韓雨薇，王晨辰，李曉明

0 引言

蛛網(wǎng)膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage,SAH)是一種高死亡率、高殘疾率且預(yù)后差的腦血管疾病。早期腦損傷(Early brain injury,EBI)是SAH后72 h內(nèi)發(fā)生的腦損傷，是影響SAH預(yù)后的主要原因之一。EBI的病理機(jī)制復(fù)雜，大量文獻(xiàn)表明,炎癥反應(yīng)是SAH后EBI發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)之一。

高遷移率蛋白B1(HMGB1)是上游的炎癥介質(zhì)，其過(guò)量表達(dá)能夠加重SAH后早期腦損傷。HMGB1是一種核蛋白，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的多種細(xì)胞中廣泛表達(dá)，包括星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和內(nèi)皮細(xì)胞[1]。因?yàn)镾AH患者HMGB1的血漿水平顯著高于健康人，故臨床上可將HMGB1用于評(píng)估SAH后的功能預(yù)后和死亡率[2]。細(xì)胞外HMGB1可以與Toll樣受體-2(TLR2)、Toll樣受體-4(TLR4)和RAGE相互作用[3]。TLR4是細(xì)胞外HMGB1的主要結(jié)合受體。NF-κB是TLR4下游參與炎癥反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子[4-5]。TLR4活化后能夠促使IκB降解，從而導(dǎo)致NF-κB p65入核，最終產(chǎn)生大量的炎癥因子[6-7]。因此，在SAH中，調(diào)節(jié)HMGB1的表達(dá)和釋放從而調(diào)控HMGB1介導(dǎo)的TLR4/NF-κB炎癥信號(hào)通路十分重要。

齊墩果酸(3b-hydroxy-olea-12-en-28-oic acid，OA)是五環(huán)三萜類(lèi)化合物，在食品和藥用植物中廣泛表達(dá)，有顯著的抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用[8]。研究表明，齊墩果酸能夠降低脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HMGB1表達(dá)[9]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，齊墩果酸能夠減輕SAH大鼠的BBB破壞程度[10]。然而，齊墩果酸對(duì)SAH引起的炎癥反應(yīng)及其作用機(jī)制的影響目前尚不清楚。本研究探討齊墩果酸是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路，從而減輕SAH誘導(dǎo)的炎癥，保護(hù)早期腦損傷。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 齊墩果酸購(gòu)買(mǎi)于天津士蘭科技有限公司；HMGB1、NF-κB、p65、IκBα抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；TLR4、β-actin購(gòu)自Santa Cruz公司；細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒，BCA蛋白定量試劑盒，RIPA裂解液及5×loading buffer均購(gòu)自碧云天公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 雄性SD大鼠(250～300 g)來(lái)源于北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物飼養(yǎng)于恒溫室中，12 h/12 h光暗交替，給予充足食物和水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照“National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。72只大鼠隨機(jī)分成3組：假手術(shù)組(18只)、SAH模型組(30只)、齊墩果酸給藥組(20 mg/kg，24只)。術(shù)前禁食，模型完成1 h后給予齊墩果酸，24 h后取材。

1.3 模型建立 SAH大鼠模型建立如之前所述。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如圖1所示。

圖1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程圖

1.4 SAH嚴(yán)重性評(píng)價(jià)和神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分 根據(jù)Sugawara[11]評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)SAH的嚴(yán)重程度進(jìn)行0～3級(jí)評(píng)分，評(píng)分越高表示SAH越嚴(yán)重。根據(jù)Sugawara[11]評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分，對(duì)6個(gè)活動(dòng)項(xiàng)目進(jìn)行測(cè)試，并給予0～3分的評(píng)價(jià)?？傇u(píng)分越低則說(shuō)明神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

1.5 腦組織含水量測(cè)定 24 h后，取腦組織，切分為小腦和左右半腦3部分，擦干稱(chēng)重后，于110 ℃烘箱中72 h烘干，然后稱(chēng)重，按照公式腦含水率(%)=(濕重-干重)/濕重×100%計(jì)算。

1.6 腦血管通透性測(cè)定 取材1 h前，2%伊文思藍(lán)溶液(5 ml/kg，尾靜脈注射)，1 h后生理鹽水灌注，取出腦組織，切分為小腦、左右半腦分別稱(chēng)重。將組織浸潤(rùn)到甲酰胺溶液中，60 ℃恒溫孵育24 h后收集浸出液，酶標(biāo)儀620 nm處測(cè)定OD值。

1.7 細(xì)胞核、細(xì)胞漿蛋白提取 取各組腦組織切成非常小的碎片，按照細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作。

1.8 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 取腦組織稱(chēng)重，加入1 ml裂解液，勻漿裂解30 min，4 ℃，12 000 r/min離心10 min后取上清；BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入5×loading buffer，100 ℃煮沸5 min；10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，每孔加入40 μg總蛋白樣品；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；一抗HMGB1(1∶500)、p65(1∶500)、IκBα(1∶500)、TLR4(1∶200)、β-actin(1∶1 000)4 ℃過(guò)夜；1∶8 000稀釋二抗，溫孵育1 h；Pro-light HRP發(fā)光試劑盒檢測(cè)，用X-ray顯影。

2 結(jié)果

2.1 齊墩果酸對(duì)SAH后早期腦損傷的影響 如圖2A、圖2B所示，與假手術(shù)組相比，SAH模型組出血嚴(yán)重，SAH評(píng)分明顯增高，齊墩果酸(20 mg/kg)給藥能夠顯著減少出血量，降低SAH評(píng)分(P<0.001)。齊墩果酸可以抑制SAH導(dǎo)致的體重降低(P<0.05，圖2C)。根據(jù)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，我們對(duì)手術(shù)24 h后的大鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分。結(jié)果表明，SAH模型組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分顯著降低，神經(jīng)損傷嚴(yán)重，而齊墩果酸(20 mg/kg)給藥能夠顯著提高神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，改善神經(jīng)功能(P<0.01，圖2D)。同時(shí)，我們檢測(cè)了腦水腫和通透性的變化，發(fā)現(xiàn)與SAH模型組相比，齊墩果酸能夠顯著降低腦含水量和伊文思藍(lán)的滲出率，提示齊墩果酸對(duì)腦血管屏障具有顯著的保護(hù)作用(P<0.01，圖2E、圖2F)。

圖2 齊墩果酸給藥對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血24 h后SAH評(píng)分(A、B)、體重(C)、神經(jīng)功能損傷(D)、腦含水量(E)和伊文思藍(lán)滲透率(F)的影響

2.2 齊墩果酸對(duì)SAH后HMGB1的影響 如圖3所示，對(duì)全細(xì)胞、細(xì)胞漿和細(xì)胞核中HMGB1蛋白含量均進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在SAH組其蛋白含量均顯著增加(P<0.01)。與SAH組相比，齊墩果酸能夠明顯降低HMGB1在全細(xì)胞(P<0.01)和細(xì)胞漿(P<0.001)中蛋白表達(dá)，而在細(xì)胞核中無(wú)顯著變化。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，齊墩果酸給藥能夠抑制HMGB1的表達(dá)和釋放。

圖3 齊墩果酸對(duì)SAH后HMGB1蛋白在全細(xì)胞(A)、細(xì)胞漿(B)和細(xì)胞核(C)中的影響

2.3 齊墩果酸對(duì)SAH后HMGB1介導(dǎo)的TLR4/NF-κB炎癥通路的影響 在SAH模型組中TLR4表達(dá)增加，IκBα降解，IκBα降解使NF-κB激活促進(jìn)p65轉(zhuǎn)位入核。齊墩果酸給藥能夠顯著減少TLR4的表達(dá)，抑制IκBα降解，減少p65入核(P<0.01，圖4)。

3 討論

早期腦損傷是SAH高死亡率的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。SAH后早期腦損傷的病理機(jī)制十分復(fù)雜，其中越來(lái)越多的證據(jù)表明，炎癥是參與早期腦損傷的主要機(jī)制之一。在SAH后，大量的炎性細(xì)胞因子和趨化因子釋放，從而引起腦水腫和神經(jīng)系統(tǒng)損傷[12]。因此，抑制炎癥反應(yīng)是治療SAH后早期腦損傷的重要途徑。

研究表明，SAH會(huì)引起腦組織中HMGB1的轉(zhuǎn)位和釋放[2,4]。釋放的HMGB1能夠與細(xì)胞膜表面的TLR4受體結(jié)合，然后激活NF-κB信號(hào)通路、促進(jìn)大量炎癥因子的產(chǎn)生[13-16]。齊墩果酸對(duì)SAH中HMGB1表達(dá)及HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響仍未見(jiàn)報(bào)道。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)齊墩果酸能夠顯著抑制HMGB1的表達(dá)，并且明顯抑制其在細(xì)胞質(zhì)中釋放。TLR4激活I(lǐng)κB降解導(dǎo)致NF-κB活化，p65從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移入核促進(jìn)炎性因子TNF-α的產(chǎn)生[17]。我們的研究結(jié)果表明，齊墩果酸能夠有效抑制SAH誘導(dǎo)的TLR4表達(dá)、IκB降解以及p65入核。

圖4 齊墩果酸對(duì)SHA后HMGB1介導(dǎo)的TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活的影響

綜上所述，齊墩果酸能夠降低HMGB1的表達(dá)和釋放，抑制HMGB1/TLR4/NF-κB炎癥通路，改善SAH后的炎癥情況。本研究為齊墩果酸治療SAH后的早期腦損傷的作用及其機(jī)制提供了新的參考依據(jù)。