夏紅雷，劉立中,，鮑玲紅，李繁，鄭康鈺，莫鎮(zhèn)杰，劉青，陳佛華，謝清春，班俊峰，呂竹芬

(1.寧波市鎮(zhèn)海區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，浙江 寧波 315202； 2.廣東藥科大學(xué)廣東省藥物新劑型重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006)

角膜房水屏障(corneal aqueous barrier，CAB)是阻礙藥物向眼內(nèi)遞送的重要生理屏障。Musaed等[1]研究阿昔洛韋混懸液與PLGA納米粒對(duì)角膜滲透性的作用發(fā)現(xiàn)后者的角膜透過量是前者的1.43倍；Roberto等[2]也證明氟米龍PLGA納米粒的角膜滲透量是市售制劑Isopotoflucon?的2.27倍；MO等[3]制備了基于脂質(zhì)納米粒的凝膠滴眼液，與市售TobraDex?對(duì)比，所制備滴眼液的角膜透過量是市售制劑的2.56倍，由此可見，納米藥物遞送系統(tǒng)能顯著增加滴眼給藥后藥物角膜透過量，但針對(duì)滴眼給藥后納米粒藥物滲透性的研究國內(nèi)鮮有報(bào)道。

目前，評(píng)價(jià)藥物跨角膜滲透性的方法主要有以離體家兔角膜為屏障模型考察PLGA納米粒滲透特性[4]，以細(xì)胞屏障模型研究重組蛋白滴眼液穿透眼球屏障能力[6]及以角膜穿刺術(shù)研究在體測(cè)定凝膠藥物滲透性[5]等方法，其中，在體實(shí)時(shí)檢測(cè)藥物濃度的方法可為評(píng)價(jià)遞送系統(tǒng)跨角膜滲透能力提供最可靠的信息。本文采用離體角膜及在體房水微透析方法，比較地塞米松納米粒溫敏凝膠、地塞米松納米粒和市售制劑(TobraDex?)的離體角膜滲透性及跨角膜進(jìn)入房水中的滲透量，為進(jìn)一步研究地塞米松跨CAB向眼內(nèi)遞藥及開發(fā)地塞米松眼用凝膠提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)與技術(shù)參考。

1 儀器與材料

1.1 藥品與試劑

1.2 儀器

Delsa Nano C粒度/ζ電位分析儀(美國Beckman Coulter公司)；DSC 4000差示量熱掃描儀(美國PerkinElmer公司)；Spectrum100紅外光譜儀(美國PerkinElmer公司)；BS224S及CP225D電子分析天平(德國Sartorius公司)；NS 1001L高壓均質(zhì)機(jī)(意大利NiroSoavi公司)；RE 52-05旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；Ultimate 3000高效液相色譜儀(美國Dionex公司)；TK-12B透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀(上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司)；mini G小型離心機(jī)(德國IKA公司)；ESP-32微透析注射泵(日本Eicom公司)；EFC-96微透析自動(dòng)采樣系統(tǒng)(日本Eicom公司)；JY88IIN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.3 動(dòng)物

體質(zhì)量1.8～2.2 kg日齡80～90 d健康的新西蘭兔，由廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心三水基地提供，標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證號(hào)：NO.44411600004435，SCXK(粵)證號(hào)：2014-0035。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC法測(cè)定地塞米松的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.1.1 色譜條件 Ultimate?XB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(體積比40∶60)；檢測(cè)波長：240 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL(微透析樣品進(jìn)樣5 μL)。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取地塞米松約10.05 mg，置于100 mL量瓶中，適量甲醇超聲溶解后，用甲醇稀釋并定容，得質(zhì)量濃度0.100 5 mg/mL對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.3 供試品溶液的制備 分別精密稱取納米粒溫敏凝膠1.00 g，置于10 mL量瓶，適量甲醇溶解，超聲 5 min 后，放至室溫，甲醇定容，轉(zhuǎn)移至離心管，10 000 r/min離心5 min，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜濾過，即得供試品溶液；其他供試品相同操作。

2.1.4 專屬性考察 分別取地塞米松對(duì)照品、空白納米粒供試品、納米粒供試品、空白溫敏凝膠供試品、溫敏凝膠供試品、空白角膜滲透液、角膜滲透樣品、體內(nèi)空白透析液、體內(nèi)透析液樣品，按上述色譜條件進(jìn)樣，色譜圖見圖1，結(jié)果表明分析方法具有良好的專屬性。

abcdeabcabc02468t/minACB

A-a.地塞米松對(duì)照品； A-b.空白納米粒供試品； A-c.納米粒供試品； A-d.空白溫敏凝膠供試品； A-e.溫敏凝膠供試品； B-a.地塞米松對(duì)照品； B-b.空白角膜滲透液； B-c.角膜滲透樣品； C-a.地塞米松對(duì)照品； C-b.體內(nèi)空白透析液； C-c.體內(nèi)透析液樣品。

圖1不同樣品中地塞米松的HPLC色譜圖

Figure1HPLC chromatograms of Dexamethasone in different samples

2.1.5 線性關(guān)系的考察 取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，分別用甲醇定量稀釋成質(zhì)量濃度為1.005～100.5 μg/mL的系列溶液，供溫敏凝膠中藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定使用；用人工房水稀釋成質(zhì)量濃度為0.1005～10.05 μg/mL的系列溶液，供離體角膜滲透性檢測(cè)使用；用空白灌流液定量稀釋成質(zhì)量濃度為0.0502～10.05 μg/mL的系列溶液，供在體房水藥物濃度檢測(cè)使用；分別以藥物峰面積(A，mAU)對(duì)藥物質(zhì)量濃度(ρ，μg/mL)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：A=0.767 4ρ+ 0.066 8(R2=0.999 9)，A= 0.768 8ρ+ 0.066 2(R2=0.999 8)，A= 63.357ρ+ 2.9(R2=0.999 6)，表明線性關(guān)系良好。

在進(jìn)行產(chǎn)品測(cè)試時(shí)測(cè)試軟件主要完成測(cè)試環(huán)境確認(rèn)，測(cè)試資源的檢查和復(fù)位；產(chǎn)品供電及工作時(shí)序的控制；產(chǎn)品輸出信息的接收、存儲(chǔ)和實(shí)時(shí)顯示；產(chǎn)品測(cè)試項(xiàng)目的檢測(cè)和判讀。測(cè)試儀對(duì)產(chǎn)品參數(shù)進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)的過程中，能夠?qū)崟r(shí)顯示系統(tǒng)測(cè)試狀態(tài)、測(cè)試數(shù)據(jù)和測(cè)試曲線，并直觀顯示測(cè)試的最終結(jié)果。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 分別取“2.1.5”項(xiàng)下3種溶劑的10.05、5.025、1.005 μg/mL 對(duì)照品溶液，同日內(nèi)重復(fù)測(cè)定6次考察日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定3 d考察日間精密度。結(jié)果表明日內(nèi)與日間RSD值均小于2%，符合測(cè)定要求。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取離體角膜滲透與眼內(nèi)微透析樣品，分別在0、2、4、8、16、24 h按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定質(zhì)量分?jǐn)?shù)并計(jì)算RSD值，結(jié)果RSD值分別為2.23%和3.51%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 回收率試驗(yàn) 取“2.1.5”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，分別用甲醇、人工房水和空白灌流液定量稀釋成高、中、低(10.05、5.025、1.005 μg/mL)3種質(zhì)量濃度，HPLC進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示3種質(zhì)量濃度的回收率分別在100.18%～104.10%、95.77%～100.48%和93.67%～102.01%之間，符合樣品分析測(cè)定的要求。

2.2 地塞米松納米粒溫敏凝膠的制備

地塞米松納米粒(DEX-NPS)的制備：參照文獻(xiàn)[7]方法，取處方量的普郎尼克F68、丙三醇與處方量的去離子水，混合溶解，即得水相；另將處方量的大豆卵磷脂、地塞米松，溶于適量無水乙醇中，60 ℃減壓旋蒸揮去乙醇，再加入處方量的注射用大豆油，即得油相；保持水相和油相溫度在65 ℃，將油相加至水相中，6 000 r/min高速分散10 min即得初乳，調(diào)節(jié)高壓均質(zhì)二級(jí)閥壓力約20 000 kPa，一級(jí)閥調(diào)至60 000 kPa，高壓均質(zhì)10 min，即得地塞米松質(zhì)量濃度為1 mg/mL的DEX-NPS納米粒。

地塞米松納米粒溫敏凝膠的制備：采用冷凝法[8]，取DEX-NPS納米粒用去離子水適當(dāng)稀釋，加入處方量的凝膠材料，攪拌潤濕后充分溶脹，pH值調(diào)至6.5～7.8，4 ℃冷藏，得到均一、澄清透明的無團(tuán)塊溶液，即納米粒溫敏凝膠(地塞米松質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，在29～34 ℃之間具有溫度響應(yīng)性)。

2.3 地塞米松納米粒溫敏凝膠的評(píng)價(jià)

采用激光粒度儀、透射電鏡對(duì)納米粒溫敏凝膠粒徑、電位及形貌進(jìn)行分析，結(jié)果見圖2?？梢?，納米粒溫敏凝膠中位粒徑為(184.03±1.60)nm，PDI為0.178±0.03，Zeta電位為-(38.52±1.50)mV；地塞米松納米粒中位粒徑為(173.57±2.95)nm，PDI為0.187±0.06，Zeta電位為-(35.88±0.62)mV；兩者相比，差異并不顯著，但納米粒溫敏凝膠D90較大，體系均一性相對(duì)于納米粒較差一些。在透射電鏡下，兩者顆粒大小基本在200 nm內(nèi)，呈類球形，顆粒均一并且之間基本無黏連，與激光粒徑儀測(cè)得的粒徑大小相近。

圖2地塞米松納米粒(A)與納米粒溫敏凝膠(B)的粒徑、電位及TEM形貌圖

Figure2Particle size distributions,Zeta potential distribution and TEM micrographs of Dexamethasone nanoparticles (A) and temperature-sensitive gel (B)

2.4 離體角膜滲透性的評(píng)價(jià)

參考文獻(xiàn)[8]方法對(duì)離體角膜進(jìn)行預(yù)處理，將處理后的離體角膜置于接受池與供給池之間，以人工淚液(STF)作為接受介質(zhì)，供給池內(nèi)加入等量的不同制劑。將擴(kuò)散池置于(34±0.5)℃的恒溫?cái)U(kuò)散儀中，分別于不同時(shí)間點(diǎn)從接受池中取樣2 mL，同時(shí)補(bǔ)加等體積同溫度的接受介質(zhì)，樣品采用HPLC法進(jìn)樣測(cè)定，按公式(1)計(jì)算累積透過量(Qn)。

(1)

式中：V0為接受池中介質(zhì)的體積5 mL；Cn為t時(shí)間時(shí)的藥物濃度(μg/mL)；Ci為前一個(gè)t時(shí)間點(diǎn)的藥物濃度(μg/mL)；V為取樣體積2 mL。

藥物的累積滲透量與時(shí)間的曲線結(jié)果見圖3?？梢?，地塞米松納米粒溫敏凝膠和地塞米松納米粒的8 h累積滲透量分別是市售制劑(TobraDex?)的1.15和2.09倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明地塞米松納米粒具較強(qiáng)的滲透性，而溫敏凝膠延緩了納米粒的滲透。

bca50403020100Q/μg0123456789t/h

a.納米粒； b.納米粒溫敏凝膠； c.市售TobraDex。

圖3離體角膜累積透過量

Figure3The result of corneal cumulative permeabilityinvitro(n=6)

2.5 房水滲透性的評(píng)價(jià)

2.5.1 體外回收率測(cè)定 參考文獻(xiàn)[9]采用正透析法(式2，RR)和反透析法(式3，RL)測(cè)定體外回收率，浴槽溫度(34±1)℃，轉(zhuǎn)速200 r/min。正透析法中，微透析探針外液為地塞米松生理鹽水(DEX-NS)；反透析法中，微透析探針內(nèi)液為DEX-NS，分別考察含不同組分的透析溶液[牛血清白蛋白(BSA)、羥丙基β環(huán)糊精(HP-β-CD)、或異丙醇(IPA)]、灌流液速度(0.2、0.5、0.8、1、2、3 μL/min)和藥物濃度(1、5、10 μg/mL)等因素對(duì)探針回收率的影響。

(2)

(3)

式中：RR為正透析回收率，RL為反透析回收率，Cperfusion、Cdialysis、Csolution分別為灌流液、透析液和外置溶液中地塞米松的質(zhì)量濃度(μg/mL)。

2.5.1.1 透析液成分對(duì)回收率的影響 從圖4可見，3種成分透析回收率大小依次為NSBSA-NS>IPA-NS>HP-NS，其中，BSA-NS組和HP-NS組隨質(zhì)量濃度增加，RR和RL均降低；IPA-NS組隨著IPA濃度增加，RR和RL回收率略為增加，而NS組的RR和RL基本無差異。因此，選擇NS為透析液較為合適。

NS1%-HP-NS3%-HP-NS5%-HP-NS0.5%-BSA-NS1%-BSA-NS2%-BSA-NS20%-IPA-NS35%-IPA-NS50%-IPA-NS回收率/%706050403020100RRRL

圖4灌流液成分對(duì)探針回收率的影響

2.5.1.2 灌流液流速對(duì)回收率的影響 從圖5可見，回收率均隨流速的增加而逐漸降低；在各流速下，RR與RL的值近乎一致，符合進(jìn)行體內(nèi)回收率試驗(yàn)的條件。綜合取樣時(shí)間，為保證體內(nèi)回收率在50%以上，選擇流速應(yīng)不大于0.5 μL/min進(jìn)行灌注。

100806040200回收率/%RRRL0.00.51.01.52.02.53.0流速/(μL?min-1)

圖5灌流液流速對(duì)回收率的影響

2.5.1.3 藥物質(zhì)量濃度對(duì)回收率的影響 以流速為0.5 μL/min進(jìn)行灌注，考察不同藥物質(zhì)量濃度對(duì)回收率的影響，結(jié)果見圖6?？梢姡?RR與RL基本不隨濃度變化而變化，范圍在60%～68%之間。

100806040200回收率/%RRRL0246810ρ/(μg?mL-1)

圖6灌流液中藥物質(zhì)量濃度對(duì)回收率的影響

2.5.2 體內(nèi)回收率的測(cè)定 微透析探針植入后，約2 h待前房房水恢復(fù)，以零凈通量法，分別以0.25、0.5、1、2、5、10、20 μg/mL地塞米松溶液進(jìn)行灌注，流速設(shè)定為0.5 μL/min更換灌注液后至少平衡1 h后再取樣。每一樣品收集15 μL，HPLC法測(cè)定透析液中藥物濃度，按下式計(jì)算回收率，地塞米松體內(nèi)回收率Rin-vivo為(62.06±2.23)%。

(4)

式中：Cdialysis、Cperfusion、Cm分別為透析液、灌流液和組織中的藥物質(zhì)量濃度(μg/mL)。

2.5.3 房水滲透性試驗(yàn)

2.5.3.1 動(dòng)物處置 為預(yù)防創(chuàng)傷性手術(shù)后的炎癥反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)前2 d給予家兔滴眼(鹽酸左氧氟沙星滴眼液，每天3次，每次2滴)。試驗(yàn)時(shí)將兔子固定于兔籠內(nèi)，耳緣靜脈注射20%烏拉坦(5 mL/kg)溶液進(jìn)行麻醉，將線性微透析探針的滲析窗植入至眼前房室中。

2.5.3.2 房水中藥物質(zhì)量濃度的測(cè)定 將灌流液換成NS，并分別在兔眼滴加地塞米松納米粒溫敏凝膠、地塞米松納米粒和市售TobraDex各0.15 mL，其他步驟相同，根據(jù)公式(5)計(jì)算房水中地塞米松的濃度；式中，Caqueous為房水中藥物的質(zhì)量濃度(μg/mL)。

(5)

2.5.3.3 藥動(dòng)學(xué)參數(shù) 繪制房水內(nèi)藥物濃度-時(shí)間曲線，采用DAS3.0軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果見圖7及表1。可見，納米粒溫敏凝膠可有效提高地塞米松的角膜滲透性，有效提高房水中藥物濃度，納米粒溫敏凝膠的Cmax、AUC0→8、MRT、T1/2和Tmax與納米粒和市售制劑組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，納米粒溫敏凝膠和納米粒的Cmax分別是市售制劑的2.89和0.69倍，AUC0→8分別是3.01和0.98倍，表明納米粒溫敏凝膠可顯著提高地塞米松在眼部的生物利用度。

ρ/(μg?mL-1)6543210-10123456789t/h納米粒溫敏凝膠市售TobraDex納米粒

圖7房水中的藥物濃度-時(shí)間曲線

Figure7Drug concentration-time curves in aqueous humor (n=6)

表1 地塞米松在房水中的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Table 1 Pharmacokinetic parameters of dexamethasone in aqueous humor

與納米粒比較：*P< 0.05；與市售TobraDex制劑比較：#P< 0.05。

3 討論

角膜房水屏障由上皮細(xì)胞、前彈力層、基質(zhì)層和感覺神經(jīng)等結(jié)構(gòu)共同構(gòu)成，在保護(hù)眼內(nèi)免受外界化學(xué)物質(zhì)傷害的同時(shí)，也將藥物等隔離在眼球之外，成為限制藥物向眼內(nèi)遞送的第一道防線。本研究為證實(shí)納米粒載入溫敏型凝膠后藥物跨角膜屏障的能力，應(yīng)用線性微透析探針實(shí)時(shí)取樣技術(shù)，通過建立離體角膜及實(shí)時(shí)在體房水微透析技術(shù)對(duì)不同制劑滲透性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并采用DAS 3.0分析房水內(nèi)地塞米松藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明，納米?？捎行岣咚幬锏臐B透性，溫敏凝膠可以延長納米粒在角膜的滯留時(shí)間，溫敏凝膠與納米粒兩者結(jié)合既增加了角膜滲透性，又減緩因淚液沖刷導(dǎo)致的納米粒流失，為有效提高藥物眼部生物利用度跨角膜屏障提供可能。本研究采用在體微透析技術(shù)與HPLC檢測(cè)技術(shù)聯(lián)合，可降低不同動(dòng)物樣本間的個(gè)體差異，且與高靈敏度的分析檢測(cè)技術(shù)結(jié)合，達(dá)到了連續(xù)監(jiān)測(cè)動(dòng)態(tài)變化的目的。但實(shí)驗(yàn)中對(duì)地塞米松如何透過角膜到達(dá)房水，目前的研究還不能闡述清楚，有待進(jìn)一步研究。