程麗娜 閆春妮 宋蔚

白內(nèi)障是由遺傳、免疫及外部傷害等其他先天性或后天性因素導(dǎo)致的一種眼部疾病。臨床主要表現(xiàn)為單側(cè)或雙側(cè)、晶狀體渾濁、視物不清晰等，常發(fā)生于40歲以上人群，發(fā)病率隨年齡增大而升高。據(jù)報(bào)道全球因白內(nèi)障致盲的人數(shù)占40%以上[1]，其中約一半病例發(fā)生在亞洲等發(fā)展中國家，視力損害給患者生活造成極大不便，但白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確。因此，不斷尋找有效的診斷指標(biāo)，探求白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)理對(duì)病情防治十分重要。研究表明白內(nèi)障發(fā)病的首要環(huán)節(jié)是晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，現(xiàn)今已發(fā)現(xiàn)miR-125、miR-181及miR-126等多種miRNA能夠通過調(diào)控人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，影響白內(nèi)障進(jìn)程[2]，caspase-3是與細(xì)胞凋亡有關(guān)的調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)量一定程度上可以反映出凋亡發(fā)生情況[3]。筆者查閱發(fā)現(xiàn)對(duì)于miR-126與caspase-3在白內(nèi)障疾病中作用及二者與晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的關(guān)系鮮有報(bào)道。本研究擬通過檢測(cè)白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中miR-126、caspase-3表達(dá)情況，分析二者與白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的聯(lián)系，旨在探討二者在白內(nèi)障疾病發(fā)生中作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年5月至2018年6月本院收治的78例白內(nèi)障患者為觀察組，其中男37例43眼，女41例46眼；年齡45～76歲，平均年齡(61.24±5.36)歲；同期選取52例正常人(角膜移植術(shù)供體)為對(duì)照組，男24例24眼，女28例28眼；年齡45～75歲，平均年齡(60.12±4.95)歲。2組研究對(duì)象一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 白內(nèi)障患者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)確診符合白內(nèi)障診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]；(2)患者均對(duì)本研究知情，并簽署知情同意書；(3)角膜散光<1.00D。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并青光眼、視神經(jīng)炎及其他眼底疾?。?2)合并高血壓、糖尿病及其他繼發(fā)性視力減退疾病；(3)自身免疫疾病、精神疾病及感染性疾病。

1.3 主要試劑及儀器 RNA提取試劑盒：購自于賽默飛世爾科技公司；SYBR?Green Kit：購自上海翊圣生物科技有限公司；引物：由南京科佰生物科技有限公司合成；多功能酶標(biāo)儀、qRT-PCR儀：購自美國Bio-Rad公司；流式細(xì)胞儀：購自艾森生物科技有限公司。

1.4 研究方法

1.4.1 樣品采集與保存:采用超聲乳化白內(nèi)障吸除術(shù)，收集患者晶狀體上皮細(xì)胞樣本，培養(yǎng)于DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.4.2 晶狀體上皮細(xì)胞中miR-126、caspase-3水平:收集晶狀體上皮細(xì)胞，采用RNA提取試劑盒提取晶狀體上皮細(xì)胞中總RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA。采用定量PCR儀分別對(duì)miR-126、caspase-3進(jìn)行擴(kuò)增。qRT-PCR分別采用SYBR?Green Kit試劑盒，反應(yīng)體系均為10 μl，具體步驟參見說明書；miR-126反應(yīng)條件：95℃：40 s；95℃：10 s；55℃：30 s，共40Cyc；caspase-3反應(yīng)條件：94℃：30 s；55℃：45 s；72℃：45 s，共30Cyc。miR-126及內(nèi)參U6、caspase-3及內(nèi)參β-actin的引物序列見下表。采用2-ΔΔCT法對(duì)miR-126、caspase-3表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4.3 晶狀體上皮細(xì)胞中caspase-3蛋白表達(dá)水平:Western blotting法測(cè)定晶狀體上皮細(xì)胞中caspase-3蛋白表達(dá)水平，加入裂解液靜置40 min后，12 000 r/min離心30 min，取上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，再轉(zhuǎn)移至PVDF薄膜上，加入一抗(anti-caspase-3)4℃孵育過夜，加入HRP標(biāo)記的IgG二抗稀釋液室溫孵育2 h后，以β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行拍照并計(jì)算caspase-3/β-actin值。每個(gè)樣品測(cè)定3次，取平均數(shù)。

1.4.4 晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率的測(cè)定:使用胰蛋白酶處理各樣本培養(yǎng)細(xì)胞，磷酸緩沖液洗滌后，離心10 min(2 000 r/min)，棄上清，將細(xì)胞濃度調(diào)至100 000/ml，滴加雙染劑靜置20 min后，轉(zhuǎn)至冰上，分別加500 μl結(jié)合緩沖液，混合均勻，放入流式細(xì)胞儀中進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 晶狀體上皮細(xì)胞中miR-126、caspase-3 mRNA水平比較 觀察組患者晶狀體上皮細(xì)胞中miR-126水平顯著高于對(duì)照組，caspase-3 mRNA水平顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 正常對(duì)照組及觀察組晶狀體上皮細(xì)胞中miR-126、Caspase-3 mRNA水平比較

2.2 晶狀體上皮細(xì)胞中caspase-3蛋白水平比較 觀察組白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞caspase-3蛋白水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。見圖1，表3。

圖1 Western印跡觀察晶狀體上皮細(xì)胞中caspase-3蛋白表達(dá)情況

2.3 晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率比較 觀察組白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。見表4。

表3 正常對(duì)照組及觀察組晶狀體上皮細(xì)胞中caspase-3蛋白水平比較

表4 正常對(duì)照組及白內(nèi)障觀察組晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率比較

2.4 白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中miR-126、caspase-3表達(dá)與晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率的相關(guān)性 白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中miR-126、caspase-3表達(dá)與晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率均呈顯著正相關(guān)(r=0.669，P<0.05；r=0.633，P<0.05)。見圖2、3。

圖2 白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中miR-126表達(dá)及其凋亡率的相關(guān)性分析

圖3 白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中caspase-3表達(dá)及其凋亡率的相關(guān)性分析

2.5 白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中miR-126、caspase-3表達(dá)的相關(guān)性 白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中miR-126水平與caspase-3表達(dá)水平顯著正相關(guān)(r=0.599，P<0.05)。見圖4。

圖4 白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中miR-126與caspase-3表達(dá)的相關(guān)性分析

3 討論

白內(nèi)障是晶狀體衰老造成的，晶狀體是眼內(nèi)一個(gè)無血管組織，具有屈光作用，能夠使眼球視物的焦點(diǎn)落到視網(wǎng)膜上。晶狀體由晶狀體囊及晶狀體纖維組成，在晶狀體與晶狀體囊之間有一單層上皮細(xì)胞即晶狀體上皮細(xì)胞，能夠分化成為晶狀體纖維，是晶狀體代謝活躍的細(xì)胞，上皮細(xì)胞的活性對(duì)晶狀體生長、分化、維持晶狀體的透明性及修復(fù)損傷有著至關(guān)重要的作用。研究表明，外部損傷、年齡老化及免疫代謝等均會(huì)使晶狀體上皮細(xì)胞活性降低，抗氧化能力下降，晶狀體內(nèi)自由基含量隨之上升，使得晶狀體受到氧化損傷，影響晶狀體的正常代謝及其他生理功能，導(dǎo)致晶狀體渾濁，引發(fā)白內(nèi)障，但其具體機(jī)制仍未明確[5]。隨著白內(nèi)障患病率逐年上升，尤其在亞洲等發(fā)展中國家現(xiàn)象更為明顯，給社會(huì)造成極大負(fù)擔(dān)，因此探尋白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制，對(duì)診斷白內(nèi)障疾病進(jìn)程具有重要意義。

微小RNA(miRNA)是一類單鏈小分子非編碼RNA，具有負(fù)性調(diào)節(jié)靶基因的功能[6]。研究表明，miRNAs在眼部功能方面具有重要調(diào)控作用，影響晶狀體細(xì)胞增殖、分化、衰老等過程，與白內(nèi)障等疾病進(jìn)程密切相關(guān)[7]。已報(bào)道的miRNAs有miR-34、miR-125、miR-181、miR-184及miR-126等。季青山等[8]探究了miR-34a/SIRT1在H2O2誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷可引起miR-34a表達(dá)水平上調(diào)，SIRT1表達(dá)水平下調(diào)。孫根柱等[9]研究表明miR-125a-3p在晶狀體上皮細(xì)胞凋亡中表達(dá)是下調(diào)的?？赡芘c白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。秦宇等[10]探討了miR-181調(diào)控白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞凋亡機(jī)制，結(jié)果表明miR-181能促進(jìn)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，可能為白內(nèi)障非手術(shù)治療提供新途徑。丁芝祥等[11]研究發(fā)現(xiàn)TGF-β2誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化時(shí)，細(xì)胞內(nèi)miR-184表達(dá)上調(diào)，且表達(dá)水平與誘導(dǎo)濃度及時(shí)間有關(guān)。汪靜[12]探究了miR-126表達(dá)水平對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-126可能通過調(diào)控HLEB3凋亡，從而在白內(nèi)障治療中發(fā)揮作用。與過往研究一致的是，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中miR-126水平表達(dá)量較正常人顯著上調(diào)，提示miR-126可能與白內(nèi)障的發(fā)病相關(guān)。

目前研究認(rèn)為，白內(nèi)障發(fā)病的首要環(huán)節(jié)是晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，晶狀體上皮細(xì)胞是晶狀體內(nèi)代謝最活躍的部位，它的凋亡會(huì)導(dǎo)致晶狀體上皮細(xì)胞密度降低，從而使晶狀體的正常生長受到影響[13]。此外晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)含有大量酶系統(tǒng)，具有抗晶狀體氧化損傷、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用。因此，晶狀體上皮細(xì)胞對(duì)于維持晶狀體透明十分重要。本研究發(fā)現(xiàn)，白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率高于正常人，提示晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率可能與白內(nèi)障疾病的發(fā)展相關(guān)。caspase-3是caspases半胱氨酸蛋白酶家族中的一員，又叫“殺手蛋白”，近年來研究人員發(fā)現(xiàn)caspase-3是細(xì)胞凋亡發(fā)生過程中的終末蛋白，在細(xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵的作用，細(xì)胞經(jīng)紫外線等物理、化學(xué)因素刺激后，caspase-3被激活，可使細(xì)胞中的細(xì)胞骨架等蛋白質(zhì)成分降解，從而發(fā)生細(xì)胞凋亡[14]。研究表明，caspase-3能夠降解晶狀體連接蛋白，提示caspase-3的表達(dá)可能參與了白內(nèi)障的形成[15]。鄭華峰等[16]研究了miR-126在大鼠心肌缺血再灌注早期的表達(dá)及作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-126的與caspase-3的激活有關(guān)，從而影響了缺血心肌細(xì)胞的凋亡。Li等[17]研究發(fā)現(xiàn)caspase-3與TUG1均為miR-421的直接靶標(biāo)，通過miR-421/caspase-3靶向調(diào)節(jié)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡。這與本實(shí)驗(yàn)有著相似之處，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)觀察組晶狀體上皮細(xì)胞中caspase-3 mRNA和蛋白水平均顯著高于對(duì)照組，與李延輝等[18]人對(duì)于老年性白內(nèi)障狀體上皮細(xì)胞凋亡及Caspase-3的表達(dá)情況研究一致，提示晶狀體上皮細(xì)胞凋亡及caspase-3的表達(dá)與白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。進(jìn)一步分析顯示，白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中miR-126、caspase-3水平與細(xì)胞凋亡率顯著正相關(guān)，miR-126水平與caspase-3表達(dá)水平亦呈顯著正相關(guān)。提示miR-126與caspase-3可能通過某種機(jī)制共同參與調(diào)節(jié)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)而影響白內(nèi)障疾病的發(fā)生及發(fā)展。

綜上所述miR-126、caspase-3在白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中高表達(dá)，與晶狀體上皮細(xì)胞凋亡有關(guān)，提示二者可能通過調(diào)節(jié)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡過程，參與白內(nèi)障發(fā)病過程調(diào)控。