文/李曉路

對甲硝唑葡萄糖注射液中甲硝唑含量的測定采用HPLC測定分析方法進行方法學驗證 // 采用高效液相色譜法（HPLC）對甲硝唑葡萄糖注射液中甲硝唑含量進行測定，甲硝唑在150.24～350.56 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其r值為0.9995，平均回收率為99.98%，回收率RSD為0.22%（n=9）。通過對其專屬性、回收率（準確度）、線性、精密度、穩(wěn)定性等試驗，證明該方法簡便靈敏、準確可靠、重現(xiàn)性好，HPLC可作為甲硝唑葡萄糖注射液中甲硝唑含量測定方法。

甲硝唑為抗原蟲及抗厭氧菌藥，甲硝唑葡萄糖注射液廣泛應用于臨床，其甲硝唑含量在《中國藥典》（2005年版二部）中采用紫外-可見分光光度法直接測定，不能排除葡萄糖分解產(chǎn)物5-羥甲基糠醛的干擾?！吨袊幍洹罚?010年版二部）規(guī)定甲硝唑葡萄糖注射液中甲硝唑含量采用高效液相色譜法進行檢測，能有效的排除5-羥甲基糠醛的干擾。通過對甲硝唑含量測定所用的HPLC分析方法進行方法學驗證，以證明該方法簡便靈敏、準確可靠、重現(xiàn)性好，高效液相色譜法（HPLC）可作為甲硝唑葡萄糖注射液中甲硝唑含量測定方法。

實驗部分

儀器與試藥

1.儀器及色譜條件

島津LC-20A高效液相色譜儀（配備LC solution工作站）、島津SPD-20A紫外檢測器；

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(VP-ODS 250*4.6 mm)；

流動相：甲醇-水（20：80）；

檢測波長：320 nm；

理論板數(shù)：按甲硝唑峰計算不低于2000。

2.試藥

甲硝唑?qū)φ掌罚?/p>

甲硝唑葡萄糖注射液；

甲醇為色譜純；

實驗用水為純化水；

其他試劑均為分析純。

實驗過程

1.專屬性

專屬性是指在樣品介質(zhì)中有其它組份（如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料）共存時，采用的檢驗方法（如鑒別檢查、雜質(zhì)檢查、含量測定）能準確測定出被測物質(zhì)的特性。

空白溶液：按處方配制不含甲硝唑的溶液，作為空白溶液。取空白溶液及供試品溶液，照含量測定項下方法分別測定，檢測結(jié)果見表1，譜圖見圖1?？瞻兹芤簩繙y定應無干擾。

空白溶液制備：按處方配制不含甲硝唑的溶液，精密量取該溶液25 mL，置200 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻即得。

供試品溶液制備：精密量取甲硝唑葡萄糖注射液25 mL，置200 mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻即得，照含量測定項下方法分別測定，檢測結(jié)果見表2，譜圖見圖2。

通過上述數(shù)據(jù)顯示：空白溶液對含量測定無干擾。

2.準確度

準確度系指該方法測定的結(jié)果與真實值或參考值接近的程度，一般用回收率表示。一般要求分別配制濃度為80%、100%和120%的供試品溶液各三份，分別測定其含量，將實測值與理論值比較，計算回收率。平均回收率應在98.0%～102.0%之間，相對標準偏差（RSD）應不大于2.0%。

對照品溶液的制備：稱取經(jīng)105℃干燥2小時的甲硝唑?qū)φ掌?5mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻即得 。

供試品溶液制備：稱取經(jīng)105℃干燥2小時的甲硝唑?qū)φ掌芳s20 mg、25 mg、30 mg，精密稱定，分別置100 mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，即得濃度為80%、100%和120%的供試溶液，各濃度各配置3份，共9個樣品，結(jié)果見表3。

計算公式：

式中：

A樣—供試品的峰面積或峰高；

A對—對照品的峰面積或峰高；

W—對照品的重量（mg）。

通過上述數(shù)據(jù)顯示：平均回收率在98.0%～102.0%之間，相對標準偏差（RSD）小于2.0%。故該方法有較好的回收率，具有良好的準確度。

3.線性

線性是指在設(shè)定范圍內(nèi)，測試結(jié)果與試樣中被測物質(zhì)濃度直接成正比關(guān)系的程度。線性一般通過線性回歸方程的形式來表示。具體的驗證方法為：在60%至140%的濃度范圍內(nèi)配制至少5份濃度不同的對照品溶液，分別測定其主峰的面積，計算相應的濃度。以濃度C為橫坐標（X軸），峰面積A為縱坐標（Y軸）進行線性回歸，計算回歸方程，得出相關(guān)系數(shù)r值。標準曲線的相關(guān)系數(shù)（r）不得小于0.9990。

樣品溶液制備：精密稱取甲硝唑?qū)φ掌?5.04 mg置50 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，量取該樣品3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL，分別置10 mL量瓶中，加流動相稀釋并定容至刻度，搖勻，即分別得濃度為60%、80%、100%、120%和140%的 供試品溶液,檢測結(jié)果見表4。

表1 專屬性空白溶液峰表

圖1 專屬性空白溶液譜圖

表2 專屬性供試品溶液峰表

圖2 專屬性供試品溶液譜圖

表3 80%、100%和120%三種濃度供試品溶液的含量、回收率及相對標準偏差

表4 5份濃度不同的對照品溶液的主峰面積

圖3 線性關(guān)系標準曲線圖

計算公式：

式中：

W—對照品的重量（mg）；

V—量取樣品的體積（mL）。

通過線性回歸方程計算r=0.9995，甲硝唑溶液在154.24～350.56 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，見圖3。

4.精密度

精密度系指在規(guī)定的測試條件下，同一個均勻供試品，經(jīng)多次取樣測定所得結(jié)果之間的接近程度。一般用偏差、標準偏差或相對標準偏差表示。

■重復性

照含量測定項下方法，由同一個分析人員在盡可能相同的條件下連續(xù)測定6次，所得6組含量結(jié)果的相對標準偏差應小于2.0%。

對照品溶液的制備：精密稱取經(jīng)105℃干燥2小時的甲硝唑?qū)φ掌?3.03 mg，置50 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻即得。

供試品溶液制備：精密量取甲硝唑葡萄糖注射液25 mL，置200 mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻即得，結(jié)果見表5。

計算公式：

式中：

A樣—供試品的峰面積或峰高；

A對—對照品的峰面積或峰高；

W—對照品的重量（mg）；

2—每mL含甲硝唑的量（mg）。

通過表中數(shù)據(jù)得知：同一分析人員所得6組含量結(jié)果的相對標準偏差小于2.0%，該方法有較好的重復性。

■中間精密度

照含量測定項下方法，由不同分析人員在不同時間分別測定含量，至少測定6次，用測得的數(shù)據(jù)計算，其相對標準偏差應小于2.0%。

對照品溶液的制備：精密稱取經(jīng)105℃干燥2小時的甲硝唑?qū)φ掌?3.02 mg，置50 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻即得 。

供試品溶液制備：精密量取甲硝唑葡萄糖注射液25 mL，置200 mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻即得，結(jié)果見表6。

計算公式：

式中：

A樣為供試品的峰面積或峰高；

A對為對照品的峰面積或峰高；

W為對照品的重量（mg）；

2為每ml含甲硝唑的量（mg）。

通過表中數(shù)據(jù)得知：不同分析人員所得12組含量結(jié)果的相對標準偏差小于2.0%，該方法有較好的中間精密度。

5.穩(wěn)定性試驗

按含量測定項下供試品配制方法配制供試品溶液，分別于0、2、4、6、8小時測定供試品溶液，記錄色譜圖，以峰面積計算相對標準偏差（RSD），結(jié)果見表7。

接受標準：穩(wěn)定性試驗相對標準偏差（RSD）應小于2.0%。

通過表中數(shù)據(jù)所得：穩(wěn)定性試驗相對標準偏差（RSD）小于2.0%，證明供試品溶液在8小時內(nèi)穩(wěn)定性良好。

6.耐用性

耐用性是指在測定條件有小的變動時，測定結(jié)果不受影響的承受程度，為使方法可用于常規(guī)檢驗提供依據(jù)。分別考察流動相比例變化±5%、柱溫變化±5℃，儀器色譜行為的變化，每個條件下各測試兩次。

可接受的標準為：主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰與雜質(zhì)峰必須達到基線分離；各條件下的含量數(shù)據(jù)（n=4）的相對標準偏差應不大于2.0%。

對照品溶液的制備：精密稱取經(jīng)105℃干燥2小時的甲硝唑?qū)φ掌?3.09 mg，置50 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻即得 。

供試品溶液制備：精密量取甲硝唑葡萄糖注射液25 mL，置200 mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻即得，結(jié)果見表8。

在流動相比例變換±5%、柱溫變化±5℃，主峰的拖尾因子不大于2.0，主峰與雜質(zhì)峰達到基線分離；各條件下的含量數(shù)據(jù)（n=4）的相對標準偏差應小于2.0%，故該方法有較好的耐用性。

7.定量限

稱取甲硝唑?qū)φ掌芳s10 mg，精密稱定，用流動相反復稀釋，按上述色譜條件進樣，根據(jù)定量限的信噪比為10:1的原則，最終確定甲硝唑的定量限。

表5 供試品溶液的重復檢測結(jié)果

表6 供試品中間濃度的重復檢測結(jié)果

表7 穩(wěn)定性試驗

供試品溶液的制備：1號溶液：精密稱取甲硝唑?qū)φ掌?3.07 mg,置100 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2號溶液：精密量取1號溶液1 mL，置100 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

3號溶液：精密量取2號溶液5 mL，置50 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

4號溶液：精密量取3號溶液5 mL，置50 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

由上述數(shù)據(jù)及圖譜可知：該方法有較好的定量限。

8.檢測限

精密量取定量限項下供試品溶液3 mL，置10 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件連續(xù)進樣，根據(jù)檢測限的信噪比為3:1的原則，確定甲硝唑的檢測限與最小檢測濃度。

供試品溶液的制備：精密量取定量限項下的供試品溶液3 mL置10 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液色譜圖中信噪比約為3:1，可確定甲硝唑的檢測限與最小檢測濃度。

由上述數(shù)據(jù)及圖譜可知：該方法有較好的檢測限。

9.系統(tǒng)適用性

照含量測定項下方法配制對照品溶液1份, 連續(xù)進樣5次，主峰峰面積的相對標準偏差應不大于2.0%，主峰保留時間的相對標準差應不大于1.0%。另外，主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰與雜質(zhì)峰必須達到基線分離，主峰的理論塔板數(shù)應符合質(zhì)量標準的規(guī)定。

對照品溶液的制備：精密稱取經(jīng)105℃干燥2小時的甲硝唑?qū)φ掌?3.06 mg，置50 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻即得，檢測結(jié)果見表9。

通過表中數(shù)據(jù)所得：主峰峰面積的相對標準偏差小于2.0%，主峰保留時間的相對標準差小于1.0%，主峰的拖尾因子小于2.0，主峰與雜質(zhì)峰達到基線分離，主峰的理論塔板數(shù)符合質(zhì)量標準的規(guī)定。

表8 連續(xù)進樣5次的相對標準偏差

10.含量測定

精密量取本品25 mL，置200mL量瓶中，用流動相定量稀釋制成每1 mL中約含甲硝唑0.25 mg的溶液，搖勻，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取甲硝唑?qū)φ掌愤m量，精密稱定，加流動相溶解并稀釋制成每1 mL中約含甲硝唑0.25 mg的溶液，搖勻，同法測定。按外標法以峰面積計算，即得。按上述色譜條件進行儀器設(shè)備調(diào)試，同法作平行試驗，檢測結(jié)果見表10。

11.結(jié)果計算

式中:

A樣供—試品的峰面積或峰高；

A對—對照品的峰面積或峰高；

W—對照品的重量（mg）；

2—每ml含甲硝唑的量（mg）。

由上述結(jié)果數(shù)據(jù)可知，兩份平行試驗結(jié)果相對偏差不得大于1.5%，該含量檢測方法穩(wěn)定可靠。

結(jié)論

甲硝唑葡萄糖注射液中甲硝唑含量采用高效液相色譜法進行檢測，能有效的排除5-羥甲基糠醛的干擾。通過對分析方法專屬性、回收率（準確度）、線性、精密度（重復性和中間精密度）、穩(wěn)定性、耐用性、系統(tǒng)適用性、檢測限、定量限等試驗證明高效液相色譜法對甲硝唑葡萄糖注射液中甲硝唑含量的測定有足夠的專屬性，該方法簡便靈敏、準確可靠、重現(xiàn)性好，可作為甲硝唑葡萄糖注射液中甲硝唑含量測定方法。

表9 連續(xù)進樣5次的相對標準偏差

表10 雙樣雙平行的含量測定