺氧復(fù)氧模型的建立及細(xì)胞分組 共分4組，每組5個復(fù)孔。①對照組：常規(guī)培養(yǎng)。②模型組(神經(jīng)元缺氧/復(fù)氧模型)：細(xì)胞置37 ℃培養(yǎng)罐中，緩慢持續(xù)通入含有5% CO2+95% N2的混合氣體30 min，至罐內(nèi)氧氣含量低于1%，造成神經(jīng)元缺氧，密封培養(yǎng)罐4 h后，將原來的培養(yǎng)液吸除，重新更換培養(yǎng)液，立即將細(xì)胞移至37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h，使細(xì)胞復(fù)氧。③燈盞花素低、高濃度組：進(jìn)行缺氧/復(fù)氧操作前0.5 h，在培養(yǎng)基中加入溶于DMSO的燈盞花素(1、10 μmol/L)，其余步驟同模型組。

1.2.3 CCK-8法測定神經(jīng)元細(xì)胞增殖 神經(jīng)元培養(yǎng)于96孔板內(nèi)，每孔200 μl，細(xì)胞密度為1×105/ml，棄去原有培養(yǎng)液，將已配置含10% CCK-8的培養(yǎng)基以換液的形式加入，接種后的96孔板37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，觀察細(xì)胞已貼壁。用480 nm吸光度進(jìn)行檢測。

1.2.4 各組細(xì)胞上清液LDH及細(xì)胞內(nèi)SOD、MDA檢測 收集神經(jīng)元細(xì)胞上清液，嚴(yán)格按照LDH試劑盒說明書檢測各組細(xì)胞上清液LDH活性；另取各組細(xì)胞，裂解后按照SOD、MDA試劑盒的方法進(jìn)行各樣本吸光度值檢測。

1.2.5 流式細(xì)胞技術(shù)檢測神經(jīng)元內(nèi)活性氧表達(dá) 神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，每孔500 μl，細(xì)胞密度為1×105個/ml，磷酸緩沖液(Phosphate buffer solution，PBS)沖洗3遍，離心(1 000 r/min)后收集細(xì)胞，黑暗中在室溫下加入5 μl H2DCFDA染料，15 min后流式細(xì)胞儀檢測并分析細(xì)胞內(nèi)活性氧表達(dá)量變化。

1.2.6 FITC Annexin V細(xì)胞凋亡檢測 收集細(xì)胞后PBS制備細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心并收集細(xì)胞，離心管內(nèi)加入300 μl緩沖液，混勻后加入5 μl Annexin-V和10 μl PI，避光反應(yīng)30 min后采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.7 Western blot檢測Bcl-2及Bax的蛋白表達(dá)水平 收集細(xì)胞并提取總蛋白，10 000 r/min離心10 min后取上清，行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后5%的脫脂奶粉4 ℃封閉2 h，加一抗過夜，室溫下孵育二抗1 h，ECL化學(xué)發(fā)光法自顯影并采集圖像。

2 結(jié)果

2.1 燈盞花素濃度對神經(jīng)元細(xì)胞存活率的影響 模型組神經(jīng)元細(xì)胞存活率為36.68%±4.79%，對照組為100.42%±4.55%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。用1、10 μmol/L燈盞花素處理后，細(xì)胞存活率逐漸提高，分別為59.87%±4.53%和69.93%±5.27%，與對照組及模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 燈盞花素對神經(jīng)元細(xì)胞存活率的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.2 燈盞花素對缺氧/復(fù)氧神經(jīng)元細(xì)胞LDH外漏及SOD、MDA水平的影響 與對照組相比，模型組細(xì)胞外培養(yǎng)基中LDH的釋放顯著增加(P<0.05)。與模型組相比，燈盞花素能夠顯著降低缺氧/復(fù)氧神經(jīng)元細(xì)胞外上清液中LDH水平(P<0.05)，說明燈盞花素能緩解細(xì)胞損傷。與對照組比較，模型組神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)SOD水平降低，MDA水平升高(P<0.05)；與模型組比較，燈盞花素組能顯著升高SOD活力，降低MDA水平(P<0.05)，且與濃度相關(guān)。其中，燈盞花素高濃度組中LDH及SOD水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明燈盞花素可以部分恢復(fù)LDH及SOD水平。見表2。

表2 燈盞花素對缺氧/復(fù)氧皮質(zhì)神經(jīng)元損傷LDH、SOD和MDA的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.3 燈盞花素對神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)ROS的影響 H2DCFDA熒光探針標(biāo)記法是一種檢測細(xì)胞內(nèi)ROS生成量變化的檢查方法，細(xì)胞氧化損傷程度越重，主峰越向右側(cè)偏移。流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)均較低，ROS主峰位于基線左側(cè)，模型組DCF熒光信號明顯增強(qiáng)，ROS主峰位于基線右側(cè)，不同濃度燈盞花素干預(yù)后，熒光信號強(qiáng)度逐漸減弱，ROS主峰向基線左側(cè)移位。見圖1。

圖1 流式細(xì)胞技術(shù)檢測神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)ROS改變

2.4 燈盞花素對神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響 熒光顯微鏡下，對照組未見明顯凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核均為暗藍(lán)色低熒光；模型組細(xì)胞核著色不均勻，凋亡細(xì)胞呈亮藍(lán)色高熒光；1、10 μmol/L燈盞花素處理后凋亡細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。見圖2、表3。

圖2 Hoechst染色觀察神經(jīng)元細(xì)胞凋亡

2.4 Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)水平檢測 Bcl-2蛋白在模型組中的表達(dá)明顯降低，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；低、高濃度燈盞花素組Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸升高，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Bax蛋白在模型組中的表達(dá)明顯升高，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；燈盞花素干預(yù)可降低Bax蛋白的表達(dá)，低、高劑量燈盞花素組Bax蛋白的相對表達(dá)量與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中，高劑量燈盞花素組Bcl-2蛋白的相對表達(dá)量與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明高劑量燈盞花素促進(jìn)了神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Bcl-2表達(dá)趨于正?；Ｒ妶D3、表4。

表3 燈盞花素對神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

圖3 燈盞花素對神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Bcl-2及Bax表達(dá)的影響

表4 各組Bcl-2及Bax蛋白相對表達(dá)比較

組別Bcl-2Bax對照組0.80±0.220.21±0.06模型組0.19±0.12*0.83±0.11*燈盞花素低濃度組0.29±0.16*#0.45±0.10*#燈盞花素高濃度組0.75±0.18#0.39±0.12*#

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3 討論

臨床上，燈盞花素已經(jīng)用于輔助治療腦卒中[5-6]。研究表明，燈盞花素通過擴(kuò)張腦血管改善微循環(huán)、恢復(fù)缺血病變區(qū)血流量等方式復(fù)原和改善神經(jīng)功能；此外，燈盞花素還可減輕腦組織血管損傷和炎癥反應(yīng)，從而減少缺血缺氧對神經(jīng)功能的損傷，對腦缺血疾病有較好的療效[5,7]。基于燈盞花素較強(qiáng)的抗氧化損傷作用，可以有效清除自由基，對改善患者生活能力和認(rèn)知功能有明確效果[6]。

關(guān)于燈盞花素對原代培養(yǎng)大鼠神經(jīng)元缺氧/復(fù)氧損傷保護(hù)作用的研究不多，徐露等[8]觀察燈盞花素聯(lián)合冰片對缺氧/復(fù)氧下原代培養(yǎng)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞影響，結(jié)果顯示，兩者聯(lián)合應(yīng)用可促進(jìn)ZO-1和Claudin-5蛋白的表達(dá)，維持血腦屏障(BBB)緊密連接的完整性。

多種腦血管疾病的損傷機(jī)制與神經(jīng)細(xì)胞的缺氧/復(fù)氧損傷密切相關(guān)[9]。原代培養(yǎng)的神經(jīng)元缺氧后，谷氨酸遞質(zhì)及嘌呤類代謝產(chǎn)物增加，復(fù)氧后在黃嘌呤氧化酶的作用下大量活性氧族(ROS)堆積，ROS水平高低與腦損傷程度直接相關(guān)。當(dāng)ROS水平較高時，神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，細(xì)胞損傷加重[10-11]。本研究結(jié)果顯示，缺氧/復(fù)氧破壞了神經(jīng)元正常生理功能，細(xì)胞存活率顯著下降。

LDH存在于機(jī)體所有組織細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，其含量高低可反映細(xì)胞膜的完整性。SOD是細(xì)胞內(nèi)具有抗氧化作用的酶，SOD水平高低反映了機(jī)體間接清除氧自由基的能力，兩者活力和含量可反映細(xì)胞抗氧化的能力。MDA是膜質(zhì)過氧化最重要的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生能增加細(xì)胞膜損傷，因此，可通過MDA了解膜質(zhì)過氧化的程度，以間接測定膜系統(tǒng)受損程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，燈盞花素預(yù)處理能顯著降低缺氧/復(fù)氧神經(jīng)元細(xì)胞外上清液中LDH漏出率，增加缺氧/復(fù)氧神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)SOD的表達(dá)，降低細(xì)胞內(nèi)MDA含量。

H2DCFDA熒光探針是一種檢測細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)的染色方法。本研究采用流式細(xì)胞技術(shù)觀察缺氧/復(fù)氧對神經(jīng)元的氧化損傷程度，觀察結(jié)果顯示，模型組神經(jīng)元氧化損傷明顯，燈盞花素可以不同程度地抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元氧化損傷。

Hoechst 33258染色劑能嵌入凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核DNA，使細(xì)胞核濃染，呈致密顆粒和(或)塊狀藍(lán)色高熒光。本實(shí)驗(yàn)中，模型組中亮藍(lán)色熒光明顯增多，證實(shí)缺氧/復(fù)氧可以誘發(fā)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，燈盞花素低濃度組及燈盞花素高濃度組中凋亡細(xì)胞比例逐漸降低。

腦缺血/再灌注引起的細(xì)胞損傷可以通過細(xì)胞凋亡的方式導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[12]。Bcl-2在氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡反應(yīng)中起重要作用，具有潛在的抗凋亡作用[13]。Bax表達(dá)水平的高低直接反映細(xì)胞凋亡程度，Western blot結(jié)果顯示，模型組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低，Bax蛋白表達(dá)明顯增加，提示缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)了神經(jīng)元凋亡，燈盞花素通過改變Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用。

綜上所述，燈盞花素能夠有效抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，為預(yù)防和治療缺血性腦卒中及退行性神經(jīng)疾病提供了理論支持。