馬瑞瑞，羅宇琴，楊小龍，官永河，李國(guó)衛(wèi)，孫冬梅，陳向東

(廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244)

唇形科紫蘇屬一年生草本植物紫蘇Perillafrutescens(L.) Britt.有1個(gè)種、3個(gè)變種和7個(gè)變型，3個(gè)變種分別為白蘇Perillafrutescens(L.) Britt var typica (Makino) Makino、紫蘇Perillafrutescens(L.) Britt var acuta (Thunb.) Kudo和皺紫蘇Perillafrutescens(L.) Britt var crispa(Thunb.) Decne。本植物變異極大，我國(guó)古書(shū)上稱(chēng)葉全綠的為白蘇，稱(chēng)葉兩面紫色或面青背紫的為紫蘇，白蘇的花通常白色，紫蘇花常為粉紅至紫紅色，白蘇被毛通常稍密，果萼稍大，香氣亦稍遜于紫蘇[1]。2015年版《中國(guó)藥典》僅收載紫蘇子作為藥用植物來(lái)源[2]，因藥材細(xì)小，歷來(lái)混偽品較多。孫俊英[3]等對(duì)山東省市售的51批紫蘇子進(jìn)行質(zhì)量分析，結(jié)果顯示市售紫蘇子飲片不合格率較高，摻偽摻雜現(xiàn)象較嚴(yán)重。

目前，研究紫蘇子及其變種白蘇子鑒別的文獻(xiàn)較少，樊寶和等[4]通過(guò)紫外光譜及薄層色譜法研究紫蘇子和白蘇子成分的差異，發(fā)現(xiàn)紫蘇子與白蘇子成分雖有相同之處，但也有差異，不宜等同入藥。王雪利等[5]對(duì)目前市場(chǎng)上流通的紫蘇子及其偽品的微性狀進(jìn)行真?zhèn)螌?duì)比鑒別，得到在網(wǎng)眼大小、表面是否存在向上凸起的網(wǎng)脊以及是否存在腺鱗等性狀方面紫蘇子及其混偽品存在較大差異。黃亮輝等[6]采用HPLC法測(cè)定白蘇子和紫蘇子生品及其不同炮制品中迷迭香酸的含量，通過(guò)蘇子的HPLC圖中特征峰的強(qiáng)弱，可以區(qū)分白蘇子與紫蘇子。李燕等[7]對(duì)基于HPLC指紋圖譜的紫蘇子及其炮制品的質(zhì)量進(jìn)行研究，通過(guò)蘇子的HPLC圖中特征峰(峰)的缺失區(qū)分紫蘇子與其炮制品炒紫蘇子。以上研究均未考察紫蘇子及白蘇子化學(xué)成分的差異性，本文通過(guò)建立紫蘇子的UPLC特征圖譜，對(duì)紫蘇子、白蘇子及炒紫蘇子進(jìn)行對(duì)比分析，為紫蘇子藥材的鑒別提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 儀器

Waters H-Class型超高效液相色譜儀(沃特世公司)，Agilent SB C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；ME204E型萬(wàn)分之一天平(梅特勒-托利多公司)；XP26型百萬(wàn)分之一天平(梅特勒-托利多公司)；HWS-28型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)；KQ-500型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q Direct型超純水系統(tǒng)(默克股份有限公司)。

1.2 材料

紫蘇子及白蘇子藥材由廣東一方制藥有限公司提供，經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定分別為紫蘇子Perillafrutescens(L.) Britt.及白蘇子Perillafrutescens的干燥成熟果實(shí)，其中炒紫蘇子為實(shí)驗(yàn)室自制，樣品信息見(jiàn)表1。

表1 樣品信息表Table 1 Sample information table

1.3 試藥

咖啡酸對(duì)照品(批號(hào)：110885-201703，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%)、迷迭香酸對(duì)照品(批號(hào)：110871-201706，質(zhì)量分?jǐn)?shù)90.5%)、木犀草素對(duì)照品(批號(hào)：111520-201605，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%)、芹菜素對(duì)照品(批號(hào)：111901-201603，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.2%)均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件

以Agilent SB C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)為色譜柱；以乙腈為流動(dòng)相A，0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫(0～6 min，10%→18%A；6～15 min，18%→50%A)；流速為0.3 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為2 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素及芹菜素對(duì)照品適量，加80%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲醇溶液制成含每1 mL含咖啡酸32.6617 μg、迷迭香酸256.658 μg、木犀草素36.364 μg、芹菜素37.751 μg的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，加80%甲醇定容于10 mL，得到每1 mL含咖啡酸3.266 μg、迷迭香酸25.666 μg、木犀草素3.636 μg、芹菜素3.775 μg的混合對(duì)照品溶液。置于4 ℃冰箱中保存，備用。

2.3 供試品溶液的制備

取紫蘇子飲片(過(guò)2號(hào)篩)適量，取約0.5 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，加熱回流60 min，放冷，用80%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取紫蘇子藥材按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，分別取空白溶劑、對(duì)照品溶液及供試品溶液，各進(jìn)樣2 μL，色譜圖見(jiàn)圖1?？梢?jiàn),該分析方法能正確檢測(cè)所指認(rèn)的特征峰，陰性無(wú)干擾。

ABC0.40.20.00.40.20.00.40.20.0AU051015t/min

A.空白溶液； B.混合對(duì)照品溶液； C.紫蘇子供試品溶液；峰2.咖啡酸；峰7.迷迭香酸；峰11.木犀草素；峰12.芹菜素。

圖1紫蘇子特征圖譜專(zhuān)屬性考察

Figure1The specificity of characteristic chromatograms ofPerillasubplants

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取紫蘇子藥材，按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次。以迷迭香酸峰為參照峰S，計(jì)算各特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，結(jié)果各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD值均<1%，相對(duì)峰面積的RSD值均<5%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取紫蘇子藥材，按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，分別在0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣。以迷迭香酸峰為參照峰S，計(jì)算各特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，結(jié)果各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均<1%，相對(duì)峰面積的RSD值均<5%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批紫蘇子藥材，按“2.3”項(xiàng)方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以迷迭香酸峰為參照峰S，計(jì)算各特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，結(jié)果各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均<1%，相對(duì)峰面積的RSD值均<5%，表明方法重復(fù)性較好。

2.4.5 中間精密度試驗(yàn) 不同人員在不同時(shí)間，取同一批紫蘇子按“2.3”項(xiàng)方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件在不同儀器分別進(jìn)樣。以迷迭香酸峰為參照峰S，計(jì)算各特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，結(jié)果各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均<1%，相對(duì)峰面積RSD值均<5%,表明方法中間精密度較好。

2.5 樣品測(cè)定

基于已建立的特征圖譜方法對(duì)紫蘇子不同炒制品進(jìn)行測(cè)定，以迷迭香酸峰為參照峰，分別計(jì)算各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。

3 結(jié)果與分析

3.1 樣品測(cè)定結(jié)果

對(duì)上述23批樣品的特征圖譜進(jìn)行測(cè)定，以迷迭香酸峰為參照峰，分別計(jì)算各色譜峰相對(duì)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表2?？梢?jiàn)：不同基原紫蘇子及其炮制品相對(duì)峰面積的RSD值在35.15%～162.59%范圍，表明不同基原紫蘇子及其炮制品之間有明顯差異。從不同產(chǎn)地紫蘇子來(lái)看，河北省安國(guó)市的3批紫蘇子(Z8、Z9、Z10)與炒紫蘇子(C8、C9、C10)表現(xiàn)為峰4缺失，說(shuō)明不同產(chǎn)地間的樣品也存在成分差異。

3.2 單因素方差分析

對(duì)不同基原紫蘇子及其炮制品的特征圖譜相對(duì)峰面積通過(guò)SPSS V 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)及單因素方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。方差齊性檢驗(yàn)中，峰2、峰3不滿足方差齊性的假設(shè)(P<0.05)，考慮到這兩個(gè)峰數(shù)據(jù)較小，所以剔除；單因素方差分析中，峰1、峰2、峰3、峰5、峰6、峰10、峰11及峰12在不同基原紫蘇子及其炮制品存在顯著差異(P<0.05)，推斷基于上述特征峰可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同基原紫蘇子及炮制品進(jìn)行有效區(qū)分。

3.3 多重比較

基于單因素方差分析結(jié)果，采用最小顯著差數(shù)法LSD進(jìn)一步對(duì)不同基原紫蘇子及其炮制品進(jìn)行多重比較[8]，結(jié)果見(jiàn)表4。

表2 23批樣品特征圖譜相對(duì)峰面積測(cè)定結(jié)果Table 2 The relative peak area of 23 lots of sample characteristic chromatograms

表3 方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析Table 3 Homogeneity of variance test & One-way anova

表4 多重比較結(jié)果Table 4 Results of multiple comparisons

由表4可見(jiàn)，不同基原紫蘇子及其炮制品間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，將多重比較相關(guān)信息整理，可以得出3組不同樣品之間存在顯著差異的特征峰，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 組間差異特征峰Table 5 The characteristic peaks of difference between groups

由表5和圖2可見(jiàn)，紫蘇子與炒紫蘇子的峰1、峰2、峰3及峰12，紫蘇子與白蘇子的峰3、峰5、峰6、峰11及峰12，炒紫蘇子與白蘇子的峰1、峰2、峰5、峰6及峰10之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.4 主成分分析

用SPSS V20.0軟件對(duì)23批樣品特征圖譜所得的11個(gè)共有峰進(jìn)行主成分分析，得出相關(guān)矩陣的特征值及方差分析，結(jié)果見(jiàn)表6。可見(jiàn)，前3個(gè)成分的特征值分別為4.253、2.472、2.272，對(duì)于總方差的累積貢獻(xiàn)率達(dá)81.792%，基本保留了原樣本信息，所以確定提取的主成分?jǐn)?shù)為3個(gè)。根據(jù)主成分載荷矩陣表7可知，峰8和峰13對(duì)主成分1的影響最大，峰2對(duì)主成分2的影響較大，峰3對(duì)主成分3的影響最大。以3個(gè)主成分分別作為X、Y、Z軸得23個(gè)樣品的主成分得分圖，可以將23批樣品分為3類(lèi)，即Ⅰ類(lèi)紫蘇子、Ⅱ類(lèi)炒紫蘇子、Ⅲ類(lèi)白蘇子，見(jiàn)圖3。主成分3在炮制后降低，可能是由于峰3對(duì)于溫度比較敏感，可以用峰3來(lái)區(qū)分紫蘇子與炒紫蘇子，與多重比較結(jié)果一致。在Ⅰ類(lèi)中有3批炒紫蘇子(C4、C5、C6)，在Ⅱ類(lèi)中有1批紫蘇子(Z8)，這4組樣品(C8和Z8，C4和Z4，C5和Z5，C6和Z6)分布位置靠近，推測(cè)可能是由于該4組樣品與其他樣品的組間差異較樣品炮制前后的組內(nèi)差異大導(dǎo)致。

ZSZCZSZZSZCZSZCZSZBSZZSZBSZCZSZBSZCZSZBSZF1F2F10F3F6F12F11F1F2F12F30.030.020.010.000.150.100.050.000.150.100.050.00ABCD(F5)E(F6)F

A：紫蘇子與炒紫蘇子相對(duì)峰面積均值對(duì)比圖； B～C：紫蘇子與白蘇子相對(duì)峰面積均值對(duì)比圖； D～F：炒紫蘇子與白蘇子相對(duì)峰面積均值對(duì)比圖。

圖2不同基原紫蘇子及其炮制品相對(duì)峰面積均值對(duì)比圖

Figure2Comparison of the mean relative peak area ofPerillaseedsand their processed products

表6 特征值及方差分析Table 6 Characteristic value and analysis of variance

表7 主成分載荷矩陣Table 7 Principal component load matrix

主成分1主成分2主成分3

圖3主成分得分圖
Figure3Principal component score plot

4 結(jié)論

本研究在建立紫蘇子UPLC特征圖譜方法的基礎(chǔ)上，通過(guò)單因素方差分析、多重比較及主成分分析，對(duì)紫蘇子、炒紫蘇子及白蘇子的化學(xué)成分進(jìn)行了比較，總結(jié)出紫蘇子炮制前后及不同基原間的成分差異規(guī)律，為紫蘇子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定、品質(zhì)評(píng)價(jià)提供了參考；建立的紫蘇子的UPLC特征圖譜方法重現(xiàn)性良好，樣品制備簡(jiǎn)單，分析時(shí)間短，為紫蘇子的質(zhì)量控制提供參考。