胡雅麗，戴睿，劉永鑫，張婧贏，胡斌，儲(chǔ)成才，袁懷波，白洋

研究報(bào)告

水稻典型品種日本晴和IR24根系微生物組的解析

胡雅麗1,2,3，戴睿2,3,4,5，劉永鑫2,3,4，張婧贏2,3,4，胡斌2，儲(chǔ)成才2，袁懷波1，白洋2,3,4,5

1. 合肥工業(yè)大學(xué)，食品與生物工程學(xué)院，合肥 230009 2. 中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，植物基因組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101 3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，生物互作卓越創(chuàng)新中心，北京 100049 4. 中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，中國(guó)科學(xué)院–英國(guó)約翰英納斯中心植物和微生物科學(xué)聯(lián)合研究中心，北京 100101 5. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)學(xué)院，北京 100049

植物的各項(xiàng)生命活動(dòng)與其根系微生物組密不可分，且根系微生物組的組成易受到植物生長(zhǎng)環(huán)境和基因型的影響。為進(jìn)一步探究中國(guó)北方地區(qū)種植的不同品種水稻根系微生物組的差異及其相互作用機(jī)制，本研究以種植于北京昌平和上莊農(nóng)場(chǎng)的水稻典型品種日本晴(Nipponbare)和IR24為研究對(duì)象，基于16S rRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)獲得根系微生物組序列，利用多樣性分析、組成型分析、機(jī)器學(xué)習(xí)的隨機(jī)森林和網(wǎng)絡(luò)分析等方法，對(duì)旺盛生長(zhǎng)期的兩種不同品種的水稻根系微生物組進(jìn)行詳細(xì)比較。研究發(fā)現(xiàn)，種植地點(diǎn)和水稻基因型顯著影響了水稻根系微生物組的群落結(jié)構(gòu)，不同基因型導(dǎo)致了根系微生物組在物種分類組成上以及細(xì)菌間相互關(guān)系的差異，而且根系微生物組能作為生物標(biāo)記跨地點(diǎn)區(qū)分宿主的基因型。本研究結(jié)果為深入理解我國(guó)北方種植的水稻根系微生物組的組成規(guī)律以及從根系微生物與植物互作的角度對(duì)品種進(jìn)行改良提供了數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

水稻根系生物組；多樣性分析；組成型分析；機(jī)器學(xué)習(xí)；網(wǎng)絡(luò)分析

在自然界中，陸生植物的根部聚集著特定種類的微生物，被稱為根系微生物組[1~4]。根系微生物組與植物之間的相互作用對(duì)植物的各項(xiàng)生命活動(dòng)具有重要影響，如促進(jìn)植物生長(zhǎng)[5~7]、防止微生物病原體的侵害[8~10]等。根系微生物還能夠轉(zhuǎn)化、分解植物難以吸收利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)而提高植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用效率[11]。例如，擬南芥()根際微生物群落介導(dǎo)了磷脅迫反應(yīng)，參與了自身的免疫調(diào)控[12]；富集在玉米()氣生根中的細(xì)菌參與了玉米的固氮過(guò)程[13,14]。同時(shí)植物根系分泌物能為根際細(xì)菌提供生命活動(dòng)所需的代謝產(chǎn)物進(jìn)而招募有益菌，而這些代謝產(chǎn)物也能夠抑制某些菌在植物根系的富集[15,16]。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和微生物組研究的深入，擬南芥[17~20]、水稻()[21~23]、小麥()[24~26]、玉米[27]、番茄()[28,29]、谷子()[30]等多種植物根系微生物組的結(jié)構(gòu)得到了解析。研究表明，在單子葉和雙子葉植物中，根系微生物組主要包括放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)[3,31]。影響根系微生物組結(jié)構(gòu)的因素很多，其中包括種植環(huán)境的土壤條件(如pH值、土壤水分、碳、氮和鋅等重要元素的含量)以及植物自身的調(diào)節(jié)[32~34]。不同物種的植物根系微生物組結(jié)構(gòu)存在差異[15]，此外不同基因型的植物對(duì)環(huán)境響應(yīng)不同，其根系微生物組的結(jié)構(gòu)也可能不同[11]。

水稻是世界上重要的糧食作物，約有1/3的世界人口以水稻為主食[35,36]。亞洲栽培稻主要包含兩個(gè)亞種：粳稻()和秈稻()，這兩個(gè)品種是目前國(guó)內(nèi)最廣泛種植的兩個(gè)水稻亞種[37]。二者在形態(tài)特征、抗蟲抗病性和營(yíng)養(yǎng)利用效率上有著顯著區(qū)別。日本晴(Nipponbare)和IR24分別為典型的粳稻和秈稻品種，二者的根系微生物組隨著生長(zhǎng)時(shí)期動(dòng)態(tài)變化，并在旺盛生長(zhǎng)期逐漸穩(wěn)定[22]。然而，對(duì)該時(shí)期種植于不同地區(qū)下的這兩種水稻的根系微生物組的結(jié)構(gòu)仍然缺乏系統(tǒng)解析。本研究以種植于北京昌平和上莊的日本晴和IR24的根系微生物組為材料，利用機(jī)器學(xué)習(xí)和網(wǎng)絡(luò)分析等方法，對(duì)兩種基因型的水稻根系微生物組進(jìn)行詳細(xì)比較。

1 材料與方法

1.1 植物材料

選取典型粳稻代表品種日本晴以及秈稻代表品種IR24作為實(shí)驗(yàn)材料，實(shí)驗(yàn)所用材料均由中國(guó)科 學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所儲(chǔ)成才研究員實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 水稻種植

水稻材料種植于北京上莊農(nóng)場(chǎng)(116.206E, 40.122N) (SZ)和北京昌平農(nóng)場(chǎng)(116.424E, 40.109N) (CP)，種植時(shí)間為2017年6月下旬，并于8月下旬取樣。昌平農(nóng)場(chǎng)的土質(zhì)為泥質(zhì)壤土，而上莊農(nóng)場(chǎng)的土質(zhì)為粘壤土。此外兩個(gè)農(nóng)場(chǎng)的土壤肥力不同，水稻長(zhǎng)勢(shì)存在差異。這兩個(gè)農(nóng)場(chǎng)的田地近幾年只用于種植水稻，有助于在我國(guó)北方典型的水稻農(nóng)業(yè)土壤中研究不同基因型間水稻根系微生物的異同。為了避免種子內(nèi)生菌和表面相關(guān)微生物的影響，將水稻種子脫殼，在75%乙醇中表面消毒30 s，用2.5%次氯酸鈉消毒3次，每次持續(xù)15 min，最后用無(wú)菌去離子水清洗5遍，然后在MS瓊脂培養(yǎng)基中促進(jìn)萌發(fā)，得無(wú)菌組培苗。約15 d后移栽至農(nóng)場(chǎng)的水稻田中，在昌平農(nóng)場(chǎng)中每個(gè)基因型各設(shè)置15個(gè)重復(fù)，在上莊農(nóng)場(chǎng)，IR24有17個(gè)重復(fù)，日本晴有15個(gè)重復(fù)，共計(jì)62個(gè)樣品。田里的灌溉水面處于剛浸沒(méi)土壤狀態(tài)，同時(shí)設(shè)置保護(hù)行。

1.3 樣品收集

在移栽8周后，即水稻旺盛生長(zhǎng)期，收集0~ 10 cm深度的水稻根。先用無(wú)菌水洗掉粘在水稻根上的松散的土壤顆粒，接著放入裝有25 mL PBS緩沖液的50 mL管中，180 r/min搖晃清洗3次，然后用無(wú)菌濾紙吸干根，最后將根和相應(yīng)的土壤放入?80℃中保存。

1.4 DNA提取、16S擴(kuò)增子文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序

將冷凍的土壤樣品用Precellys Evolution生物樣品研磨器(Bertin Technologies，法國(guó))在7200 r/min下勻質(zhì)4次，每次持續(xù)30 s，然后根據(jù)制造商的說(shuō)明使用FastDNA SPIN試劑盒(MP Biomedicals，美國(guó))提取DNA。將冷凍的根化凍后在7200 r/min下勻質(zhì)2次，每次30 s，之后放入液氮中冷凍5 s，在7200 r/min下勻質(zhì)2次，每次30 s，再加入1100 μL緩沖液，在7200 r/min下勻質(zhì)4次，每次30 s。使用FastDNA SPIN試劑盒(MP Biomedicals，美國(guó))提取DNA。DNA濃度用PicoGreen dsDNA檢測(cè)試劑盒(Life Technologies，美國(guó))測(cè)定，最后將DNA濃度稀釋到3.5 ng/μL。

用簡(jiǎn)并PCR引物799F和1193R對(duì)16S rRNA基因的可變區(qū)V5~V7進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(poly-merase chain reaction, PCR)擴(kuò)增(表1)。每個(gè)樣品在30 μL體系中一式3份(與體系作為對(duì)照)擴(kuò)增，該反應(yīng)體系包括3 μL模板，0.3 μL PrimeSTAR HS DNA聚合酶，1×PrimeSTAR緩沖液(TaKaRa，日本)，2.4 μL dNTPs和正反向引物各0.75 μL。在98℃進(jìn)行30 s初始變性后，將目標(biāo)區(qū)域在98℃進(jìn)行10 s，55℃進(jìn)行15 s，72℃進(jìn)行1 min的25個(gè)循環(huán)下擴(kuò)增，最終72℃下進(jìn)行5 min。用瓊脂凝膠電泳驗(yàn)證PCR結(jié)果，若陰性未出帶，則將3份樣品合并，并用AMPure XP試劑盒(Beckman Coulter，美國(guó))進(jìn)行純化，純化后用Nanodrop (NanoDrop 2000C, Thermo Scientific)檢測(cè)DNA濃度，并將DNA濃度稀釋至10 ng/μL作為模板，用于使用Illumina兼容引物進(jìn)行第二步PCR。在與第一輪PCR相同的條件下，將DNA樣品一式3等份擴(kuò)增8個(gè)循環(huán)。若陰性對(duì)照沒(méi)有出帶，則合并該樣品的這3個(gè)技術(shù)重復(fù)。在1.2%瓊脂糖凝膠上分離，并使用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，美國(guó))根據(jù)制造商的說(shuō)明提取細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增子。用PicoGreen dsDNA檢測(cè)試劑盒(Life tech-nologies，美國(guó))測(cè)定DNA濃度，每個(gè)樣品取200 ng。使用Agencourt AMPure XP試劑盒(Beckman Coulter GmbH，美國(guó))將最終的擴(kuò)增子文庫(kù)清洗2次，并在HiSeq 2500平臺(tái)(Illumina Inc.，美國(guó))上進(jìn)行測(cè)序[38]。

表1 用于擴(kuò)增16S rRNA基因的引物序列

1.5 生物信息學(xué)分析

16S rRNA基因擴(kuò)增子數(shù)據(jù)分析主要使用QIIME 1.9.1[39]、QIIME 2[40]、USEARCH 10.0[41]以及本研究團(tuán)隊(duì)編寫的R腳本(https://github.com/raydai0218/ Hu2020Hereditas)[11,22,42,43]。主要步驟包括使用QIIME 1.9.1腳本extract_barcodes.py和split_libraries_ fastq.py對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行拆分，USEARCH對(duì)序列進(jìn)行處理，用-fasteq_mergepairs命令合并雙端序列，然后切除引物(-fastx_truncate)，過(guò)濾低質(zhì)量序列(-fastq_filter)并去冗余(-fastx_uniques)。之后用-cluster_otus命令基于UPARSE算法按97%相似度聚類為可操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)。最后基于SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)去除嵌合體和宿主后獲得特征序列，再使用USEARCH的-otutab命令(-id 0.97)比對(duì)生成OTU表。此外用USEARCH的-sintax命令進(jìn)行物種注釋(-sintax_cutoff 0.6)?；贠TU表的下游分析和可視化主要在R 3.6.1語(yǔ)言(https://cran. r-project.org/)環(huán)境下實(shí)現(xiàn)，包括Alpha-和Beta-多樣性分析采用QIIME 2和R包vegan 2.5-6實(shí)現(xiàn)[44]、差異比較主要基于秩和檢驗(yàn)(Wilcoxon rank sum test)、可視化采用R包ggplot2 3.2.1[45]和在線繪圖網(wǎng)站imageGP (http://www.ehbio.com/ImageGP)實(shí)現(xiàn)。同時(shí)，在探索水稻根系細(xì)菌微生物組作為潛在生物標(biāo)注的研究中，采用R包randomForest 4.6-14中的隨機(jī)森林分類算法實(shí)現(xiàn)[46,47]。網(wǎng)絡(luò)分析采用R包igraph 1.2.4.2實(shí)現(xiàn)[48]，網(wǎng)絡(luò)的比較方法和可視化方案參考之前的研究[32,49,50]。

1.6 數(shù)據(jù)和可重復(fù)分析代碼

本研究涉及的原始序列數(shù)據(jù)已保存在中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所BIG數(shù)據(jù)中心[51]的基因組序列檔案庫(kù)(Genome Sequence Archive)[52]中，編號(hào)CRA001372，可在https://bigd.big.ac.cn/gsa上公開訪問(wèn)。本研究的計(jì)算分析過(guò)程使用Rmarkdown可重復(fù)分析標(biāo)準(zhǔn)，分析中使用的數(shù)據(jù)表、代碼和結(jié)果圖表詳見(jiàn)https://github.com/raydai0218/Hu2020Hereditas。

2 結(jié)果與分析

2.1 種植地點(diǎn)和品種差異影響水稻根系微生物組成

高通量測(cè)序最終從62個(gè)樣品中共生成了3,376,530條高質(zhì)量序列(平均54,460條，每個(gè)樣品中讀段數(shù)從32,390條到76,887條不等，54,460 ± 11,193.17)。用USEARCH對(duì)高質(zhì)量序列進(jìn)行質(zhì)控分析，去冗余、去除嵌合體及宿主序列后，得到19,073個(gè)OTU。

多樣性分析顯示水稻根系微生物組受種植地點(diǎn)和基因型的影響。本研究對(duì)樣品間Bray-Curtis距離做非限制性主坐標(biāo)分析(principal coordinate analysis, PCoA) (圖1A)，結(jié)果顯示在第一主坐標(biāo)軸(PCo1)上水稻的根系微生物組按照地區(qū)被分為了兩簇，表明種植地區(qū)差異導(dǎo)致了水稻根系微生物的組成不同，這是本研究中最主要的微生物差異來(lái)源?；蛐褪菍?dǎo)致第二主坐標(biāo)軸(PCo2)上樣品差異的主要因素，來(lái)自兩個(gè)種植地區(qū)的同一基因型在第二軸上的位置是一致的，說(shuō)明水稻根系微生物組受到基因型的影響。通過(guò)比較樣品中的物種豐富度，本研究發(fā)現(xiàn)種植地區(qū)和水稻基因型沒(méi)有顯著影響根系微生物的物種豐富度。種植于上莊的水稻根系物種豐富度較昌平的稍高，同一地區(qū)的兩個(gè)基因型間豐富度指數(shù)(richness index)無(wú)明顯差別，最小顯著差異法(least significant difference, LSD)比較各組間差異的結(jié)果顯示種植地區(qū)和基因型間的差異均不顯著(> 0.05) (圖1B)。

2.2 日本晴和IR24的根系微生物組在不同分類水平上存在差異

本研究對(duì)日本晴和IR24的根系微生物組在不同分類水平進(jìn)行差異比較(圖2)。在門和綱水平上，兩個(gè)種植地區(qū)中擬桿菌門(Bacteroidetes)和gamma-變形菌綱(Gammaproteobacteria)在日本晴根系的相對(duì)豐度都顯著高于IR24，而beta-變形菌綱(Beta-proteobacteria)則在IR24根系中相對(duì)豐度更高(Wil-coxon秩和檢驗(yàn)，< 0.05，< 0.2)。在上莊，放線菌門(Actinobacteria)在IR24根系的相對(duì)豐度比日本晴更高，但在昌平差異不顯著；而delta-變形菌綱(Deltaproteobacteria)則在昌平的日本晴中較IR24相對(duì)豐度更高，在上莊無(wú)顯著區(qū)別，這可能與種植環(huán)境對(duì)土壤微生物在水稻根系定植的影響有關(guān)(圖2)。

圖1 種植地點(diǎn)和品種差異影響水稻根系微生物組成

A：基于樣品間Bray Curtis距離的主坐標(biāo)分析(PCoA)。日本晴和IR24的根系微生物組在PCoA的第一軸上(PCo 1)按種植地點(diǎn)開，第二軸上(PCo 2)按基因型分開，組間差異顯著(PERMANOVA,< 0.001)。CP：昌平；SZ：上莊；坐標(biāo)軸標(biāo)題括號(hào)中顯示整體差異的解釋率百分比。B：日本晴和IR24根系微生物組的豐富度指數(shù)(richness index，樣品內(nèi)物種多樣性)。箱線圖中框內(nèi)橫線表示中位數(shù)，上下邊緣分別代表上下四分位數(shù)，邊緣上的延長(zhǎng)線在無(wú)異常值時(shí)至極值，但最長(zhǎng)不超過(guò)1.5倍上下四分位數(shù)的分布區(qū)間。各組間豐富度指數(shù)差異不明顯，最小顯著差異法(least significant difference, LSD)比較組間差異，4組均為a表示地點(diǎn)和基因型對(duì)根系微生物組的Alpha多樣性影響不顯著(> 0.05)。

圖2 日本晴和IR24的根系微生物組在門/綱級(jí)分布上存在差異

柱狀圖展示每個(gè)樣品中根系微生物組的物種組成(門和綱水平的相對(duì)豐度)。變形菌門(Proteobacteria)因豐度較高在綱水平展開為alpha-、beta-、gamma-和delta-變形菌4個(gè)綱，其余為門水平。Acidobacteria：酸桿菌門；Actinobacteria：放線菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Firmicutes：厚壁菌門；Spirochaetes：螺旋體門。在兩個(gè)種植地區(qū)，IR24根系微生物中的beta-變形菌綱顯著高于日本晴，而擬桿菌門和gamma-變形菌綱在日本晴的根系微生物組中豐度更高，此外放線菌門(上莊)和delta-變形菌綱(昌平)只在一個(gè)地區(qū)在兩基因型間有顯著差異(Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，< 0.05，F(xiàn)DR < 0.2)。CP：昌平；SZ：上莊。每組樣品的數(shù)量為：IR2_CP (= 15)，日本晴_CP (= 15)，IR24_SZ (= 17)，日本晴_SZ (= 15)。

在OTU水平，日本晴和IR24中富集的OTU在昌平和上莊存在重疊：有66個(gè)OTU在兩個(gè)地區(qū)的日本晴中共同富集，占昌平中富集的39.8%、上莊中富集的31.8% (圖3A)。這66個(gè)OTU主要屬于擬桿菌門(Bacteroidetes，9個(gè))，厚壁菌門(Firmicutes，16個(gè))和gamma-變形菌綱(Gammaproteobacteria，15個(gè)) (圖3B)。有45個(gè)OTU在兩個(gè)地區(qū)的IR24中共同富集，占昌平中富集的26.2%、上莊中富集的33.3% (圖3C)。這45個(gè)OTU主要屬于beta-變形菌綱(Betaproteobacteria，17個(gè))，厚壁菌門(Firmicutes，8個(gè))和delta-變形菌綱(Deltaproteobacteria，5個(gè)) (圖3D)。總體來(lái)說(shuō)，OTU水平在兩基因型間差異富集的菌在門水平主要屬于放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門以及變形菌門。

2.3 基于物種組成的隨機(jī)森林分類模型精準(zhǔn)預(yù)測(cè)水稻基因型

為了探究能否利用根系微生物作為生物標(biāo)記菌來(lái)預(yù)測(cè)宿主基因型，本研究用機(jī)器學(xué)習(xí)的隨機(jī)森林方法對(duì)上莊和昌平各一半的日本晴和IR24根系微生物組(共34個(gè)樣品)在科水平上建立判別模型，并用十倍交叉驗(yàn)證重復(fù)4次以評(píng)估根系菌對(duì)于判定水稻基因型的準(zhǔn)確性。從交叉驗(yàn)證誤差曲線可以看出，當(dāng)使用14個(gè)菌時(shí)，曲線的錯(cuò)誤率趨于穩(wěn)定，故選擇對(duì)模型重要性最高的前14個(gè)菌作為生物標(biāo)記菌(圖4A)。其中重要性較高的生物標(biāo)記菌主要是桿菌綱(Bacilli)以及beta-、gamma-變形菌綱。這14個(gè)標(biāo)記菌有13個(gè)菌的平均相對(duì)豐度都在3/‰以上，只有假衣原體科(Parachlamydiaceae)的相對(duì)豐度較低(圖4B)。為了驗(yàn)證該模型的準(zhǔn)確性，本研究用未參與模型訓(xùn)練的28個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)試(圖4C)，測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確率較高(96.4%)，僅有一個(gè)樣品出錯(cuò)。說(shuō)明兩個(gè)種植地區(qū)的日本晴和IR24的根系微生物組存在一致差異，隨機(jī)森林模型能夠依據(jù)該差異對(duì)水稻基因型作出較準(zhǔn)確預(yù)測(cè)。

圖3 日本晴和IR24根系的差異OTU及對(duì)應(yīng)門綱水平分類組成

A：在兩個(gè)種植地點(diǎn)中日本晴根系富集的OTUs。與IR24相比，日本晴在昌平(CP)和上莊(SZ)分別有166個(gè)和207個(gè)OTU富集，且其中有66個(gè)OTU在這兩個(gè)種植地區(qū)都富集(Wilcoxon秩和檢驗(yàn)用于比較差異OTUs，當(dāng)< 0.05、< 0.2且差異倍數(shù) > 1.2時(shí)，認(rèn)為該OTU在兩組樣品間存在差異)。B：日本晴在兩個(gè)種植地區(qū)均富集的根系OTUs的分類組成。共同富集的66個(gè)OTU大部分屬于擬桿菌門，厚壁菌門和gamma-變形菌綱。C：在兩個(gè)種植地點(diǎn)中IR24根系富集的OTUs。與日本晴相比，IR24在昌平和上莊分別有172個(gè)和135個(gè)富集OTUs，且其中有45個(gè)OTUs在這兩個(gè)種植地區(qū)都富集。D：IR24在兩個(gè)種植地區(qū)均富集的根系OTU的分類組成。共同富集的45個(gè)OTU大部分屬于beta-變形菌綱，厚壁菌門和delta-變形菌綱。從圖中可知，水稻基因型影響了微生物在根系的富集。Actinobacteria：放線菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Firmicutes：厚壁菌門；Spirochaetes：螺旋體門；其余為alpha-、beta-、delta-、gamma-變形菌綱。

圖4 基于根系微生物組的隨機(jī)森林分類模型能較精準(zhǔn)預(yù)測(cè)日本晴

A：隨機(jī)森林分類模型中重要性排前14的生物標(biāo)記菌。采用隨機(jī)森林分類法，對(duì)昌平和上莊地區(qū)的IR24和日本晴根系微生物組(共34個(gè)樣品)在科水平進(jìn)行了分類，并在綱水平著色。生物標(biāo)記菌按照對(duì)模型準(zhǔn)確度的重要性由高到低排序，展示前14個(gè)。圖右側(cè)小圖表示十倍交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率，當(dāng)標(biāo)記菌個(gè)數(shù)超過(guò)14個(gè)時(shí)，模型的錯(cuò)誤率較低且穩(wěn)定。B：標(biāo)記菌在日本晴和IR24根系微生物組中的相對(duì)豐度。藍(lán)色為日本晴，橙色為IR24。C：用隨機(jī)森林分類模型對(duì)兩個(gè)基因型做分類預(yù)測(cè)。該模型基于樣品的根系微生物組成判斷樣品的基因型。前兩行樣品為日本晴，后兩行樣品為IR24，藍(lán)色表示樣品基因型被預(yù)測(cè)為日本晴，橙色則是預(yù)測(cè)為IR24。CP：昌平；SZ：上莊。Actinobacteria：放線菌綱；Bacilli：桿菌綱；Betaproteobacteria：beta-變形菌綱；Chlamydiia：衣原體綱；Chloroflexia：綠彎菌綱；Clostridia：梭菌綱；Gammaproteobacteria：gamma-變形菌綱；Opitutae：豐佑菌綱。

2.4 日本晴和IR24的根系微生物網(wǎng)絡(luò)存在明顯差異

為了比較兩個(gè)基因型中菌的相互關(guān)系，對(duì)日本晴和IR24的根系菌在科水平構(gòu)建了相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中細(xì)菌間相關(guān)性及共有菌的連接度揭示了基因型對(duì)根系微生物共存網(wǎng)絡(luò)的影響。兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)不同，日本晴的網(wǎng)絡(luò)(圖5A)復(fù)雜度比IR24 (圖5B)的更低，科水平兩基因型間的差異菌在兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)中也各不相同。例如，兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)中共有的科水平差異菌有地桿菌科(Geobacteraceae)，其中地桿菌科在日本晴網(wǎng)絡(luò)中與硝化螺旋菌科(、螺旋體科(正相關(guān)，而在IR24的網(wǎng)絡(luò)中只與正相關(guān)關(guān)系。為了量化兩個(gè)基因型間網(wǎng)絡(luò)的差異，本研究比較兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)中共有菌及其網(wǎng)絡(luò)關(guān)系(連接度) (圖5C)，可見(jiàn)兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)中共有的菌有34個(gè)(占日本晴網(wǎng)絡(luò)中菌的65.4%，占IR24的44.7%)，其中有部分菌在兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)中有明顯差別。梭菌科(和在日本晴網(wǎng)絡(luò)中的連接度都在6以上，而在IR24中連接度較低，分別為3和1；相反，唇形科(和動(dòng)球菌科(在IR24網(wǎng)絡(luò)中連接度都為6，但在日本晴中只與一個(gè)菌有相互關(guān)系(圖5C)。

3 討論

植物根系微生物組與植物的關(guān)系密不可分，它參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)、免疫、繁殖等重要生命活動(dòng)[3,53~56]。多項(xiàng)研究表明，定植在植物根系的微生物受多種因素影響，包括土壤微生物組[53]、土壤的pH值和元素含量等理化性質(zhì)[32,33,57,58]、植物的物種及次級(jí)代謝產(chǎn)物等[31,59~61]。植物的基因型也是影響其根系微生物組的重要因素，在擬南芥[17,18]、玉米[27,62]、水稻[21~23]等重要植物中，都有相關(guān)研究闡明基因型對(duì)根系微生物帶來(lái)的影響。日本晴和IR24分別屬于粳稻和秈稻，在形態(tài)、籽粒以及抗病性等方面都有不同[63]。本研究以這兩個(gè)水稻典型品種為研究對(duì)象，在兩個(gè)不同種植地區(qū)對(duì)它們的根系微生物從多個(gè)角度進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)日本晴和IR24的根系微生物組有明顯差異：多樣性分析證明種植地區(qū)和水稻基因型影響了根系群落間的差異(圖1A)；兩基因型在不同分類水平上都存在差異富集的細(xì)菌類群(圖2，圖3)；隨機(jī)森林分類模型能夠按照根系生物標(biāo)記菌對(duì)宿主進(jìn)行分類，并在種植地區(qū)不同的前提下準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)日本晴(圖4)；日本晴和IR24的共存網(wǎng)絡(luò)也有明顯差別(圖5)。

主坐標(biāo)分析的結(jié)果表明種植地區(qū)影響了水稻根系菌群的結(jié)構(gòu)(圖1A)，這與先前的研究結(jié)果一致[11,21]。土壤中真菌和細(xì)菌的相互作用參與塑造了宿主相關(guān)的根系菌群[5,64]，土壤中的有益菌會(huì)在植物根中定植，因而土壤中微生物的結(jié)構(gòu)同樣會(huì)影響水稻根系微生物組的結(jié)構(gòu)。本研究發(fā)現(xiàn)在兩個(gè)種植地區(qū)中水稻基因型均分開，且相對(duì)位置一致。在一項(xiàng)對(duì)多品種的秈稻和粳稻根系微生物組的分析中，同樣發(fā)現(xiàn)兩塊田間中不同品種的水稻分開趨勢(shì)一致[21]。這說(shuō)明水稻基因型對(duì)根系微生物組的影響在不同地區(qū)間存在一定共性和差異。變形菌門為在水稻根系主要富集的菌[1,2]，其中beta-變形菌綱(Betaproteo-bacteria)在IR24根系的相對(duì)豐度顯著高于日本晴，而gamma-變形菌綱(Gammaproteobacteria)在日本晴中豐度更高；此外擬桿菌門(Bacteroidetes)在兩個(gè)品種間也存在差異(圖2)，且這些差異在兩個(gè)地區(qū)均顯著。而放線菌門(Actinobacteria)和delta-變形菌綱(Deltaproteobacteria)則分別只在上莊或昌平的兩基因型間存在顯著差異。

水稻的根系微生物受基因型影響，并在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中有動(dòng)態(tài)的變化[22,23]。因此，水稻根系菌能夠像水稻表型特征一樣可以被用來(lái)判斷水稻的生長(zhǎng)時(shí)期和基因型。本研究采用隨機(jī)森林分類法建立了水稻日本晴和IR24的判別模型，盡管種植地區(qū)會(huì)影響水稻根系微生物組的結(jié)構(gòu)(圖1，圖2)，但該模型依舊能精準(zhǔn)地根據(jù)水稻根系微生物預(yù)測(cè)出水稻基因型(圖4)。增加樣本數(shù)量并設(shè)置更多種植地區(qū)將有助于建立更為穩(wěn)定、適用性更加廣泛的分類預(yù)測(cè)模型，該模型能夠降低種植地區(qū)帶來(lái)的干擾，基于植物根系微生物組的組成特點(diǎn)判斷植物的基因型，并有利于后續(xù)通過(guò)對(duì)標(biāo)記菌的深入研究探索不同基因型的植物與根系微生物的相互作用關(guān)系。微生物共存網(wǎng)絡(luò)(co-occurrence network)能夠直觀地展現(xiàn)各個(gè)微生物間的相互關(guān)系，從而找到按樣品豐度所做的差異比較中被忽略的菌間作用[65]。通過(guò)比較日本晴和IR24的共存網(wǎng)絡(luò)(圖5)，本研究發(fā)現(xiàn)二者網(wǎng)絡(luò)中存在相互關(guān)系的菌有差異，且IR24的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)復(fù)雜性更高。這些相互作用可能與水稻的生長(zhǎng)發(fā)育等生命活動(dòng)相關(guān)。因此，可以挖掘網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵差異菌的潛在功能，進(jìn)而探究基因型導(dǎo)致的根系微生物組差異會(huì)如何作用于植物進(jìn)而產(chǎn)生調(diào)控作用。本研究結(jié)果從多角度反映了我國(guó)北方農(nóng)田中日本晴和IR24的根系微生物組的差異，為從根系微生物與植物互作的角度對(duì)品種進(jìn)行改良提供理論基礎(chǔ)。

圖5 日本晴和IR24的根系菌群形成的共存網(wǎng)絡(luò)有明顯區(qū)別

A：日本晴的微生物群落在科水平形成的共存網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中共有52個(gè)節(jié)點(diǎn)，59條邊。B：IR24的微生物群落在科水平形成的共存網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中共有76個(gè)節(jié)點(diǎn)，93條邊。共存網(wǎng)絡(luò)關(guān)系利用Pearson相關(guān)系數(shù)判斷科水平菌間相關(guān)性(< 0.05，|| > 0.7)，網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)科，節(jié)點(diǎn)大小表示該科在每組樣品中的平均相對(duì)豐度。其中綠色節(jié)點(diǎn)為科水平在兩個(gè)基因型間存在差異的根系菌(Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，< 0.05、FDR < 0.2且差異倍數(shù) > 1.2)。連接節(jié)點(diǎn)的邊表示該兩個(gè)節(jié)點(diǎn)間的相關(guān)性，紅色為正相關(guān)，藍(lán)色為負(fù)相關(guān)，線條粗細(xì)與相關(guān)性高低成正比。C：兩個(gè)基因型網(wǎng)絡(luò)間共有菌的連接緊密度比較。兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)中共有34個(gè)菌，統(tǒng)計(jì)其中每個(gè)菌作為節(jié)點(diǎn)與網(wǎng)絡(luò)中其他菌的關(guān)聯(lián)度(即連接該節(jié)點(diǎn)的邊的個(gè)數(shù))。CP：昌平；SZ：上莊。

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Analysis of rice root bacterial microbiota of Nipponbare and IR24

Yali Hu1,2,3, Rui Dai2,3,4,5, Yongxin Liu2,3,4, Jingying Zhang2,3,4, Bin Hu2, Chengcai Chu2, Huaibo Yuan1, Yang Bai2,3,4,5

The root-associated bacterial microbiota is closely related to life activities of land plants, and its composition is affected by geographic locations and plant genotypes. However, the influence of plant genotypes on root microbiota in rice grown in northern China remains to be explained. In this study, we performed 16S rRNA gene amplicon sequencing to generate bacterial community profiles of two representative rice cultivars, Nipponbare and IR24. They are planted in Changping and Shangzhuang farms in Beijing and have reached the reproductive stage. We compared their root microbiota in details by Random Forest machine learning algorithm and network analysis. We found that the diversity of rice root microbiota was significantly affected by geographic locations and rice genotypes. Nipponbare and IR24 showed distinct taxonomic composition of the root microbiota and the interactions between different bacteria. Moreover, the root bacteria could be used as biomarkers to distinguish Nipponbare from IR24 across regions. Our study provides a theoretical basis for the in-depth understanding of rice root microbiota in Northern China and the improvement of rice breeding from the perspective of the interaction between root microorganisms and plants.

rice root microbiota; diversity analysis; taxonomic composition; machine learning; network analysis

2020-03-15;

2020-04-16

中國(guó)科學(xué)院前沿科學(xué)重點(diǎn)研究項(xiàng)目(編號(hào)：QYZDB-SSW-SMC021)和國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(編號(hào)：31772400)資助[Supported by the Key Research Program of Frontier Sciences of the Chinese Academy of Science (No. QYZDB-SSW-SMC021), and the National Natural Science Foundation of China (No. 31772400)]

胡雅麗，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：根系微生物組。E-mail: 2017111262@mail.hfut.edu.cn戴睿，在讀博士研究生，專業(yè)方向：根系微生物組，生物信息學(xué)。E-mail: raydai@genetics.ac.cn 胡雅麗和戴睿為并列第一作者。

白洋，博士，研究員，研究方向：根系微生物組。E-mail: ybai@genetics.ac.cn袁懷波，博士，副教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品資源綜合開發(fā)利用研究。E-mail: yuanhuaibo001@163.com

10.16288/j.yczz.20-070

2020/4/28 15:50:23

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20200427.1715.001.html

(責(zé)任編委: 趙方慶)