于越乾 暴芳芳 劉紅 張福仁

山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬皮膚病醫(yī)院（山東省皮膚病醫(yī)院）山東省皮膚病性病防治研究所 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，濟南250022

通信作者：劉紅，Email：hongyue2519@hotmail.com

大皰性表皮松解癥（epidermolysis bullosa，EB）是由皮膚結(jié)構(gòu)蛋白基因突變導(dǎo)致的機械性大皰性疾病，臨床主要表現(xiàn)為機械性脆性皮膚、張力性大皰和糜爛結(jié)痂等。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少18 個基因突變會導(dǎo)致本病發(fā)生，單純型EB 主要致病基因為KRT5、KRT14 和PLEC，交界型EB 由LAMA3、LAMB3、ITGB4 和ITGA6 等 基 因 突 變 致 病，COL7A1 為營養(yǎng)不良型EB 的致病基因［1］。既往認(rèn)為EB 為單一基因突變所致，但近年國外文獻(xiàn)報道了4 例雙基因遺傳的病例。我們對收集到的1 例EB 家系進(jìn)行全基因組外顯子測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，患兒COL7A1 和PLEC 基因突變共存，為雙基因突變所致的隱性遺傳營養(yǎng)不良型EB（RDEB），在國內(nèi)為首次報道。

資料與方法

一、臨床資料

先證者男，2 歲，因手足部位出現(xiàn)水皰伴皮膚破損2年，于2018年4月30日來山東省皮膚病性病防治研究所就診。患兒出生后其口唇皮膚即出現(xiàn)破損，左側(cè)拇指出現(xiàn)大皰，后雙下肢包括雙足相繼出現(xiàn)水皰和大皰，皮損漸延及全身，并伴劇烈瘙癢。在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院對癥治療（具體不詳），療效不佳，為進(jìn)一步治療遂來我院?；颊邿o其他伴發(fā)疾病，足月生產(chǎn)，體格及智力發(fā)育均正常。患者家族成員2代4人中沒有類似病史。患者父母非近親婚配。

體檢：一般情況可。皮膚科檢查：頭面、軀干、四肢伸側(cè)及手足可見綠豆至核桃大小水皰、糜爛和結(jié)痂，四肢關(guān)節(jié)易受摩擦處尤為嚴(yán)重，尼氏征陰性（圖1）。無血皰，雙手足指趾甲及口腔黏膜未受累。結(jié)合病史及皮損表現(xiàn)，臨床擬診：EB。為進(jìn)一步明確其臨床型別，對患兒進(jìn)行全基因組外顯子測序。本研究經(jīng)過山東省皮膚病性病防治研究所倫理委員會批準(zhǔn)（批件號20181225KYKT014）。

圖1 患兒臨床照片 軀干（1A）及面部（1B）見綠豆至核桃大小水皰、糜爛，皰液清亮，部分干涸結(jié)痂

二、材料和方法

1.DNA 提取：患兒父母簽署知情同意書后，抽取家系中先證者及其父母外周血各5 ml。采用基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取外周血基因組DNA。

2.全基因組外顯子測序與Sanger測序驗證：構(gòu)建基因組文庫，通過探針雜交捕獲與EB 相關(guān)基因的外顯子及相鄰內(nèi)含子區(qū)域（50 bp），并進(jìn)行富集。富集的目的基因片段通過二代高通量測序儀（美國Illumina 公司）進(jìn)行測序，平均測序深度133.71X，測序數(shù)據(jù)與UCSC 網(wǎng)站中既往報道的EB相關(guān)基因組hg19 參考序列進(jìn)行比對，并對目標(biāo)區(qū)域的覆蓋度和測序質(zhì)量進(jìn)行評估，新一代測序由北京信諾佰世醫(yī)學(xué)檢驗所完成。得到的原始測序結(jié)果排除dbSNP151 數(shù)據(jù)庫、千人基因組數(shù)據(jù)庫、HapMap Project數(shù)據(jù)庫等數(shù)據(jù)庫中存在的單核苷酸多態(tài)性位點，通過BWA軟件對序列進(jìn)行比對，并優(yōu)先與已報道的EB相關(guān)基因比對。

根據(jù)二代測序結(jié)果，對篩選的位點進(jìn)行Sanger測序驗證，并在100例健康對照中驗證該位點。應(yīng)用SIFT 和PolyPhen 軟件對發(fā)現(xiàn)突變的有害性進(jìn)行預(yù)測。

結(jié) 果

先證者PLEC 基因第12772 位核苷酸發(fā)生G→A 雜合突變（NM_000445.4：c.12772G＞A），為新發(fā)突變，導(dǎo)致第4258 位氨基酸由谷氨酸變?yōu)橘嚢彼幔╬.Glu4258Lys），先證者母親攜帶該突變，父親不攜帶此突變，此突變系從母親遺傳獲得（圖2）。

同時，先證者COL7A1基因攜帶2個移碼突變，27 號外顯子第3625 位發(fā)生11 個堿基缺失（NM_000094.3：c.3625_3635delTCTGTCCAGAC），74號外顯子第6270 位發(fā)生新發(fā)突變，為1 個堿基缺失（c.6270delT）所致的移碼突變，測序結(jié)果見圖3。先證者父親同時攜帶上述2個移碼突變，母親沒有檢測到COL7A1 基因突變，證實患兒COL7A1 的突變來自父親。

所有突變都經(jīng)過反向測序驗證，100 例無關(guān)健康對照及公共數(shù)據(jù)庫（dbSNP151數(shù)據(jù)庫、千人基因組數(shù)據(jù)庫、HapMap Project數(shù)據(jù)庫）中未發(fā)現(xiàn)類似突變。對突變的有害性進(jìn)行預(yù)測，提示以上3個突變均為有害突變，預(yù)測有致病性。

討 論

RDEB由編碼Ⅶ型膠原的COL7A1基因突變所致，在不同臨床類型的RDEB中，已報道400多個突變位點。Ⅶ型膠原包括中央三螺旋桿狀膠原區(qū)域以及氨基端和羧基端，是基底膜帶錨纖維的主要組成成分。錨纖維是維持表皮和真皮密切連接的重要結(jié)構(gòu)，缺失會導(dǎo)致皮膚脆性增加［2］。COL7A1 定位在3p21.1，內(nèi)含復(fù)雜內(nèi)含子和118 個外顯子［3］。在RDEB患者中，COL7A1突變主要包括錯義突變、剪切位點突變、移碼突變、堿基缺失及插入和甘氨酸置換。影響同源三聚體裝配以及二聚體二硫鍵形成的相關(guān)位點的錯義突變較多見，會破壞Ⅶ型膠原的穩(wěn)定性。最嚴(yán)重的突變可導(dǎo)致提前終止編碼，無功能肽鏈無法組成錨纖維［4］。本例先證者及其父親在COL7A1攜帶復(fù)合突變，27號外顯子c.3625?3635del11 以及74 號外顯子c.6270delT，造成編碼區(qū)移碼突變，提前終止編碼，肽鏈合成提前終止，產(chǎn)生無功能肽鏈。姜薇等［5］于2005 年首次報道1 例Hallopeau?Siemens 型RDEB 患者攜帶COL7A1基因c.3625?3635del11突變。

圖2 先證者及其父母PLEC基因測序結(jié)果 患者及其母親攜帶PLEC基因c.12772G＞A突變，父親未攜帶此突變

除COL7A1 基因突變外，本文患兒同時攜帶PLEC基因突變。PLEC基因編碼網(wǎng)蛋白，該蛋白為相對分子質(zhì)量500 000 的中間絲結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞骨架組織的連接［6］，并且富集于基底層角質(zhì)形成細(xì)胞，在基底層細(xì)胞骨架、半橋粒和基底膜之間起連接作用［7］。PLEC 突變是8%的單純型EB 患者的致病基礎(chǔ)［8］，目前國際上尚未在RDEB 患者中發(fā)現(xiàn)PLEC 基因突變。本研究顯示，先證者PLEC 的第12772 位核苷酸發(fā)生G→A 雜合突變，導(dǎo)致第4258號氨基酸發(fā)生谷氨酸到賴氨酸改變，功能預(yù)測有害，而該突變此前未見報道。

本文先證者攜帶COL7A1 與PLEC 基因3 處突變，但無家族史，其父母各攜帶1 個基因的突變位點，提示攜帶單基因突變可能不導(dǎo)致EB 的發(fā)生，這和Floeth 和Bruckner?Tuderman［9］的觀點一致，即單個基因突變位點的發(fā)現(xiàn)不足以證實某些特殊家系的遺傳基礎(chǔ)。雙基因遺傳病指兩個基因累積效應(yīng)所致的遺傳病，當(dāng)兩個不同基因突變發(fā)生于同一個體時才會表現(xiàn)出疾病臨床表現(xiàn)。 Vahidnezhad等［10］通過二代測序?qū)?1 例EB 家系進(jìn)行遺傳學(xué)分析，明確了68 例家系致病基因及突變位點，仍有25%的患者不能確定致病基因突變。Padalon?Brauch等［11］提出雙基因遺傳可以解釋部分EB高度可變的臨床表型。

圖3 先證者及其父母COL7A1基因測序結(jié)果 先證者及其父親同時攜帶COL7A1基因的2個突變，母親該基因未見突變

迄今為止，國內(nèi)外共有4例發(fā)生雙基因突變的EB 家系報道，其中3 例為單純型EB 患者KRT5 和KRT14基因突變共存。Padalon?Beauch 等報道1例患泛發(fā)性單純型EB 的2 歲男孩，從患有局限性單純型EB 的母親遺傳獲得突變KRT5 基因p.Ile183Thr，從無臨床癥狀的父親遺傳獲得突變KRT14 基因p.Arg388His，患兒出生后即出現(xiàn)嚴(yán)重的水皰，未累及黏膜［11］。Wertheim?Tysarowska 等［12］報道1例臨床癥狀相似的病例，先證者從沒有臨床癥狀的母親獲得KRT5基因p.Arg471His突變，從患有局限性單純型EB 的父親獲得KRT14 基因突變p.Met272Thr，先證者出生后全身出現(xiàn)廣泛性水皰；Kim 等［13］報道1 例沒有家族史的4 歲患兒，分別從母親和父親遺傳獲得KRT5 基因突變Leu155Pro 和KRT14基因突變Met294Thr，Leu155Pro位于角蛋白5 的1A 保守區(qū)域，Met294Thr 位于角蛋白14 的2B區(qū)域，親水的極性蘇氨酸代替了疏水的非極性蛋氨酸，功能預(yù)測皆為有害突變。有趣的是，患兒同母異父的弟弟僅攜帶KRT5 基因Leu155Pro 突變，但未出現(xiàn)臨床癥狀，證實單個基因突變不會導(dǎo)致角蛋白功能缺失。此外，F(xiàn)loeth 和Bruckner?Tuderman［9］報道COL17A1 與LAMB3 雙基因突變的患者，父母親攜帶單一突變且沒有臨床癥狀，患兒同時攜帶雙基因突變，出生即出現(xiàn)皮膚和黏膜受累，結(jié)合病理結(jié)果，診斷為交界型EB。

雙基因間蛋白產(chǎn)物相互作用以及基因座之間的聯(lián)系是致雙基因遺傳病的基礎(chǔ)。基底膜帶結(jié)構(gòu)由不同基因產(chǎn)物共同維持，EB 雙基因遺傳可能與基因產(chǎn)物相互作用相關(guān)。功能實驗證實網(wǎng)蛋白和ⅩⅦ型膠原之間結(jié)合有助于維持表皮結(jié)構(gòu)穩(wěn)定［14］。此外，表皮內(nèi)角蛋白5與角蛋白14交聯(lián)形成二聚體構(gòu)成中間絲，網(wǎng)蛋白C端結(jié)構(gòu)域有助于自身與角蛋白的結(jié)合，并協(xié)同發(fā)揮作用以確保與中間絲結(jié)合［15］。以上蛋白相關(guān)基因的突變，導(dǎo)致無功能蛋白產(chǎn)物，從而導(dǎo)致EB的發(fā)生。

本文報道1 例雙基因突變導(dǎo)致的RDEB 患兒，患兒父親攜帶COL7A1 基因的2 個移碼突變，但并未出現(xiàn)臨床癥狀，推測其另1條正常等位基因可以合成足夠的mRNA 來滿足錨纖維的數(shù)量和質(zhì)量。患兒母親攜帶PLEC 基因的一個點突變，網(wǎng)蛋白雖可以合成，但是錯義突變影響了氨基酸，從而影響了網(wǎng)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。檢索中國知網(wǎng)、維普和萬方數(shù)據(jù)庫以及PubMed 數(shù)據(jù)庫（截至2019 年5 月），顯示本例為國內(nèi)報道的首例攜帶雙基因突變的EB病例，其基因檢測結(jié)果進(jìn)一步豐富了EB 的突變致病基因位點庫，為EB遺傳咨詢提供了新的依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突