何震宇

(廣東藥科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，廣東 廣州 510006)

葉酸是一種人體必需的B族維生素，它在人體中經(jīng)過兩步還原反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)樗臍淙~酸(FH4)。FH4能夠攜帶一碳單位參與(脫氧)核苷酸的合成，從而間接參與核酸的合成。FH4可以轉(zhuǎn)變?yōu)镹5,N10-亞甲四氫葉酸，N5,N10-亞甲四氫葉酸能被5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)镹5-甲基四氫葉酸(N5-CH3-FH4)。N5-CH3-FH4在甲硫氨酸合成酶的催化下提供甲基使同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)轉(zhuǎn)變成甲硫氨酸，同時(shí)釋放出游離的FH4，這步反應(yīng)具有如下意義：(1)降低血液中同型半胱氨酸水平，而同型半胱氨酸為動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；(2)促進(jìn)FH4的再生；(3)甲硫氨酸可進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)镾-腺苷甲硫氨酸(SAM)，SAM為體內(nèi)重要的甲基供體，很多重要的生理活性物質(zhì)比如腎上腺素、肉堿、膽堿及肌酸等的合成需要它提供甲基，DNA、蛋白質(zhì)等的甲基化也有賴于它[1]。甲硫氨酸合成酶發(fā)揮活性需要輔助因子維生素B12，但維生素B12容易氧化失活從而導(dǎo)致甲硫氨酸合成酶失活。甲硫氨酸合成酶還原酶(methionine synthase reductase，MSR)又叫5-甲基四氫葉酸-同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶還原酶(5-methyltetrahydrofolate-homocysteine methyltransferase reductase，MTRR)，它能使氧化型維生素B12發(fā)生甲基化還原生成有活性的維生素B12從而恢復(fù)甲硫氨酸合成酶的活性[2]。綜上所述，不難看出，葉酸代謝通路對(duì)維持人體健康至關(guān)重要，該代謝通路的關(guān)鍵酶MTHFR、MTRR如果存在遺傳缺陷的話，勢(shì)必會(huì)不同程度地影響人體健康。目前，對(duì)人體健康影響最大、受關(guān)注度最高的基因多態(tài)位點(diǎn)為MTHFR基因C677T、A1298C位點(diǎn)及MTRR基因A66G位點(diǎn)。

1 葉酸代謝常見基因多態(tài)位點(diǎn)及臨床意義

1.1 MTHFR基因C677T位點(diǎn)和A1298C位點(diǎn)

5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶的編碼基因MTHFR基因定位于1p36.3[3]，包含11個(gè)外顯子[4]。MTHFR基因錯(cuò)義突變是引起酶活性缺乏和降低的主要機(jī)制，最常見的一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)是C677T，它會(huì)導(dǎo)致多肽鏈相應(yīng)的丙氨酸(Ala)被纈氨酸(Val)取代，從而降低MTHFR的熱穩(wěn)定性和活性，在46 ℃加熱5 min的情況下，CC、CT、TT基因型樣品殘余的酶活性分別為67%、56%、22%；正常情況下，TT型樣品的活性約為CC型樣品的50%[5-6]。另一個(gè)常見的多態(tài)位點(diǎn)是A1298C，它由Viel A等[7]最先發(fā)現(xiàn)，該突變可導(dǎo)致多肽鏈中相應(yīng)的谷氨酸(Glu)被丙氨酸(Ala)取代，使用淋巴細(xì)胞提取液測(cè)定酶活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，CC型突變純合子的酶活性大約只有正常野生型純合子酶活性的60%，A1298C和C677T雙雜合子的酶活性為野生型的50%～60%[8]；使用體外表達(dá)的酶進(jìn)行研究表明，相較于野生型酶，1298C單位點(diǎn)突變、677T單位點(diǎn)突變、1298C和677T雙位點(diǎn)突變酶的活性分別為68%、45%、41%[9]。

1.2 MTRR基因A66G位點(diǎn)

甲硫氨酸合成酶還原酶的編碼基因MTRR基因定位于5p15.2-15.3[10]，大約34 kb，包含15個(gè)外顯子[11]。

MTRR基因最常見的一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)是A66G，它會(huì)導(dǎo)致多肽鏈第22位的異亮氨酸被甲硫氨酸取代(I22M)，體外研究表明，要想使甲硫氨酸合成酶達(dá)到最大反應(yīng)速度，M22變異體相對(duì)于I22野生型酶而言，反應(yīng)體系中使用甲硫氨酸合成酶還原酶與甲硫氨酸合成酶的比率要高3～4倍[2]，意味著該位點(diǎn)對(duì)甲硫氨酸合成酶還原酶的活性影響非常之大。

顯然，上述3個(gè)位點(diǎn)都會(huì)對(duì)其相應(yīng)的酶活性造成較大影響，從而引起血漿同型半胱氨酸水平上升、一碳單位代謝障礙，與唐氏綜合征[12-13]、唇腭裂[14-15]、神經(jīng)管缺陷[16-17]、心腦血管疾病[18-22]、自閉癥[23]、精神分裂癥[24]、腫瘤[25-26]、反復(fù)自然性流產(chǎn)[27]、男性不育[28]等多種疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。

中國(guó)人群C677T、A1298C和A66G多態(tài)位點(diǎn)基因型和等位基因頻率存在顯著的地理和種族差異[29]，見表1。因此，加強(qiáng)這3個(gè)位點(diǎn)的基因分型研究，對(duì)臨床疾病診斷及風(fēng)險(xiǎn)性預(yù)測(cè)具有重要意義。

2 針對(duì)葉酸代謝通路常見多態(tài)位點(diǎn)的檢測(cè)方法

2.1 聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)

該法先用PCR擴(kuò)增包含多態(tài)位點(diǎn)的DNA片段，然后用相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，酶切產(chǎn)物再通過電泳予以分離，根據(jù)電泳圖譜中酶切片段的數(shù)目和大小判斷基因型。 其中MTHFR基因C677T位點(diǎn)關(guān)聯(lián)堿基序列GAGYC(Y=C或T)，突變型等位基因T的相應(yīng)序列GAGTC能夠被限制性核酸內(nèi)切酶HinfⅠ識(shí)別，反之，野生型等位基因C的相應(yīng)序列GAGCC不能被HinfⅠ識(shí)別，從而可用HinfⅠ甄別該位點(diǎn)；MTHFR基因A1298C位點(diǎn)關(guān)聯(lián)堿基序列GAAGM(M=A或C)，野生型等位基因A的相應(yīng)序列GAAGA能夠被限制性核酸內(nèi)切酶MboⅡ識(shí)別，反之，突變型等位基因C的相應(yīng)序列GAAGC不能被MboⅡ識(shí)別，從而可用MboⅡ鑒定該位點(diǎn)；MTRR基因A66G位點(diǎn)關(guān)聯(lián)堿基序列AATRTG(R=A或G)，本來沒有合適的限制性核酸內(nèi)切酶甄別該序列，但通過錯(cuò)配引物PCR將其變?yōu)镃ATRTG后，野生等位基因A的相應(yīng)序列為CATATG，能被限制性核酸內(nèi)切酶NdeⅠ識(shí)別，反之，突變型等位基因G的相應(yīng)序列為CATGTG，不能被限制性核酸內(nèi)切酶NdeⅠ識(shí)別，從而可以用NdeⅠ來鑒定該位點(diǎn)，這個(gè)位點(diǎn)采用了所謂的引物介導(dǎo)的限制性分析 PCR (PCR-primer introduced restriction analysis,PCR-PIRA)。Nasri等[30]在研究MTHFR基因C677T位點(diǎn)、A1298C位點(diǎn)及MTRR基因A66G 位點(diǎn)與神經(jīng)管缺陷的關(guān)系時(shí)，基因分型采用的正是PCR-RFLP法。盡管PCR-RFLP法是一種經(jīng)典的基因分型方法，操作簡(jiǎn)單，對(duì)儀器設(shè)備要求低，但由于涉及酶切反應(yīng)，酶切不完全容易導(dǎo)致基因型誤判，不過在PCR產(chǎn)物中引入內(nèi)對(duì)照酶切位點(diǎn)可以克服這一缺點(diǎn)[31]。此外，目前針對(duì)3個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)需要使用3種不同的內(nèi)切酶，難以在同一反應(yīng)體系進(jìn)行3個(gè)位點(diǎn)的酶切反應(yīng)，若能實(shí)現(xiàn)3個(gè)位點(diǎn)的同管酶切檢測(cè)，必將大幅提高檢測(cè)效率。

表1 中國(guó)不同地區(qū)葉酸代謝基因主要多態(tài)位點(diǎn)突變等位基因及基因型頻率
Table1Mutant alleles and genotypes frequencies of major polymorphisms of folate metabolism genes in different regions of China

多態(tài)位點(diǎn)(突變等位基因在后)地區(qū)突變純合子基因型頻率/%突變等位基因頻率/%MTHFR基因 C677T南方7(5-8)25(23-27)中部19(16-21)41(36-45)北方28(25-31)53(51-55)MTHFR基因 A1298C南方7(5-9)28(24-31)中部4(3-4)18(17-19)北方3(2-3)17(16-19)MTRR基因A66G南方8(6-10)29(28-31)中部6(6-7)25(23-27)北方6(5-6)24(23-25)

2.2 擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)聚合酶鏈反應(yīng)(amplication refractory mutation system-PCR，ARMS-PCR)

該法又叫等位基因特異性PCR(allele specific PCR，AS-PCR)，它使用針對(duì)每個(gè)位點(diǎn)的2種等位基因特異性引物即野生型引物PW和突變型引物PM配合常規(guī)引物進(jìn)行PCR，通過電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否出現(xiàn)PW、PM特異的目的條帶來分辨基因型[32-33]。Lajin B等[34]使用該技術(shù)成功地建立了一種同管檢測(cè)MTHFR基因C677T位點(diǎn)、A1298C位點(diǎn)及MTRR基因A66G 位點(diǎn)3個(gè)位點(diǎn)的方法，并檢測(cè)了126例樣本。該方法只需PCR反應(yīng)和常規(guī)的電泳就可檢測(cè)樣本基因型，簡(jiǎn)便、快速、成本低，但影響特異性擴(kuò)增的因素較多，PCR條件優(yōu)化不當(dāng)時(shí)容易造成基因分型錯(cuò)誤。

2.3 測(cè)序(Sequencing)

Sanger測(cè)序(雙脫氧鏈終止法)是基因檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但需要昂貴的測(cè)序儀器和專業(yè)操作人員。Guo QN等[35]在一項(xiàng)研究中檢測(cè)了212名個(gè)體MTHFR基因C677T位點(diǎn)、A1298C位點(diǎn)及MTRR基因A66G 位點(diǎn)的基因型，它們均由專業(yè)測(cè)序公司采用Sanger測(cè)序法完成。

焦磷酸測(cè)序(Pyrosequencing)是可與Sanger測(cè)序媲美的另一種測(cè)序技術(shù)。其原理是：引物與模板DNA退火后，在4種酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個(gè)dNTP的聚合與一次熒光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測(cè)熒光的釋放和強(qiáng)度達(dá)到實(shí)時(shí)測(cè)定DNA序列的目的。該方法不僅需要昂貴的焦磷酸測(cè)序儀，而且測(cè)序反應(yīng)體系中每種成分和參數(shù)的優(yōu)化都比較麻煩。Roberto M等[36]在研究參與氟嘧啶代謝和5-氟尿嘧啶(5-FU)降解的基因的多態(tài)性時(shí)，使用該法檢測(cè)了142例胃腸道腫瘤患者的MTHFR基因C677T位點(diǎn)、A1298C位點(diǎn)的基因型。

2.4 實(shí)時(shí)熒光PCR (real-time PCR，RT-PCR)

該法是在PCR擴(kuò)增過程中，通過熒光信號(hào)對(duì)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)的一種方法。在進(jìn)行SNP分型時(shí)，PCR反應(yīng)體系里除了引物外，還有探針，最常見的為Taqman探針，每個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的2個(gè)等位基因各有其標(biāo)記不同顏色熒光基團(tuán)的特異性探針，未發(fā)生PCR擴(kuò)增時(shí)，探針上一側(cè)的熒光會(huì)被探針上另一側(cè)的淬滅基團(tuán)吸收，反應(yīng)體系無法檢測(cè)到熒光，一旦發(fā)生PCR擴(kuò)增，探針上的淬滅基團(tuán)會(huì)被水解，熒光基團(tuán)發(fā)出熒光隨即被檢測(cè)，最后根據(jù)檢測(cè)到的累積熒光就可判斷樣品的基因型。墨西哥學(xué)者在研究類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度與相關(guān)單核苷酸多態(tài)性之間的潛在聯(lián)系時(shí)，就采用基于Taqman探針的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)了MTHFR基因C677T位點(diǎn)、A1298C位點(diǎn)及MTRR基因A66G 位點(diǎn)的基因型[37]。王蘇梅等[ 38]使用該法檢測(cè)了100例樣本，與PCR-RFLP法比較，符合率96%。該法操作簡(jiǎn)單、快速，但探針成本較高，且反應(yīng)體系中引物、探針的濃度乃至DNA聚合酶的用量均需優(yōu)化，給實(shí)驗(yàn)增加了一定的難度。

2.5 高分辨熔解曲線技術(shù)( high-resolution melting，HRM)

該法在PCR反應(yīng)體系中加入一種飽和熒光染料，該熒光染料能結(jié)合到雙鏈的DNA分子上，在PCR反應(yīng)結(jié)束后，不斷升溫，使PCR產(chǎn)物上的熒光染料不斷脫落導(dǎo)致熒光信號(hào)下降，從而繪制出相應(yīng)的熔解曲線，并根據(jù)熔解曲線的變化判斷樣本的基因型，因?yàn)椴煌蛐蜆颖綪CR產(chǎn)物的堿基序列存在差異，解鏈行為不同導(dǎo)致熔解曲線存在差異。潘登等[39]使用該法檢測(cè)了96例樣本MTHFR基因C677T位點(diǎn)、A1298C位點(diǎn)及MTRR基因A66G 位點(diǎn)的基因型，分型結(jié)果與測(cè)序結(jié)果完全一致。李玲使用該法檢測(cè)了1 000份樣品，其中只有2例與測(cè)序結(jié)果不符，準(zhǔn)確率99.8%[40]。HRM法操作簡(jiǎn)便、快速，不需要探針，但對(duì)儀器溫度的均一性要求非常高，反應(yīng)條件極為苛刻，必須反復(fù)摸索。

2.6 變性高效液相色譜(denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)

該方法是先通過PCR獲得靶DNA分子，然后將DNA分子進(jìn)行變性和復(fù)性，雜合子樣品在復(fù)性的過程中會(huì)形成同源雙鏈和異源雙鏈，在部分變性溫度條件下，異源雙鏈因有錯(cuò)配區(qū)的存在而更易變性，在色譜柱中的保留時(shí)間少于同源雙鏈，故先被洗脫下來，出現(xiàn)2個(gè)峰或多個(gè)峰。李才明等[41]用此法檢測(cè)了334例南方漢族人的MTHFR基因C677T位點(diǎn)，CT基因型顯示為2個(gè)峰，而CC和TT基因型標(biāo)本在單獨(dú)進(jìn)樣時(shí)僅出現(xiàn)單峰，而將CC和TT基因型的PCR產(chǎn)物混合后再進(jìn)樣，可出現(xiàn)與CT基因型標(biāo)本類似的雙峰，經(jīng)酶切和測(cè)序驗(yàn)證，準(zhǔn)確率99%以上。DHPLC檢測(cè)高效快速，但對(duì)所用試劑和環(huán)境要求較高，否則容易產(chǎn)生誤差。

2.7 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/Ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOFMS)

它是將PCR產(chǎn)物變性為單鏈后使用引物延伸單個(gè)堿基(多態(tài)位點(diǎn)堿基)，根據(jù)引物在延伸反應(yīng)中所結(jié)合的不同堿基的不同質(zhì)量在質(zhì)譜儀上顯示不同峰而檢測(cè)SNP。該法分析速度快、準(zhǔn)確度高，但需要昂貴的質(zhì)譜儀，且對(duì)操作人員要求高。Suthandiram S等[42]使用Sequenom-MassARRAY平臺(tái)對(duì)372名非霍奇金淋巴瘤患者和722名對(duì)照者進(jìn)行基因分型以研究MTHFR基因 C677T和A1298C單核苷酸多態(tài)性與非霍奇金淋巴瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)。

2.8 DNA微陣列(DNA Microarray)

該技術(shù)在芯片上固定不同基因位點(diǎn)的特異性探針，然后與熒光標(biāo)記的單鏈PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交，通過雜交信號(hào)來判斷基因型。Gra O等[43]采用一種名叫“Pharmagen biochip”的DNA微陣列檢測(cè)了352名健康志愿者的MTHFR基因C677T位點(diǎn)、A1298C位點(diǎn)及MTRR基因A66G 位點(diǎn)的基因型。這類方法可一次性檢測(cè)出多個(gè)SNP位點(diǎn)，但特異性較差，樣品的制備和標(biāo)記較為繁瑣，檢測(cè)成本高。

2.9 探針介導(dǎo)的重組酶擴(kuò)增(probe-directed recombinase amplification，PDRA)

該方法雖然也涉及核酸的擴(kuò)增，但屬于恒溫?cái)U(kuò)增，不需像PCR那樣設(shè)置溫度循環(huán)。它針對(duì)每個(gè)位點(diǎn)設(shè)立2個(gè)實(shí)時(shí)反應(yīng)體系，每個(gè)反應(yīng)體系包含一條序列一致的引物和一條等位基因特異的探針，此外，還含有單鏈結(jié)合蛋白SSB、重組酶UvsX、DNA 聚合酶、核酸外切酶Ⅲ等主要成分。當(dāng)探針與靶DNA特異性雜交結(jié)合后，能夠被核酸外切酶Ⅲ在 多態(tài)位點(diǎn)3′端附近的一個(gè)人為引進(jìn)的四氫呋喃位點(diǎn)發(fā)生切割，切割產(chǎn)生的5′端片段能充當(dāng)引物，在SSB、UvsX、DNA 聚合酶的協(xié)同作用下完成靶序列的擴(kuò)增，切下的3′端片段上的熒光基團(tuán)則能發(fā)出熒光，通過相關(guān)儀器收集累積的熒光信號(hào)就能判斷基因型。Duan S等[44]使用該法檢測(cè)了150例先天性心臟病患者的MTHFR基因A1298C位點(diǎn)的基因型，擴(kuò)增反應(yīng)在39 ℃下35 min內(nèi)便可完成，分型結(jié)果與直接測(cè)序完全吻合。本法操作簡(jiǎn)便、快速，但引物的設(shè)計(jì)非常受限，引物的修飾標(biāo)記比較麻煩，只能用于部分多態(tài)位點(diǎn)的基因分型。

2.10 PCR-金磁微粒層析法(PCR-gold magnetic nanoparticles-based lateral flow assay)

該法先利用AMRS-PCR對(duì)樣品進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物兩端分別帶有地高辛及生物素標(biāo)記，它們經(jīng)過金磁微粒層析系統(tǒng)時(shí)，與層析體系中的偶聯(lián)地高辛單抗的金磁微粒及鏈親和素結(jié)合形成復(fù)合物，在層析試紙條的檢測(cè)線處聚集大量磁粒，進(jìn)而呈現(xiàn)紅色條帶，無擴(kuò)增結(jié)果則在檢測(cè)線上無條帶呈現(xiàn)。Hui W等[45]使用該法檢測(cè)了1 721例標(biāo)本，分型結(jié)果與測(cè)序結(jié)果吻合率高達(dá)99.6%。本法操作簡(jiǎn)單，無需大型貴重儀器，PCR結(jié)束后10 min內(nèi)可得到目視化結(jié)果，但引物標(biāo)記、金磁微粒層析系統(tǒng)成本不菲，而且也難以避免AMRS-PCR本身的弊端。

綜上所述,目前對(duì)葉酸代謝通路3個(gè)主要單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)的檢測(cè)方法較多，各有其優(yōu)缺點(diǎn)，在各種科學(xué)研究及臨床檢測(cè)中，應(yīng)綜合考慮實(shí)驗(yàn)成本、實(shí)驗(yàn)周期、結(jié)果的準(zhǔn)確性及相應(yīng)的儀器、設(shè)備條件，選擇合適的分型方法。