（南華大學(xué)附屬郴州市第一人民醫(yī)院 423000）

宮頸癌是我國(guó)最常見的婦科惡性腫瘤之一，晚期宮頸癌患者，由于容易出現(xiàn)的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥，目前療效并不理想[1]。PTEN是一種腫瘤抑制基因，在細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、遷移、浸潤(rùn)等方面有重要作用[2]。前期工作中，發(fā)現(xiàn)，miR-32與PTEN結(jié)合最穩(wěn)定，特異性最好。本項(xiàng)目擬研究miR-32和PTEN在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

鼠抗人單克隆PTEN、β-actin抗體，脂質(zhì)體，美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品。Transwell試劑盒、Matrigel基質(zhì)膠，美國(guó)B&D公司產(chǎn)品。

1.2 miR-32 mimics、NC 及 inhibitors

試劑均由廣州博銳生物科技有限公司合成。

1.3 qRT-PCR

在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。qRT-PCR反應(yīng)體系如下：10μM正向引物1μl;10μM反向引物 1μL;DNA模板 2μL;ddH2O 8.5μL;2×SYBR Primix Ex TaqTMⅡ12.5μL;總反應(yīng)體系25μL。按以下過程進(jìn)行：95℃，5 min；35 個(gè) PCR 循環(huán)（95℃，10sec；59℃，15sec；72℃，20sec；82℃，5sec）。

1.4 Western blot

:步驟如下：分別收集細(xì)胞約108個(gè)，抽提細(xì)胞的總蛋白；蛋白樣品加熱變性；SDS-PAGE電泳；轉(zhuǎn)膜：電壓設(shè)置為100V，時(shí)間約1h；麗春紅溶液中染色3-5min；封閉1-2h；加入適量的封閉液和一抗(一抗?jié)舛葹?:1500)；再加封閉液和生物素進(jìn)行標(biāo)記的二抗(二抗?jié)舛葹?:1000)，常溫下孵育1-2h；壓X光片，定影顯影，洗片，圖像掃描。

1.5 重組細(xì)胞系的建立

首先采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(Lipofectamine 2000)將miR-32 mimics、NC及inhibitors序列分別通過脂質(zhì)體方法轉(zhuǎn)染宮頸癌Hela細(xì)胞系，獲得三個(gè)重組細(xì)胞株：Hela-miR-32 mimics、Hela-miR-NC、Hela-miR-32-inhibitors。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織與癌旁組織中miR-32和PTEN表達(dá)關(guān)系

miR-32在宮頸癌組織中高表達(dá)，而在癌旁組織中低表達(dá)；PTEN在宮頸癌組織中低表達(dá)，在癌旁組織中高表達(dá)，差異有顯著性意義（P＜0.05，圖 1）。

圖1 宮頸癌和癌旁組織中miR-32和PTEN表達(dá)關(guān)系

2.2 miR-32與PTEN表達(dá)關(guān)系

Hela-miR-32 inhibitors細(xì)胞株中，miR-32表達(dá)水平下調(diào)后，導(dǎo)致PTEN表達(dá)水平增高；Hela-miR-32 mimics細(xì)胞株中，提高miR-32表達(dá)水平后，PTEN蛋白水平下調(diào)，差異均有顯著性意義（P＜0.05，圖2）；而Hela和Hela-miR-NC比較，差異均無顯著性意義。

圖1 重組細(xì)胞系中miR-32與PTEN表達(dá)關(guān)系

4 討論

研究發(fā)現(xiàn)，PTEN基因在宮頸組織從癌前病變向?qū)m頸癌演變的過程中有重要作用;PTEN基因的功能缺失使其對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制及對(duì)細(xì)胞黏附的控制減弱，有助于宮頸癌的發(fā)生[3，4]。PTEN也可作為評(píng)價(jià)宮頸癌預(yù)后的指標(biāo)[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中PTEN低表達(dá)，癌旁組織中高表達(dá)，兩者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)。PTEN與宮頸癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

研究表明，miRNA的表達(dá)異常與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展有著直接的聯(lián)系[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-27b在宮頸癌中表達(dá)增高，下調(diào)miRNA-27b表達(dá)水平后，宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)受到明顯抑制[7]。本研究發(fā)現(xiàn)：宮頸癌組織中出現(xiàn)同時(shí)miR-32高表達(dá)和PTEN低表達(dá)，而癌旁組織中同時(shí)出現(xiàn)miR-32低表達(dá)和PTEN高表達(dá)。說明miR-32與PTEN表達(dá)均與宮頸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)，miR-32與PTEN表達(dá)具有負(fù)相關(guān)。同時(shí)，宮頸癌細(xì)胞中，miR-32表達(dá)下調(diào)后，導(dǎo)致PTEN表達(dá)水平增高；而提高miR-32表達(dá)后，PTEN蛋白水平下調(diào)，結(jié)合前期工作在生物信息學(xué)分析，本研究認(rèn)為PTEN可能是miR-32的下游靶基因。他們之間的靶向結(jié)合與宮頸癌的關(guān)系值得進(jìn)一步研究。