文 /陶文靖 董彬 趙婷婷 付敏 胡素麗

優(yōu)化試劑盒參數(shù)，快速檢測(cè)牛奶中抗生素生物 // 本文主要對(duì)芽孢萌發(fā)培養(yǎng)基成分、指示劑、pH值、芽孢包埋量、罐裝量等影響芽孢萌發(fā)產(chǎn)酸的條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了芽孢萌發(fā)培養(yǎng)基最佳配比為蛋白胨1.0%、葡萄糖0.5%、瓊脂0.5%、CMC 0.2%；芽孢萌發(fā)最佳條件為溴甲酚紫40 mg/L、pH值為7.0；以及試劑盒生產(chǎn)所需芽孢最佳包埋量為1×l07CFU/mL。根據(jù)優(yōu)化后的條件，進(jìn)行生產(chǎn)檢測(cè)試劑盒，并測(cè)定試劑盒的靈敏度與穩(wěn)定性。

上世紀(jì)50年代，荷蘭的DSM公司開(kāi)發(fā)生產(chǎn)了一批試劑盒，目前DSM公司的試劑盒檢測(cè)法已經(jīng)成為全球公認(rèn)的乳品抗生素殘留的檢測(cè)方法，也是荷蘭、法國(guó)等國(guó)家乳品抗生素殘留的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。試劑盒檢測(cè)法是利用微生物抑制法原理，微生物抑制實(shí)驗(yàn)的原理是基于對(duì)微生物生理學(xué)和代謝抗生素的抑制作用，可以定性確定樣品中的抗生素殘留是否超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)。其檢測(cè)方法是在96孔檢測(cè)板的微孔中加入含嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢和pH指示劑的培養(yǎng)基，在60-65℃條件下培養(yǎng)，指示劑由紫色變?yōu)辄S色。

表1 抗生素種類及濃度

實(shí)驗(yàn)部分

儀器和試劑

儀器設(shè)備：超凈工作臺(tái)、pH測(cè)試計(jì)、電子天平、滅菌鍋、干式加熱器、磁力攪拌器、恒溫培養(yǎng)箱、顯微鏡。

試劑：蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉、葡萄糖、溴甲酚紫、氫氧化鈉、屈臣氏無(wú)菌蒸餾水、不同種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品。

樣品：無(wú)抗奶樣。

實(shí)驗(yàn)方法

1.抗生素樣本的制備

選擇無(wú)抗奶，按照表1所示，添加不同濃度抗生素制成實(shí)驗(yàn)樣本。

2.芽孢萌發(fā)條件及試劑盒參數(shù)的優(yōu)化

芽孢可以保持很長(zhǎng)的休眠期，也可以在外界刺激下打破休眠而萌發(fā)成營(yíng)養(yǎng)體，快速生長(zhǎng)。通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基成分、pH值、菌株包埋含量、培養(yǎng)溫度等以促進(jìn)孢子萌發(fā)，并篩選變色靈敏的顯色劑，來(lái)提高試劑盒檢出靈敏度。

根據(jù)查閱資料，設(shè)置基礎(chǔ)培養(yǎng)基配比為蛋白胨0.5%、葡萄糖0.3%、瓊脂1.5%、CMC 0.1%；選擇溴甲酚紫為顯色劑，pH值為7.0；包埋量為1×l07CFU/mL；罐裝量100μL/孔，在此條件下進(jìn)行優(yōu)化。目標(biāo)是在加樣本后2.5-3 h反應(yīng)內(nèi)，可以檢測(cè)出目標(biāo)抗生素。檢出限參考Delvotest?試劑盒。

■包埋培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的優(yōu)化

設(shè)置4種培養(yǎng)基，將活化好的菌株接種到配置好的培養(yǎng)基上，在65℃的條件下，培養(yǎng)8 h后，開(kāi)始每隔2 h觀察每個(gè)培養(yǎng)基上菌落大小來(lái)判斷菌落的生長(zhǎng)速度。將培養(yǎng)基罐裝到微孔板中，在65℃下，孵育3 h，根據(jù)培養(yǎng)基變色的時(shí)間來(lái)判斷產(chǎn)酸效果，從而確定最佳培養(yǎng)基成分配比。4種培養(yǎng)基設(shè)置如下：

培養(yǎng)基1：蛋白胨0.5%、葡萄糖0.3%、瓊脂1.5%；

培養(yǎng)基2：蛋白胨1.0%、葡萄糖0.3%、瓊脂1.0%；

培養(yǎng)基3：蛋白胨1.0%、葡萄糖0.5%、瓊脂0.5%、CMC 0.2%；

培養(yǎng)基4：蛋白胨1.5%、葡萄糖0.5%、瓊脂0.5%、CMC 0.1%；

■包埋顯色劑的優(yōu)化

芽孢包埋濃度設(shè)置為：1×l07CFU/mL，pH 值為 7.0，按照100 μL/孔進(jìn)行罐裝，分別加入100μL無(wú)抗奶和表1所示的100μL加標(biāo)奶，在65℃下，孵育3 h后，測(cè)試靈敏度。溴甲酚紫含量 設(shè) 置：20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L、100 mg/L。

■芽孢包埋濃度的優(yōu)化

包埋濃度分別設(shè)置為：1×l05CFU/mL、1×l06CFU/mL、1×l07CFU/mL、1×l08CFU/mL、1Xl09CFU/mL 。按照 100 μL/孔進(jìn)行罐裝，分別加入100 μL無(wú)抗奶和各種濃度的加標(biāo)奶，在65℃下，孵育3 h，觀看顏色變化，以抗生素檢測(cè)靈敏度（考慮最接近國(guó)標(biāo)檢出限）來(lái)確定芽孢包埋最佳濃度。

3.試劑盒靈敏度的測(cè)定

根據(jù)上述優(yōu)化后參數(shù)，生產(chǎn)一批試劑盒，進(jìn)行靈敏度測(cè)定實(shí)驗(yàn)。根據(jù)上述要求配置待檢測(cè)奶樣，添加100 μL奶樣至微孔中，在65℃下，孵育3 h，判斷試劑盒靈敏度范圍。

結(jié)果與分析

1.包埋培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的確定

依照培養(yǎng)基各種成分配比，包埋培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2、表3所示。

由表2、表3所示，在相同的時(shí)間內(nèi)，以菌落生長(zhǎng)的數(shù)目和狀態(tài)反應(yīng)菌株的生長(zhǎng)速度，以產(chǎn)酸效率反應(yīng)菌落生長(zhǎng)速度。最終可以確定最佳包埋培養(yǎng)基成分為蛋白胨1.0%、葡萄糖0.5%、瓊脂0.5%、CMC 0.2%。

2.顯色劑含量的確定

依照包埋顯色劑的優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方案，結(jié)果如表4、表5所示。

指示劑的添加量對(duì)包埋培養(yǎng)基顏色變化有一定的影響。隨著溴甲酚紫含量的提高，檢測(cè)變色效果逐漸提高，靈敏度提高，但要綜合考慮到國(guó)標(biāo)對(duì)抗生素殘留檢出限的要求，由表4、表5所示，綜合變色時(shí)間和檢測(cè)靈敏度兩個(gè)因素，可以判斷溴甲酚紫最佳含量為40 mg/L。

3.芽孢包埋濃度的確定

依照芽孢包埋濃度的優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方案，在相同的包埋培養(yǎng)基中加入不同含量菌液，制備試劑盒，進(jìn)行抗生素檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表6和圖1所示。

由表6所示，在一定范圍內(nèi)，隨著芽孢包埋量的增加，對(duì)5種抗生素的檢測(cè)靈敏度不斷提高，也逐漸趨于穩(wěn)定，綜合考慮靈敏度效果和國(guó)標(biāo)檢出限要求，最佳芽孢包埋量為在1×l07CFU/mL 。

4.試劑盒檢測(cè)限的確定

以蛋白胨1.0%、葡萄糖0.5 %、瓊脂0.5%、CMC 0.2%，甲酚紫含量40 mg/L、pH值為7.0，芽孢包埋量1×l07CFU/mL ，罐裝量為130 μL/孔，小試生產(chǎn)一批試劑盒，根據(jù)上述要求配置待檢測(cè)奶樣，添加100 μL奶樣至微孔中，在65 ℃下，孵育3 h，判斷試劑盒靈敏度范圍，結(jié)果如表7和圖2所示。

表2 四種培養(yǎng)基上產(chǎn)酸結(jié)果

表3 四種培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)速度

表4 溴甲酚紫含量對(duì)產(chǎn)酸變色效果的影響

表5 溴甲酚紫含量對(duì)試劑盒靈敏度的影響

表6 芽孢包埋量對(duì)試劑盒靈敏度的影響

由表7和圖2所示，經(jīng)過(guò)條件優(yōu)化，初步測(cè)定試劑盒的檢出限，分別是青霉素2 μg/L、磺胺嘧啶100 μg/L、強(qiáng)力霉素150 μg/L、林可霉素150 μg/L、頭孢氨芐100 μg/L。跟 Devotest?試劑盒無(wú)顯著差異。

結(jié)論與討論

本文主要對(duì)芽孢萌發(fā)培養(yǎng)基成分、指示劑、pH值、芽孢包埋量、罐裝量等影響芽孢萌發(fā)產(chǎn)酸條件等進(jìn)行優(yōu)化，最終確定最佳條件為蛋白胨1.0%、葡萄糖0.5% 、瓊脂0.5%、CMC 0.2%，溴甲酚紫含量40 mg/L、pH值為7.0，芽孢包埋量1×l07CFU/mL，罐裝量為130 μL/孔。

通過(guò)對(duì)五大類抗生素添加樣檢測(cè)，初步確定試劑盒的靈敏度。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試劑盒可以檢測(cè)出5大類抗生素，但靈敏度還需要提高，對(duì)5大類抗生素包涵的其它小類還需要進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證，確定不同種抗生素的檢測(cè)范圍。

圖1 不同濃度青霉素檢測(cè)結(jié)果

圖2 5種不同抗生素檢測(cè)結(jié)果

表7 試劑盒靈敏度檢測(cè)結(jié)果