陳海強(qiáng)，劉會(huì)云，王軻，張雙喜，葉興國(guó)

綜 述

植物單倍體誘導(dǎo)技術(shù)發(fā)展與創(chuàng)新

陳海強(qiáng)1，劉會(huì)云1，王軻1，張雙喜2，葉興國(guó)1

1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，農(nóng)作物基因資源與基因改良國(guó)家重大科學(xué)工程，北京 100081 2. 寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)作物研究所，銀川 750105

單倍體育種是培育作物新品種的主要育種技術(shù)之一，提高單倍體誘導(dǎo)頻率和簡(jiǎn)化誘導(dǎo)程序是單倍體育種技術(shù)的關(guān)鍵。隨著單倍體誘導(dǎo)技術(shù)的發(fā)展與改進(jìn)，單倍體育種技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于許多重要植物的育種研究中，展現(xiàn)出基因純合快速、育種年限縮短、育種效率提高等優(yōu)勢(shì)。單倍體誘導(dǎo)技術(shù)與雜交育種、誘變育種、反向育種和分子標(biāo)記輔助選擇育種等技術(shù)相結(jié)合，在作物品種改良上的作用更加顯著。單倍體和雙單倍體在遺傳群體構(gòu)建、基因功能鑒定、轉(zhuǎn)基因研究、細(xì)胞學(xué)研究等方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。本文從單倍體誘導(dǎo)技術(shù)、單倍體和雙單倍體應(yīng)用等方面綜述了植物單倍體誘導(dǎo)技術(shù)的發(fā)展，尤其是近年來(lái)利用基因組編輯技術(shù)創(chuàng)制主要作物單倍體誘導(dǎo)系的進(jìn)展，并分析了目前研究中存在的問(wèn)題和今后的發(fā)展方向，以期促進(jìn)單倍體誘導(dǎo)技術(shù)尤其是利用基因編輯創(chuàng)造誘導(dǎo)系技術(shù)在作物育種中的應(yīng)用。

單倍體誘導(dǎo)；雄核發(fā)育；雌核發(fā)育；單倍體誘導(dǎo)系

植物單倍體植株的出現(xiàn)不但加快了育種進(jìn)程，而且為遺傳學(xué)研究提供了背景純合的植物材料。但植物單倍體誘導(dǎo)技術(shù)研究經(jīng)歷了漫長(zhǎng)的發(fā)展過(guò)程。1922年首次在曼陀羅()中發(fā)現(xiàn)了天然單倍體植株的存在[1]，40多年后通過(guò)對(duì)曼陀羅花粉進(jìn)行離體培養(yǎng)才獲得了單倍體植株[2]，繼而對(duì)水稻()小孢子進(jìn)行離體培養(yǎng)獲得了再生植株[3]。后來(lái)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)種間雜交染色體消除能夠誘導(dǎo)單倍體胚[4]，利用誘導(dǎo)系授粉和基因編輯技術(shù)可獲得發(fā)育完整的單倍體籽粒，簡(jiǎn)化了單倍體誘導(dǎo)程序。到目前為止，單倍體誘導(dǎo)技術(shù)已經(jīng)在200多種植物中獲得了成功[5]。同時(shí)，染色體加倍技術(shù)也逐步完善，提高了單倍體的加倍效率[6]，促進(jìn)了單倍體誘導(dǎo)技術(shù)在水稻、小麥()、大麥()、玉米()等重要作物遺傳和育種研究中的應(yīng)用。通過(guò)單倍體誘導(dǎo)的植物育種具有快速純合基因、縮短育種年限、提高育種效率等優(yōu)勢(shì)，可與雜交育種、誘變育種、反向育種、分子標(biāo)記輔助選擇育種等技術(shù)結(jié)合，在遺傳群體構(gòu)建、基因功能鑒定、轉(zhuǎn)基因植株快速穩(wěn)定等研究中具有獨(dú)特作用。因此，單倍體育種已成為與分子標(biāo)記輔助育種和轉(zhuǎn)基因育種相媲美的育種核心技術(shù)之一。

單倍體誘導(dǎo)依據(jù)誘導(dǎo)方式分為體外誘導(dǎo)和體內(nèi)誘導(dǎo)。體外誘導(dǎo)進(jìn)一步分為雄配子體誘導(dǎo)和雌配子體誘導(dǎo)。雄配子體誘導(dǎo)包括花藥培養(yǎng)和小孢子培養(yǎng)，雌配子體誘導(dǎo)包括胚珠培養(yǎng)和胚囊培養(yǎng)。體外誘導(dǎo)受基因型、生理狀態(tài)、發(fā)育階段、脅迫預(yù)處理和培養(yǎng)條件等因素的影響。體內(nèi)誘導(dǎo)分為遠(yuǎn)緣雜交誘導(dǎo)、花粉誘導(dǎo)、著絲粒介導(dǎo)、誘導(dǎo)系誘導(dǎo)和CRISPR/Cas9基因編輯誘導(dǎo)?；ㄋ幣囵B(yǎng)和小孢子培養(yǎng)在水稻、小麥、大麥等作物中應(yīng)用比較廣泛。雖然誘導(dǎo)系誘導(dǎo)目前還僅限于玉米等少數(shù)作物，但隨著近幾年利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)制誘導(dǎo)系的問(wèn)世，誘導(dǎo)系誘導(dǎo)在水稻和小麥等作物中已經(jīng)取得了成功。將遠(yuǎn)緣雜交誘導(dǎo)技術(shù)與CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)結(jié)合，在誘導(dǎo)小麥單倍體植株的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)小麥目標(biāo)基因的編輯，而且不涉及轉(zhuǎn)基因環(huán)節(jié)[7]。本文將對(duì)上述幾方面的主要進(jìn)展進(jìn)行綜述，重點(diǎn)介紹誘導(dǎo)系和基因編輯在植物單倍體誘導(dǎo)中的應(yīng)用，并對(duì)未來(lái)發(fā)展方向予以展望。

1 體外誘導(dǎo)作物單倍體技術(shù)

1.1 雄配子體誘導(dǎo)

雄配子體誘導(dǎo)是植物中誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體的傳統(tǒng)方法。綜合文獻(xiàn)報(bào)道，來(lái)自茄科、十字花科和禾本科等250多種植物可以通過(guò)雄配子體誘導(dǎo)單倍體植株[8,9]。植物雄配子體誘導(dǎo)途徑包括花藥培養(yǎng)和小孢子培養(yǎng)?；ㄋ幣囵B(yǎng)操作簡(jiǎn)單，適用于多種作物?；ㄋ幣囵B(yǎng)存在強(qiáng)烈的基因型依賴性和物種特異性。Machii等[10]對(duì)107個(gè)小麥基因型進(jìn)行花藥培養(yǎng)，有83個(gè)基因型產(chǎn)生了愈傷組織，45個(gè)基因型產(chǎn)生了再生植株，其中只有9個(gè)基因型產(chǎn)生了綠苗，25個(gè)基因型只產(chǎn)生白化苗。然而，豆科植物和木本植物，以及禾本科的玉米等，屬于單倍體誘導(dǎo)頑拗型植物，難以通過(guò)雄配子體產(chǎn)生單倍體[9]。一般情況下，花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)的單倍體植株需要經(jīng)過(guò)染色體加倍才能獲得正常結(jié)實(shí)的雙單倍體，但一些物種如大麥在小孢子早期細(xì)胞分裂過(guò)程中通過(guò)染色體自然加倍能夠獲得較高頻率的雙單倍體[6]。盡管花藥培養(yǎng)的應(yīng)用已經(jīng)比較普遍，但對(duì)水稻、大麥、小麥等花藥培養(yǎng)比較容易的作物來(lái)說(shuō)，很多農(nóng)藝性狀優(yōu)良的頑拗基因型其花藥培養(yǎng)仍然不能成功，且對(duì)獲得誘導(dǎo)單倍體的分子生物學(xué)過(guò)程知之甚少，需要剖析單倍體誘導(dǎo)的分子機(jī)制和花藥培養(yǎng)再生植株的遺傳基礎(chǔ)，從而解決基因型限制問(wèn)題。花藥培養(yǎng)由于花藥壁和花絲組織的存在，誘導(dǎo)的單倍體可能存在嵌合體現(xiàn)象，為后續(xù)單倍體鑒定和染色體加倍帶來(lái)了困難。另外，花藥培養(yǎng)單個(gè)花藥的綠苗誘導(dǎo)率非常低，接種量比較大。因此，可以通過(guò)小孢子培養(yǎng)避免嵌合體的產(chǎn)生。更重要的是，可以利用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和功能基因組學(xué)的相關(guān)技術(shù)研究離體培養(yǎng)小孢子的生理生化過(guò)程，以解析通過(guò)雄配子體離體誘導(dǎo)單倍體的分子機(jī)制[11]。

小孢子培養(yǎng)密度高，每毫升培養(yǎng)基中可形成1000個(gè)以上胚胎[5]，遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于花藥形成的胚胎數(shù)目，且避免了體細(xì)胞干擾。盡管小孢子培養(yǎng)研究比較晚，但顯現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)，已成功應(yīng)用于小麥、大麥和水稻等重要作物批量獲得雙單倍體植株。例如，對(duì)35個(gè)硬粒小麥材料的小孢子在C17培養(yǎng)基上培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生了407個(gè)再生植株，其中67.0%的植株可以自然加倍產(chǎn)生雙單倍體[12]。利用IMI培養(yǎng)基對(duì)4個(gè)栽培大麥進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，每4×104個(gè)小孢子可獲得469~534個(gè)胚胎，進(jìn)而發(fā)育為32~160個(gè)植株；尤其用甘露醇預(yù)處理小孢子，染色體自然加倍率提高了8.9%~14.1%[13]。利用不同培養(yǎng)條件對(duì)雜交粳稻小孢子進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)4℃低溫處理水稻幼穗12天，其愈傷組織誘導(dǎo)率和綠苗分化率均高于16天的處理；通過(guò)比較小孢子不同培養(yǎng)時(shí)間(4周、7周和13周)后進(jìn)行分化培養(yǎng)的效果，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)7周后愈傷組織分化效果最好，再生植株自然加倍率為50.0%[14]。

1.2 雌配子體誘導(dǎo)

雌核發(fā)育指對(duì)胚囊或胚珠進(jìn)行離體培養(yǎng)獲得單倍體再生植株。目前，分離和培養(yǎng)卵細(xì)胞仍然比較困難。雖然培養(yǎng)具有8個(gè)細(xì)胞核的胚囊可以誘導(dǎo)雌核發(fā)育，但卵細(xì)胞、助細(xì)胞和反足細(xì)胞都有發(fā)育為單倍體胚胎的潛力。自首次在大麥中報(bào)道雌核發(fā)育以來(lái)[15]，多個(gè)物種通過(guò)雌核發(fā)育獲得了單倍體植株，該技術(shù)主要應(yīng)用于甜菜()和洋蔥()等植物。在甜菜育種中，加倍單倍體(double haploids, DH)技術(shù)已發(fā)揮了一定作用，如將DH親本用于生產(chǎn)F1雜種[16]。對(duì)兩個(gè)伊朗洋蔥品種雌核發(fā)育的研究發(fā)現(xiàn)，多胺類物質(zhì)可以改善雌核發(fā)育，品種Sefid-e-Kurdistan胚胎再生能力可達(dá)6.9%，高于品種Sefid-e-Neishabour的3.3%，其中的73.6%的再生植株是單倍體[17]。利用蕓苔素內(nèi)酯對(duì)擬南芥()和芥菜()去雄后的柱頭后進(jìn)行處理，獲得了單倍體種子[18]。20世紀(jì)末，Li等[19]建立了一種簡(jiǎn)便、高效的水稻未授精子房離體培養(yǎng)技術(shù)，并用于水稻育種和遺傳研究。Mdarhri-Alaoui等[20]對(duì)硬粒小麥未受精子房進(jìn)行離體培養(yǎng)，研究了綠苗形成過(guò)程中形態(tài)發(fā)生的過(guò)程。隨后，Sibi等[21]對(duì)6個(gè)硬粒小麥基因型的未受精子房進(jìn)行培養(yǎng)，均獲得了單倍體和雙單倍體植株。另外，通過(guò)對(duì)26,400個(gè)授粉后的玉米子房進(jìn)行離體培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生了24株單倍體植株，其中的2株經(jīng)秋水仙素處理染色體加倍成功，發(fā)現(xiàn)授粉后19.5 h雌核發(fā)育頻率最高(0.2%)[22]。由于1個(gè)胚珠中僅含1個(gè)卵細(xì)胞，與單個(gè)花藥中含有數(shù)百個(gè)小孢子的花藥培養(yǎng)在數(shù)量上無(wú)法相比，導(dǎo)致雌配子體發(fā)育的誘導(dǎo)效率遠(yuǎn)低于雄配子體發(fā)育。但是，對(duì)于具有孤雄生殖障礙、花粉缺陷或雄配子體誘導(dǎo)產(chǎn)生白化苗的頑拗物種或基因型而言，通過(guò)雌配子培養(yǎng)誘導(dǎo)單倍體是有效的途徑?？傮w而言，雌核培養(yǎng)產(chǎn)生的單倍體遺傳較為穩(wěn)定、白化苗率較低[23,24]。

1.3 通過(guò)配子體誘導(dǎo)單倍體的影響因素

1.3.1 供體植物的基因型和生理狀態(tài)

供體植物種類和基因型決定配子體離體培養(yǎng)誘導(dǎo)單倍體的效率，尤其是雄配子體誘導(dǎo)具有強(qiáng)烈的物種及基因型依賴性，不同物種和基因型對(duì)花藥或小孢子培養(yǎng)的應(yīng)答不同。在小麥族中，普通小麥比硬粒小麥對(duì)雄配子體培養(yǎng)的基因型特異性更強(qiáng)，普通小麥中冬小麥比春小麥的基因型反應(yīng)更敏感。而在水稻的雄配子體誘導(dǎo)培養(yǎng)中，粳稻比秈稻的基因型反應(yīng)更敏感[24]。研究表明，雄配子體誘導(dǎo)培養(yǎng)的頑拗型由花粉中的特異性表達(dá)基因調(diào)控[25]。例如，大多數(shù)小麥基因型中存在抑制基因表達(dá)的基因，限制了雄配子體離體培養(yǎng)產(chǎn)生單倍體；以11個(gè)小麥品種及其組配的20個(gè)F1雜種為材料，發(fā)現(xiàn)Alondra、Verry、石4185、新春9號(hào)和百農(nóng)3217的花藥容易產(chǎn)生愈傷組織，誘導(dǎo)率25.3%~51.9%[26]；對(duì)中國(guó)大面積推廣的24個(gè)優(yōu)良小麥品種連續(xù)2年進(jìn)行花藥培養(yǎng)，植株再生率0~41.8%，基因型差異顯著，其中，石麥4185和邯6172花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)率和分化率較高，可作為小麥單倍體育種的親本材料[27]；秈稻花藥培養(yǎng)過(guò)程中基因型頑固，利用添加10-3mol/L腐胺的N6培養(yǎng)基對(duì)不同秈稻基因型進(jìn)行花藥培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)Grogol、Krowal和Sigundil具有良好的花藥培養(yǎng)能力[28]。利用FHG培養(yǎng)基對(duì)多個(gè)冬大麥基因型進(jìn)行花藥培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)12個(gè)基因型在胚胎誘導(dǎo)、植株再生方面均存在顯著差異[29]。另外，對(duì)46個(gè)玉米基因型在3種培養(yǎng)基(IMSS、N6和YPm)上進(jìn)行花藥培養(yǎng)，表明基因型的影響比培養(yǎng)基的效應(yīng)更大[30]。

供體植物的生理狀態(tài)同樣顯著影響配子體離體培養(yǎng)的效果。主要影響花藥內(nèi)小孢子的數(shù)量和活力、花藥組織的營(yíng)養(yǎng)狀況及內(nèi)源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的含量，進(jìn)而影響雄核發(fā)育能力和單倍體植株誘導(dǎo)效率。與在溫室盆栽條件下生長(zhǎng)的供體植株相比，田間自然條件下生長(zhǎng)植株雄配子體誘導(dǎo)效率更高。田間自然條件通常是供體植物花藥發(fā)育的最佳環(huán)境，有利于雄核體外培養(yǎng)產(chǎn)生單倍體。一般來(lái)說(shuō)，發(fā)育較早的花藥和取自主莖穗上的花藥相對(duì)容易進(jìn)行雄配子體誘導(dǎo)培養(yǎng)。除水稻外，大多數(shù)禾谷類作物主分蘗比側(cè)分蘗花藥中的雄核對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)更敏感。

1.3.2 配子體的發(fā)育階段

外植體的發(fā)育階段對(duì)單倍體誘導(dǎo)效率有重要影響。在小孢子培養(yǎng)中，發(fā)育階段是影響小孢子全能性的關(guān)鍵因素，只有處于形成花粉粒前的小孢子才能在短時(shí)間內(nèi)快速誘導(dǎo)雄核發(fā)育，產(chǎn)生單倍體。對(duì)大多數(shù)植物而言，小孢子細(xì)胞第一次有絲分裂前后，即花粉細(xì)胞處于單核晚期或雙核早期，是雄核誘導(dǎo)培養(yǎng)最敏感的時(shí)期[31]。對(duì)模式植物的研究表明，雙核期花粉的細(xì)胞質(zhì)中開始積累淀粉，不適合用于雄核誘導(dǎo)培養(yǎng)[32]。在小麥中，單核發(fā)育中后期進(jìn)行雄核誘導(dǎo)培養(yǎng)最有效[33]。在大多數(shù)植物中，小孢子發(fā)育并不同步，同一花藥中可以觀察到不同發(fā)育階段的小孢子。因此，選擇含有最大比例胚性小孢子的材料進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)提高小孢子的產(chǎn)胚效率至關(guān)重要。實(shí)際操作中需要對(duì)同一花序不同位置的材料進(jìn)行觀察，確定其花藥內(nèi)小孢子發(fā)育階段，從而確定誘導(dǎo)單倍體所用材料的取材標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.3 脅迫預(yù)處理

通過(guò)對(duì)外植體培養(yǎng)前后進(jìn)行物理或化學(xué)脅迫預(yù)處理可以啟動(dòng)孢子體發(fā)生途徑，阻止正常的配子體發(fā)育過(guò)程，誘導(dǎo)產(chǎn)生更多單倍體[34]。盡管脅迫預(yù)處理的類型、時(shí)間可能因物種和品種而異，但發(fā)現(xiàn)多數(shù)脅迫預(yù)處理方式對(duì)小孢子胚胎形成有促進(jìn)作用[35]。對(duì)于不同類型的外植體，預(yù)處理方式和時(shí)間不同，再生效率也不同。培養(yǎng)起始的脅迫預(yù)處理包括高溫、低溫、碳水化合物、氮饑餓、高滲透壓和秋水仙素處理等，對(duì)小孢子的重編程起著關(guān)鍵作用。就溫度脅迫而言，通常先將花序、花芽或花藥置于低溫或高溫下處理一定時(shí)間，然后接種到培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。對(duì)小孢子常用的預(yù)處理方法有低溫、高溫、饑餓、甘露醇等[36,37]，其中低溫預(yù)處理應(yīng)用最多。在大麥小孢子的提取液和預(yù)處理液中添加適宜濃度秋水仙素不僅提高胚胎發(fā)生率，也提高了再生植株中可育株的比率[38]。據(jù)報(bào)道，4℃低溫預(yù)處理5周可提高頑拗型硬粒小麥基因型雄配子體的胚胎誘導(dǎo)率和植株再生率[36]。Prem等[39]報(bào)道了一項(xiàng)通過(guò)連續(xù) 4℃低溫處理高效誘導(dǎo)甘藍(lán)型油菜小孢子胚胎形成的技術(shù)，單倍體誘導(dǎo)率顯著提高。甘露醇預(yù)處理也能顯著提高硬粒小麥花藥培養(yǎng)效率[40]。通過(guò)比較4℃低溫下利用甘露醇和PEG處理小麥小孢子不同時(shí)間對(duì)培養(yǎng)效果的影響，發(fā)現(xiàn)預(yù)處理5周的效果最好[36]。另外，將分離的小麥新鮮小孢子用含有18 mmol/L的2-HNA和9.0%麥芽糖的溶液在25℃、黑暗條件下處理38~52 h，然后與子房共培養(yǎng)，胚狀體產(chǎn)率(每個(gè)穗子360~4914個(gè)胚狀體)、綠苗產(chǎn)率(15.0%~95.0%)和單倍體自然加倍率(39.0%~78.0%)都得到提高，并且適用于許多基因型[41]。

1.3.4 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

植物花藥培養(yǎng)或小孢子培養(yǎng)能否成功誘導(dǎo)胚胎的形成，在很大程度上取決于培養(yǎng)基的組成。培養(yǎng)基中碳、氮等大量營(yíng)養(yǎng)元素和微量營(yíng)養(yǎng)元素可能決定胚胎發(fā)育的開始，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類和濃度，尤其是生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的合理搭配，可能是影響雄配子體胚胎發(fā)生的關(guān)鍵因子。研究發(fā)現(xiàn)，外植體從配子體向孢子體途徑的重編程依賴于碳水化合物的最佳供給和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的配比及濃度[23]。培養(yǎng)基對(duì)植物種類具有特異性，添加或減少培養(yǎng)基中一個(gè)或多個(gè)組分可以適應(yīng)特定植物或基因型。目前針對(duì)不同植物的花藥培養(yǎng)研發(fā)了適宜的培養(yǎng)基，如Nitsch培養(yǎng)基適用于煙草[42]，MS和N6培養(yǎng)基適用于水稻[43,44]，B5培養(yǎng)基適用于大豆[45]，C17、W14培養(yǎng)基適用于小麥[46]。通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)基中的大量元素和微量元素，研制出了適于小麥花藥培養(yǎng)的癸培養(yǎng)基，花藥培養(yǎng)愈傷組織平均誘導(dǎo)率比C17、W14和N6培養(yǎng)基分別提高了30.3%、50.7%和58.0%[47]。在W14D、W14Gd和W14GD等液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)小麥花藥，出現(xiàn)了經(jīng)胚胎發(fā)生直接成苗現(xiàn)象[26]。同樣，針對(duì)植物小孢子培養(yǎng)也研發(fā)了專用培養(yǎng)基，如適宜于小麥小孢子培養(yǎng)的PB2和NPB99培養(yǎng)基。研究表明，適當(dāng)增加培養(yǎng)基中硫酸銅的用量可以提高小麥小孢子培養(yǎng)再生植株效率，并且顯著減少白化苗率[48]；在培養(yǎng)基中添加適量阿拉伯半乳聚糖蛋白(arabinogalactan proteins, AGPs)可以提高小孢子的活性，增加小孢子胚狀體誘導(dǎo)數(shù)量[49]；在4℃條件下用0.4 mol/L甘露醇預(yù)處理小麥幼穗，然后在含維生素C的RM5培養(yǎng)基上培養(yǎng)小孢子可產(chǎn)生更多的單倍體植株[50]。除了基本培養(yǎng)基和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑外，在培養(yǎng)基中添加一些有機(jī)添加劑如谷氨酰胺、酪蛋白、脯氨酸、生物素、肌醇、椰子汁和活性炭等，對(duì)提高胚胎形成具有促進(jìn)作用[51]。

培養(yǎng)溫度、光照條件、花藥或小孢子的密度等培養(yǎng)條件對(duì)雄配子體的胚胎形成有顯著影響。在水稻花藥培養(yǎng)中，溫度被證明是誘導(dǎo)單倍體的一個(gè)關(guān)鍵因子[52]，然而，有關(guān)培養(yǎng)溫度調(diào)控花藥培養(yǎng)效率的研究還比較少。光是影響花藥培養(yǎng)效果的另一個(gè)環(huán)境因素，對(duì)花粉脫分化為愈傷組織具有一定抑制作用[53]。所以，花藥或小孢子培養(yǎng)的初始階段一般在無(wú)光照下進(jìn)行，后期轉(zhuǎn)移至光照條件下分化植株。對(duì)某些植物來(lái)說(shuō)，光照和黑暗交替培養(yǎng)有利于胚胎再生[54]。

2 體內(nèi)誘導(dǎo)作物單倍體技術(shù)

2.1 遠(yuǎn)緣雜交誘導(dǎo)

遠(yuǎn)緣雜交誘導(dǎo)包括屬間雜交和種間雜交，通過(guò)染色體選擇性消除產(chǎn)生母本單倍體(圖1A)。1970年首次發(fā)現(xiàn)，利用球莖大麥()做父本與大麥雜交，獲得了大麥單倍體植株[4]。隨后發(fā)現(xiàn)，利用球莖大麥做父本與小麥品系中國(guó)春遠(yuǎn)緣雜交，也獲得了小麥單倍體植株[55]。然而，由于多數(shù)小麥品種中存在抑制遠(yuǎn)緣雜交的可交配性顯性基因和，該技術(shù)僅局限于少數(shù)小麥基因型。1986年發(fā)現(xiàn)，小麥做母本與玉米遠(yuǎn)緣雜交，在合子發(fā)育過(guò)程中由于玉米染色體與小麥染色體有絲分裂進(jìn)程不同步，玉米染色體被消除，誘導(dǎo)了小麥單倍體幼胚[56]。進(jìn)一步研究表明，小麥與玉米雜交受精頻率不受小麥基因的影響，即小麥品種具有普遍適用性。由于玉米花粉萌發(fā)對(duì)和基因作用不敏感，小麥-玉米雜交誘導(dǎo)小麥單倍體沒(méi)有小麥基因型的特異性，與其他方法相比更具實(shí)用價(jià)值。通過(guò)對(duì)13個(gè)小麥雜種F1代與玉米雜交，研究了不同小麥生長(zhǎng)環(huán)境、生長(zhǎng)素處理、培養(yǎng)基和壯苗處理對(duì)單倍體及雙單倍體產(chǎn)生頻率的影響，發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)在大田環(huán)境的小麥去雄后割穗離體培養(yǎng)，然后與玉米雜交，平均得胚率23.9%，誘導(dǎo)效率是返青后從大田移栽到溫室盆栽植株的3倍以上；利用2種不同培養(yǎng)基進(jìn)行胚胎拯救，B5培養(yǎng)基上單倍體幼胚萌發(fā)率為82.0%，1/2MS培養(yǎng)基上幼胚萌發(fā)率為76.6%，沒(méi)有顯著差異[57]。本實(shí)驗(yàn)室分別利用玉米誘導(dǎo)系CI011-1和自交系鄭58與矮敗小麥DS987雜交，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)系和自交系對(duì)誘導(dǎo)小麥單倍胚的效率沒(méi)有顯著差異[58]。玉米花粉不但可以誘導(dǎo)小麥產(chǎn)生單倍體，也能夠誘導(dǎo)黑麥和燕麥等禾谷類作物產(chǎn)生單倍體[59,60]。雖然球莖大麥、大芻草()、高粱()和珍珠粟()等植物的花粉也可以誘導(dǎo)小麥單倍體植株，但目前誘導(dǎo)最成功、應(yīng)用最廣泛的還是利用玉米花粉。實(shí)際工作中，可以通過(guò)分期播種的方式調(diào)節(jié)小麥和玉米花期相遇，創(chuàng)造適合小麥單倍體發(fā)育的環(huán)境條件，提高成胚率。

圖1 體內(nèi)誘導(dǎo)植物單倍體4種方法示意圖

A：遠(yuǎn)緣雜交誘導(dǎo)；B：花粉誘導(dǎo)；C：誘導(dǎo)系誘導(dǎo)(MTL)；D：誘導(dǎo)系誘導(dǎo)(CENH3)。

另外，利用小麥作為母本與白茅()雜交，通過(guò)染色體消減可以誘導(dǎo)小麥單倍體幼胚，在誘導(dǎo)小黑麥單倍體植株中也顯示了一定潛力[61,62]。白茅是一種多年生植物，在自然條件下與小麥和小黑麥的開花期吻合，不需要經(jīng)常播種，在世界上幾乎所有種植小麥的地區(qū)都可以正常生長(zhǎng)，花粉量較大，雜交容易成功。此外，白茅幾乎可以與所有小麥和小黑麥或其衍生材料雜交，不存在基因型的特異性。

2.2 花粉誘導(dǎo)

花粉誘導(dǎo)法是通過(guò)在授粉前采用物理(輻射和高溫)或化學(xué)(甲苯胺藍(lán))處理，甚至通過(guò)延遲授粉時(shí)間等方法，致使花粉中遺傳物質(zhì)損傷進(jìn)而誘導(dǎo)單倍體的產(chǎn)生。這些經(jīng)過(guò)處理的花粉不能與胚珠內(nèi)卵細(xì)胞正常受精，但能刺激卵細(xì)胞形成單倍體胚胎(圖1B)。該技術(shù)已成功應(yīng)用于小麥、玉米、煙草()等重要作物的單倍體誘導(dǎo)[8]。例如，利用X射線照射處理一粒小麥()減數(shù)分裂時(shí)期的植株，獲得了單倍體籽粒，誘導(dǎo)率0.5%[63]；對(duì)玉米花粉進(jìn)行3個(gè)不同溫度(40℃、45℃和50℃)熱擊處理，發(fā)現(xiàn)50℃熱擊處理下單倍體誘導(dǎo)率達(dá)到1.5%，而未經(jīng)熱擊處理的單倍體誘導(dǎo)率僅為0.6%[64]。通過(guò)對(duì)一粒小麥延遲授粉時(shí)間，單倍體植株誘導(dǎo)頻率提高，在延遲授粉9天處理下單倍體誘導(dǎo)率達(dá)到37.5%[65]?；ǚ壅T導(dǎo)法最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)在于對(duì)花粉的處理，其中，使用輻射處理的劑量需要適中，劑量偏低花粉生殖核部分受損但能與卵細(xì)胞結(jié)合產(chǎn)生雜交種，劑量偏高胚胎形成率降低但多為單倍體[66]，延遲授粉時(shí)間要根據(jù)不同物種開花規(guī)律掌握。

2.3 誘導(dǎo)系直接誘導(dǎo)和遺傳修飾間接誘導(dǎo)

2.3.1 誘導(dǎo)系誘導(dǎo)

誘導(dǎo)系誘導(dǎo)是目前玉米產(chǎn)生單倍體的主要方式(圖1C)。1959年Coe等[67]首次報(bào)道，玉米單倍體誘導(dǎo)系Stock 6作為父本可誘導(dǎo)母本產(chǎn)生2.0%~3.0%的單倍體種子。隨著WS14、MHI、CAUHOI、RWS、PHI、UH400、BHI306和CAU5等優(yōu)良玉米單倍體誘導(dǎo)系的培育，玉米單倍體植株誘導(dǎo)率可達(dá)8.0%~ 16.0%[68~71]。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)陳紹江教授實(shí)驗(yàn)室利用分子標(biāo)記輔助選擇方法培育了3個(gè)高油誘導(dǎo)系，油份含量8.5%左右，單倍體誘導(dǎo)率約為8.0%[72]；在此基礎(chǔ)上，創(chuàng)制出誘導(dǎo)率達(dá)到8.0%以上的高頻誘導(dǎo)系6個(gè)，其中兩個(gè)誘導(dǎo)系的誘導(dǎo)率超過(guò)15.0%。研究表明，玉米誘導(dǎo)系中誘導(dǎo)玉米單倍體主要由關(guān)鍵基因控制[73~75]。通過(guò)精細(xì)定位、基因組測(cè)序、遺傳互補(bǔ)和基因編輯等方法，發(fā)現(xiàn)玉米中的單倍體誘導(dǎo)是由于一種精子細(xì)胞質(zhì)特異性磷脂酶(matrilineal, MTL)編碼基因的移碼突變導(dǎo)致[74]。將玉米誘導(dǎo)系Stock 6的衍生系CAU5與模式玉米基因型B73的參考基因組序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)第4外顯子中存在4 bp (CGAG)的插入，該移碼突變導(dǎo)致MTL蛋白20個(gè)氨基酸的改變和29個(gè)氨基酸的缺失[73]。

2.3.2 CRISPR/Cas9編輯MTL蛋白編碼關(guān)鍵基因誘導(dǎo)

通過(guò)在第1外顯子中設(shè)計(jì)gRNA靶位點(diǎn)，構(gòu)建含基因靶點(diǎn)和Cas9序列的表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化玉米自交系的幼胚，在轉(zhuǎn)基因植株中檢測(cè)到10株發(fā)生基因編輯，然后分別選取在gRNA靶位點(diǎn)發(fā)生1 bp插入、11 bp缺失和1 bp缺失的3個(gè)T1株系自交，并作為父本與ZD958和JK968雜交，發(fā)現(xiàn)單倍體誘導(dǎo)率為2.0%[73]。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)玉米/基因自然突變發(fā)生位點(diǎn)上游5 bp位置進(jìn)行靶向突變，突變率達(dá)87.1%；同時(shí)，采用胚特異型啟動(dòng)子和胚乳特異性啟動(dòng)子，構(gòu)建胚特異表達(dá)綠色熒光蛋白(eGFP)和胚乳特異表達(dá)紅色熒光蛋白(DsRED)的雙熒光單倍體篩選與標(biāo)記鑒定系統(tǒng)，獲得的誘導(dǎo)系能夠高效誘導(dǎo)單倍體，誘導(dǎo)率可達(dá)11.0%，平均誘導(dǎo)率7.5%[76]。

禾谷類作物中高度保守，因此可以利用CRISPR/Cas9編輯技術(shù)創(chuàng)制多種作物單倍體誘導(dǎo)系，建立誘導(dǎo)單倍體技術(shù)體系。針對(duì)水稻中基因的同源基因，分別在其第1個(gè)外顯子的氨基酸末端和第4外顯子距離玉米基因自然突變發(fā)生位點(diǎn)7 bp位置設(shè)計(jì)兩個(gè)靶點(diǎn)gRNA進(jìn)行CRISPR/Cas9基因編輯，突變率達(dá)80.0%，自交后代中單倍體平均誘導(dǎo)率為6.0%[77]。另一項(xiàng)研究中，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)沉默水稻品種春優(yōu)84中玉米單倍體誘導(dǎo)基因的同源基因，在248株轉(zhuǎn)基因后代中篩選到具有雜交稻背景的9株單倍體植株和2株雙單倍體植株，證明通過(guò)基因編輯可以誘導(dǎo)水稻產(chǎn)生單倍體[78]。最新研究表明，采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除小麥中玉米基因的兩個(gè)同源等位基因和，成功誘導(dǎo)了小麥單倍體籽粒，誘導(dǎo)率為2.0%~3.0%[79]。本實(shí)驗(yàn)室針對(duì)小麥優(yōu)化了CRISPR/Cas技術(shù)體系，進(jìn)一步對(duì)小麥基因進(jìn)行編輯，發(fā)現(xiàn)編輯植株繁茂性和結(jié)實(shí)率等性狀顯著降低，通過(guò)對(duì)編輯植株進(jìn)行分子細(xì)胞遺傳學(xué)和表型鑒定，單倍體籽粒誘導(dǎo)率高達(dá)18.9%，并且首次在禾谷類作物中發(fā)現(xiàn)了無(wú)胚型和胚及胚乳雙無(wú)型籽粒[80]。

2.3.3 沉默著絲粒特異性組蛋白CENH3編碼基因誘導(dǎo)

編碼著絲粒特異性組蛋白的基因是近年來(lái)利用誘導(dǎo)系誘導(dǎo)單倍體的另一個(gè)研究熱點(diǎn)(圖1D)。Ravi等[81]發(fā)現(xiàn)，擬南芥無(wú)效突變體具有致死性，將經(jīng)過(guò)遺傳修飾的著絲粒特異性組蛋白編碼基因?qū)朐摂M南芥突變體，可恢復(fù)植株的野生表型，轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株雜交可產(chǎn)生只含野生型基因組的單倍體，其原因是CENH3介導(dǎo)了母本基因組的完全消除。利用RNAi技術(shù)沉默內(nèi)源基因，然后將GFP-CENH3-tailswap表達(dá)載體導(dǎo)入沉默內(nèi)源基因的材料，CENH3活性恢復(fù)，自交后結(jié)實(shí)率正常。然而，當(dāng)利用轉(zhuǎn)基因株系與非轉(zhuǎn)基因株系雜交時(shí)，從140個(gè)子代中鑒定出許多非整倍體和1個(gè)單倍體。這些結(jié)果表明，CENH3著絲粒介導(dǎo)和RNAi技術(shù)可用于多倍體作物的單倍體誘導(dǎo)[82]。利用EMS (ethymethyl sulfonate)誘變和TILLING (targeting induced local lesions in genomes)技術(shù)結(jié)合，在擬南芥中已鑒定到CENH3的多個(gè)保守氨基酸位點(diǎn)(如L130F、P82S、G83E、A132T、A136T和A86V等)，突變體中任一氨基酸的互補(bǔ)后與野生型雜交，可誘導(dǎo)單倍體的產(chǎn)生，后代單倍體比例為0.6%~12.2%[83,84]。EMS誘變結(jié)合TILLING分析技術(shù)操作簡(jiǎn)便、通量高，可以對(duì)CENH3每個(gè)氨基酸進(jìn)行點(diǎn)突變，而且該技術(shù)不涉及轉(zhuǎn)基因[8]。最近，從擬南芥EMS誘變后代中鑒定了31個(gè)單個(gè)氨基酸替換的等位基因，將其導(dǎo)入敲除突變體，可以補(bǔ)償內(nèi)源的敲除效應(yīng)，轉(zhuǎn)基因植株接受野生型花粉后能夠誘導(dǎo)單倍體的產(chǎn)生。并且，利用CRISPR/Cas9編輯技術(shù)獲得了保守的CENH3組蛋白折疊結(jié)構(gòu)域中αN螺旋的移碼突變類型，該類型為優(yōu)良的單倍體誘導(dǎo)系，用野生型花粉授粉時(shí)誘導(dǎo)系生長(zhǎng)和發(fā)育正常[85]。由于CENH3廣泛存在于真核生物中，且具有高度進(jìn)化保守性，人們嘗試在其他植物中利用CENH3組蛋白介導(dǎo)的方法誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體。通過(guò)對(duì)玉米進(jìn)行遺傳修飾，成功獲得了單倍體，雖然單倍體誘導(dǎo)率非常低，但為其他重要作物建立單倍體誘導(dǎo)技術(shù)提供了借 鑒[86]。

2.3.4 誘導(dǎo)系誘導(dǎo)單倍體的機(jī)理

目前，玉米單倍體誘導(dǎo)系的作用機(jī)制還不清楚，主要有2種假說(shuō)，即單受精孤雌生殖和合子后基因組消除[87,88]。研究表明，玉米單倍體誘導(dǎo)過(guò)程中發(fā)生了雙受精，染色體消失是玉米單倍體誘導(dǎo)的基礎(chǔ)[71,87,88]。為了明確玉米單倍體誘導(dǎo)的機(jī)理，Zhao等[88]檢測(cè)了利用兩個(gè)新玉米誘導(dǎo)系CAUB (含有B染色體)和CAUYFP (含有CENH3-YFP)誘導(dǎo)的單倍體植株，在少數(shù)單倍體中檢測(cè)到B染色體和44 Mb左右的誘導(dǎo)系染色體片段，發(fā)現(xiàn)了染色體選擇性消失的部分證據(jù)，進(jìn)一步證實(shí)單倍體的形成發(fā)生了雙受精，存在誘導(dǎo)系染色體滲入現(xiàn)象。進(jìn)一步利用HI-Edit方法獲得只含母本全套染色體的單倍體編輯植株，表明處在瞬時(shí)合子狀態(tài)下，雌雄配子融合，卵細(xì)胞受精，為合子后基因組消除假說(shuō)提供了直接證據(jù)[7]。綜上所述，玉米單倍體誘導(dǎo)系誘導(dǎo)單倍體的原理是其染色體在合子胚中選擇性消失，但不排除單受精促進(jìn)單倍體誘導(dǎo)的可能性，染色體消失的原因和具體過(guò)程尚不清楚。著絲粒介導(dǎo)的染色體消除的機(jī)制可能是由于修飾的著絲粒姐妹染色單體在合子發(fā)生有絲分裂時(shí)，紡錘絲未能牽引突變的姐妹染色單體分離，從而使突變體親本的染色體消失，形成了單倍體[89]。和是植物單倍體誘導(dǎo)的關(guān)鍵基因，可以利用和介導(dǎo)的誘導(dǎo)系誘導(dǎo)單倍體的產(chǎn)生，然后進(jìn)行細(xì)胞學(xué)和遺傳學(xué)等研究，以闡明單倍體誘導(dǎo)的確切機(jī)制[73,74,88,90]。

3 單倍體誘導(dǎo)技術(shù)的應(yīng)用

3.1 新品種培育

通常采用傳統(tǒng)育種方法獲得作物純合穩(wěn)定品系需要連續(xù)7代自交和選擇，且無(wú)法實(shí)現(xiàn)所有性狀的絕對(duì)純合，而雙單倍體技術(shù)只需1~2代即可獲得遺傳上100.0%純合的品系。高效的雙單倍體技術(shù)能節(jié)約育種時(shí)間和成本，克服常規(guī)育種的許多局限，加速育種進(jìn)程[5]。油菜()品種Maris Haplona是第一批利用單倍體技術(shù)育成的作物品種，其次是大麥品種Mingo[91,92]。隨著單倍體誘導(dǎo)技術(shù)和染色體加倍方法不斷完善，雙單倍體技術(shù)被全球眾多實(shí)驗(yàn)室和生物技術(shù)公司用于多種作物的改良，包括大麥、小麥、油菜、水稻、玉米和煙草等[8]。歐洲目前種植的大麥品種中約50.0%是通過(guò)DH技術(shù)選育出來(lái)的[5]。法國(guó)、加拿大等育成了一批高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的小麥新品種[93]，并在歐洲和中東地區(qū)得到推廣，同時(shí)建立了整套單倍體育種規(guī)?；夹g(shù)體系，每年可獲得數(shù)以萬(wàn)計(jì)的小麥單倍體植株。20世紀(jì)80年代以來(lái)，中國(guó)科學(xué)家利用花培技術(shù)培育了中花8號(hào)、中花9號(hào)、中花10號(hào)、中花14、中花15和汕優(yōu)163等水稻新品種，以及京花1號(hào)、花培5號(hào)、花培8號(hào)、奎花2號(hào)、寧春50號(hào)等小麥新品種。利用小麥–玉米雜交技術(shù)培育了高產(chǎn)、節(jié)水、抗條銹病和白粉病的小麥新品種中麥533，在區(qū)域試驗(yàn)和生產(chǎn)試驗(yàn)中比對(duì)照增產(chǎn)5.2%~9.7%[94]。

3.2 DH群體構(gòu)建和遺傳分析

育種家通常采用分子標(biāo)記輔助選擇(molecular marker assisted selection, MAS)和全基因組選擇(genome wide selection, GWS)提高育種效率。利用目標(biāo)基因的特異性分子標(biāo)記定向選擇目標(biāo)植株，丟棄大量非目標(biāo)基因組合的植株，最小化田間試驗(yàn)和減少世代數(shù)量，發(fā)揮MAS的最大效用[24,95]。MAS結(jié)合DH技術(shù)為提高遺傳增益和縮短育種時(shí)間提供了新的策略，并已成功加速禾谷類作物的育種進(jìn)程。通過(guò)MAS與DH技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，創(chuàng)制了一系列含有抗銹病基因的小麥DH品系[96]?；亟晦D(zhuǎn)育是改良具有明顯缺陷優(yōu)良品種的一種有效方法。在回交過(guò)程中通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇，將1個(gè)或有限數(shù)量的基因以易位方式轉(zhuǎn)移至的優(yōu)良品種中，實(shí)現(xiàn)優(yōu)良基因的積聚[97]。但回交完成后，需要自交固定目的基因。對(duì)于單基因易位轉(zhuǎn)移，所需純合基因型個(gè)體的預(yù)期概率是1/4。而對(duì)于多基因的漸滲，預(yù)期基因型的頻率呈1/4指數(shù)下降(其中，是分離目的基因的個(gè)數(shù))。然而，單倍體目標(biāo)基因型以1/2的頻率產(chǎn)生[97~99]。因此，利用DH技術(shù)顯著減少了選擇目標(biāo)基因型所需的群體大小，結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇提高了選擇目標(biāo)基因的效率和精確度。

分子標(biāo)記輔助選擇育種方法受遺傳標(biāo)記數(shù)量及分布的影響，多數(shù)條件下僅能檢測(cè)出少量遺傳變異，隨著多種植物全基因組測(cè)序的完成，大量單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)標(biāo)記被開發(fā)出來(lái)，利用DH系進(jìn)行GWS育種能大大提高育種效率[24,66]。與MAS相比，GWS基于表型和基因型數(shù)據(jù)，采用全基因組標(biāo)記預(yù)測(cè)對(duì)照群體基因組預(yù)估育種值(genomic estimated breeding values, GEBVs)；同時(shí)，在一個(gè)育種周期內(nèi)，利用對(duì)照群體中估算的標(biāo)記效應(yīng)用于沒(méi)有表型分析的GEBVs預(yù)測(cè)，該GEBVs可以提早或在沒(méi)有出現(xiàn)表型特征之前預(yù) 測(cè)，使育種者做出遺傳增益的早期選擇，縮短選擇周期[100,101]。通過(guò)對(duì)兩個(gè)玉米自交系雜交產(chǎn)生的DH和F2群體進(jìn)行的GWS和MAS分析表明，GWS效果優(yōu)于MAS；在使用GWS情況下，DH群體效果優(yōu)于F2群體[102]。

反向育種包括利用一定方法獲得雜交種原親本品系，將原親本品系重新固定雜種優(yōu)勢(shì)以獲得更多的雜交種，增加育種中可篩選的雜交種數(shù)量。利用雜交育種技術(shù)時(shí)，期望通過(guò)促進(jìn)減數(shù)分裂時(shí)期同源染色體的交叉和交換，實(shí)現(xiàn)基因重組，打破有利基因與不利基因間的連鎖，聚集有利基因[103]。反向育種正好與此相反，期望完全阻止同源染色體的交叉和交換，使得同源染色體在減數(shù)分裂中期Ⅰ和后期Ⅰ如同單價(jià)體一樣隨機(jī)分離[103]。Wijnker等[104]成功實(shí)現(xiàn)擬南芥反向育種，驗(yàn)證了著絲粒介導(dǎo)的單倍體誘導(dǎo)技術(shù)的可行性，為其他植物提供了新思路。DH技術(shù)與反向育種結(jié)合能解密雜交品種的親本基因型，從雜交種中獲得純合的原親本品系，重建原始雜種，固定雜種優(yōu)勢(shì)[66]。

3.3 遺傳圖譜構(gòu)建和基因組研究

由于DH群體完全純合，遺傳穩(wěn)定，背景一致，是遺傳作圖的理想材料。通過(guò)構(gòu)建擬南芥親本的DH系和重組自交系，比較兩個(gè)群體在數(shù)量性狀基因座(quantitative trait locus, QTL)定位上的差異，發(fā)現(xiàn)二者的重組率和親本等位基因頻率相似，并利用新構(gòu)建的DH群體定位到開花時(shí)間和葉柄長(zhǎng)度的QTL，表明DH群體可以代替重組自交系成為擬南芥遺傳研究的便捷材料[105]。DH群體遺傳作圖已成功應(yīng)用于多種重要作物，尤其在大麥、水稻、油菜和小麥等研究中應(yīng)用普遍[106]。DH群體已被廣泛用于QTL作圖，如玉米蟲漆酶，大麥抗赤霉病，水稻砷富集、產(chǎn)量相關(guān)性狀、株高和蒸煮品質(zhì)，以及小麥株高、抽穗期、面粉顏色、磷利用效率、缺鋅和抗黑穗病等QTL研究[8]。尤其在水稻中，DH群體已被用于產(chǎn)量、品質(zhì)等農(nóng)藝性狀的QTL定位。DH群體在分離群體分組分析(bulked segregation analysis, BSA)中建立標(biāo)記與性狀關(guān)聯(lián)方面也是非常理想的材料選擇。BSA分析主要用于在雙親群體分離后代中選擇具有極端表型的個(gè)體混樣，通過(guò)比較不同極端混池之間的多態(tài)性并結(jié)合表型，對(duì)受環(huán)境影響較小的質(zhì)量性狀基因或主效基因進(jìn)行初步定位。構(gòu)建遺傳分離世代的DH群體，從選定的DH群體中提取DNA，然后通過(guò)分子標(biāo)記逐步進(jìn)行基因分型。BSA分析結(jié)合DH技術(shù)可以建立與病蟲害和品質(zhì)等性狀關(guān)聯(lián)的標(biāo)記輔助選擇體系[107]。

DH群體在基因組學(xué)研究中也有重要作用，可以在DH群體中利用表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tag, EST)和QTL相對(duì)位置尋找候選基因，利用BAC (bacterial artificial chromosome)文庫(kù)確定候選基因在染色體上的物理位置。DH群體在整合遺傳和物理圖譜中扮演至關(guān)重要的角色，提高了靶向候選基因的精確性。單倍體和雙單倍體也可用于基因組測(cè)序。雙單倍體相比雜交種，基因位點(diǎn)純合，遺傳基礎(chǔ)簡(jiǎn)單，且可以長(zhǎng)期保存，重復(fù)利用，在全基因組測(cè)序、組裝和拼接中具有較大優(yōu)勢(shì)。目前多種植物的雙單倍體已被用于參考基因組測(cè)序。誘變提供了另一種將基因與表型聯(lián)系起來(lái)的方法。TILLING突變體庫(kù)已成功應(yīng)用于幾個(gè)物種的正向和反向遺傳學(xué)研究，利用突變體庫(kù)優(yōu)選DH系可以避免由于原始材料遺傳變異導(dǎo)致的假陽(yáng)性。DH技術(shù)也可用于突變體后代的快速分離和純合。誘變處理的材料通常是種子，但也可以有目的性選擇小孢子進(jìn)行處理。通過(guò)誘變處理配子細(xì)胞，然后誘導(dǎo)胚胎形成和DH系產(chǎn)生，可直接構(gòu)建純合突變體系[108]。這樣避免了嵌合體或雜合子的掩蔽效應(yīng)，隱性性狀和顯性性狀在單倍體細(xì)胞、組織和植株水平上能夠正常表達(dá)和被識(shí)別。在許多植物中，單倍體誘變處理結(jié)合改進(jìn)的DH技術(shù)成為一種可行的途徑。

3.4 基因工程改良

隨著多種植物全基因組序列的釋放，越來(lái)越多的基因功能被注釋。然而，利用多種正向遺傳和反向遺傳學(xué)方法驗(yàn)證基因功能還比較困難。二倍體或多倍體隱性突變基因或轉(zhuǎn)基因不能在M1或T0代植株中表現(xiàn)出來(lái)，需要自交多代獲得純合基因型，同時(shí)驗(yàn)證多個(gè)基因的功能則需要自交更多代，花費(fèi)的時(shí)間和成本成倍增加，成為植物基因功能驗(yàn)證的重要障礙和瓶頸之一[66]。單倍體和雙單倍體均可用于目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植株，從而用于目標(biāo)基因定位和功能鑒定等研究[5]。利用3種不同的轉(zhuǎn)化方法(基因槍法、電激轉(zhuǎn)化法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法)對(duì)小麥小孢子或小孢子胚胎進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了純合的轉(zhuǎn)基因植株[109]。利用基因槍介導(dǎo)法對(duì)大麥小孢子進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得純合轉(zhuǎn)基因植株[110]。將大麥基因轉(zhuǎn)入小麥花藥來(lái)源的單倍體胚胎，獲得耐旱單倍體植株，對(duì)其進(jìn)行加倍獲得純合雙單倍體轉(zhuǎn)基因植株[111]。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻花藥愈傷組織，經(jīng)自然加倍和秋水仙素誘導(dǎo)加倍，獲得含基因雙單倍體轉(zhuǎn)基因植株[112]。單倍體技術(shù)結(jié)合基因工程技術(shù)在獲得純合轉(zhuǎn)基因植株的同時(shí)，可以去除標(biāo)記基因，獲得無(wú)篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株[113]。單倍體技術(shù)結(jié)合基因編輯技術(shù)可以在一個(gè)生育期內(nèi)獲得含有目標(biāo)性狀的DH系，繼而進(jìn)行基因功能分析，該技術(shù)可用于商業(yè)化作物品種的遺傳修飾[7,114]?？傊T導(dǎo)T0代轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生單倍體，加倍后對(duì)雙單倍體植株進(jìn)行分子檢測(cè)，只要檢測(cè)到轉(zhuǎn)入基因的存在，即可篩選到純合轉(zhuǎn)基因植株，縮短了通過(guò)自交獲得純合轉(zhuǎn)基因植株的時(shí)間，加快對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行功能鑒定的速度。

4 植物單倍體誘導(dǎo)研究的思考與展望

4.1 提高植物單倍體誘導(dǎo)頻率的策略

半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，單倍體誘導(dǎo)技術(shù)在水稻、小麥和玉米等重要農(nóng)作物遺傳改良中廣泛應(yīng)用，雖然取得了許多成果，但單倍體誘導(dǎo)頻率依然偏低。目前，在單倍體誘導(dǎo)研究和應(yīng)用中，水稻主要采用花藥培養(yǎng)和小孢子培養(yǎng)技術(shù)，小麥主要采用花藥培養(yǎng)、小麥–玉米雜交(染色體消除)和小孢子培養(yǎng)技術(shù)，玉米主要采用誘導(dǎo)系誘導(dǎo)技術(shù)。相比之下，花藥培養(yǎng)存在強(qiáng)烈的基因型特異性，基因型間差異顯著，同時(shí)受母體生理狀態(tài)、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的影響。因此，篩選和利用花藥培養(yǎng)力高的基因型作為親本之一，在適宜的栽培環(huán)境中保證母體植株生長(zhǎng)健壯，改進(jìn)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，以提高花藥培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)單倍體植株的效率。小孢子培養(yǎng)在誘導(dǎo)單倍體植株的數(shù)量上具有優(yōu)勢(shì)，基因型的特異性小，但操作技術(shù)比較復(fù)雜，容易污染，簡(jiǎn)化培養(yǎng)程序、采用適宜的預(yù)處理方式、減少污染等可以提高小孢子培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)單倍體植株的效率。染色體消除技術(shù)的基因型依賴性也比較小，但授粉后在溫和、高濕的生長(zhǎng)環(huán)境中才能獲得較高的得胚率(可達(dá)50.0%以上)，并且需要離體培養(yǎng)進(jìn)行胚胎拯救，采用甜玉米花粉和授粉后在人工氣候室中水培小麥植株可以提高染色體消除技術(shù)誘導(dǎo)小麥單倍體植株的效率。盡管誘導(dǎo)系誘導(dǎo)玉米單倍體的效率最高可達(dá)20.0%~30.0%，但誘導(dǎo)單倍體的同時(shí)伴有不良農(nóng)藝性狀的出現(xiàn)，嚴(yán)重時(shí)甚至死亡，即誘導(dǎo)系的遺傳背景一定程度上限制了這些誘導(dǎo)系的應(yīng)用，需要利用高誘導(dǎo)率的誘導(dǎo)系與優(yōu)良自交系雜交，創(chuàng)制農(nóng)藝性狀好、誘導(dǎo)頻率高的誘導(dǎo)系。另外，現(xiàn)已明確了不同玉米誘導(dǎo)系誘導(dǎo)單倍體胚胎發(fā)生主要由兩個(gè)關(guān)鍵基因和控制[73~75,115]，可以通過(guò)雜交育種途徑培育聚合這兩個(gè)基因的新型誘導(dǎo)系，提高利用該技術(shù)誘導(dǎo)玉米單倍體植株的效率。

4.2 通過(guò)編輯或誘變MTL基因獲得單倍體誘導(dǎo)系

近年來(lái)，植物單倍體發(fā)生的遺傳機(jī)理逐步成為了研究熱點(diǎn)。CENH3介導(dǎo)的基因組消除誘導(dǎo)單倍體是單倍體技術(shù)的一項(xiàng)重大突破，該方法已成功用于玉米和芥菜等作物新品種培育，可望應(yīng)用于更多作物單倍體育種工作。在種間雜交誘導(dǎo)單倍體中，認(rèn)為染色體消除與單親本著絲粒失活有關(guān)[116]。在種內(nèi)雜交中，發(fā)現(xiàn)精子特異性磷脂酶(MTL)是玉米單倍化產(chǎn)生的主要因子[73~75]，并克隆了玉米基因。通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)編輯玉米、水稻和小麥中的基因，相繼獲得了玉米、水稻和小麥單倍體植株[73,76,77,79]。該基因在禾谷類作物中具有保守性，利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯更多禾谷類作物中的基因，可以建立這些作物單倍體誘導(dǎo)體系。同時(shí)，可以克隆雙子葉植物尤其豆科植物中的基因，進(jìn)一步通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)編輯這些植物中的基因，獲得單倍體植株，解決豆科植物單倍體育種的瓶頸問(wèn)題。另外，由于基因編輯技術(shù)仍然依賴于轉(zhuǎn)基因環(huán)節(jié)，利用CRISPR/Cas9編輯基因獲得的單倍體誘導(dǎo)系在實(shí)際應(yīng)用中受到限制，可以利用輻射誘變的方法處理植物種子或花粉，在后代群體中篩選基因發(fā)生沉默的突變體，用于商業(yè)化目標(biāo)的作物單倍體育種工作。最近，先正達(dá)公司將遠(yuǎn)緣雜交誘導(dǎo)單倍體與CRISPR/Cas9編輯技術(shù)結(jié)合，獲得了、和基因編輯，且不涉及轉(zhuǎn)基因環(huán)節(jié)和無(wú)外源DNA序列整合的小麥單倍體種子，顯示了良好的應(yīng)用前景[7]。同樣道理，可以將小麥近緣植物中基因編輯靶點(diǎn)gRNA和Cas9轉(zhuǎn)入玉米或大麥中，利用近緣植物與玉米或大麥雜交過(guò)程中，玉米或大麥花粉攜帶的基因的gRNA和Cas9在近緣植物子房中瞬間表達(dá)，進(jìn)而編輯雌配子中的基因，獲得基因編輯的單倍體，通過(guò)染色體加倍獲得單倍體誘導(dǎo)系，用于這些作物的單倍體育種。最近，利用誘導(dǎo)系CAUHOI和CAU5組配的群體，在qhir8位點(diǎn)定位到了另外一個(gè)單倍體誘導(dǎo)基因，將其定位在成熟花粉的細(xì)胞膜上，發(fā)現(xiàn)基因單堿基突變體單倍體誘導(dǎo)率提高2~3倍，完全敲除基因單倍體誘導(dǎo)率提高5~6倍，豐富了誘導(dǎo)植物單倍體誘導(dǎo)的基因資源。尤其，同時(shí)編輯和基因顯著提高了單倍體誘導(dǎo)率[115]。因此，利用基因編輯技術(shù)敲除與植物胚胎發(fā)生的相關(guān)基因，能夠簡(jiǎn)單、快速獲得作物單倍體，具有廣闊應(yīng)用前景。

4.3 單倍體誘導(dǎo)技術(shù)結(jié)合基因編輯技術(shù)創(chuàng)造突變體

基因編輯技術(shù)結(jié)合單倍體誘導(dǎo)技術(shù)不但可以編輯重要基因，而且能夠獲得純合編輯植株。根據(jù)小麥同源基因、和設(shè)計(jì)gRNA靶位點(diǎn)，構(gòu)建CRISPR/Cas9表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入到玉米自交系NP2222中，然后利用轉(zhuǎn)基因玉米花粉給小麥?zhǔn)诜?，獲得了小麥基因編輯的單倍體植株和加倍單倍體植株[7]。利用基因編輯技術(shù)同時(shí)敲除雜交水稻品種春優(yōu)84中4個(gè)內(nèi)源基因、、和，獲得了可以發(fā)生無(wú)融合生殖的Fix (Fixation of hybrids)材料；在145個(gè)Fix后代植株中有136個(gè)四倍體，9個(gè)二倍體；通過(guò)測(cè)序鑒定，二倍體子代基因型與親本完全一致，均為稻春優(yōu)84遺傳背景，且這些F2代植株的表型也與野生型高度相似；證明通過(guò)基因編輯技術(shù)同時(shí)編輯這4個(gè)基因，可將無(wú)融合生殖特性引入到雜交稻中，實(shí)現(xiàn)雜合基因型的固定[78]。將靶定和基因的CRISPR/ Cas9載體分別轉(zhuǎn)化玉米自交系NP2222，然后與玉米誘導(dǎo)系RWKS雜交，在F2代分離群體中篩選到純合并且含基因的誘導(dǎo)系植株，再分別與玉米自交系GP721、GP650、154F04、ID5829 和412F雜交，獲得編輯和的單倍體植株，該方法被稱為HI-Edit[7]。另外，將含基因靶點(diǎn)的CRISPR/Cas9載體轉(zhuǎn)入玉米自交系ZC01，轉(zhuǎn)基因植株與誘導(dǎo)系CAU5雜交，創(chuàng)制了攜帶CRISPR/Cas9載體(用于編輯基因)的誘導(dǎo)系；然后將該誘導(dǎo)系用作父本與B73雜交，獲得245株單倍體植株，其中10株中基因發(fā)生了編輯，編輯效率約為4.1%，該方法被稱為IMGE (haploidinducer- mediated genome editing)[117]。HI-Edit和IMGE方法是將單倍體誘導(dǎo)與CRISPR/Cas9結(jié)合的典范，在兩個(gè)世代內(nèi)即可創(chuàng)造經(jīng)基因編輯改良的雙單倍體系。

4.4 通過(guò)誘導(dǎo)系或MTL基因編輯技術(shù)誘導(dǎo)單倍體的鑒定

單倍體在植株水平可以利用細(xì)胞學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、基因組學(xué)和形態(tài)學(xué)等方法進(jìn)行鑒定，包括保衛(wèi)細(xì)胞長(zhǎng)度、染色體數(shù)目、DNA總量、基因拷貝數(shù)和植株高度等[58,79]。通過(guò)花藥培養(yǎng)、子房培養(yǎng)和遠(yuǎn)緣雜交等技術(shù)誘導(dǎo)產(chǎn)生的植株幾乎全部為單倍體，可以全部進(jìn)行染色體加倍處理獲得二倍體植株。但通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)編輯基因或誘導(dǎo)系授粉產(chǎn)生的單倍體胚，其頻率較低，需要在籽粒發(fā)育階段辨別單倍體和二倍體，以便進(jìn)行染色體加倍。

花青素基因可以作為胚和胚乳特異性標(biāo)記，用于鑒定玉米誘導(dǎo)系誘導(dǎo)的單倍體。含有純合標(biāo)記基因的玉米誘導(dǎo)系與單交種雜交，誘導(dǎo)產(chǎn)生的單倍體胚無(wú)顏色，胚乳紫色，可以快速鑒別單倍體種子[118]。然而，基因表達(dá)受供體基因型和環(huán)境的影響。另外，胚和胚乳特異性標(biāo)記的顏色變化范圍難以明確分級(jí)，如果母本中含有抑制表達(dá)的基因如，利用標(biāo)記無(wú)法準(zhǔn)確鑒定單倍體，且不能實(shí)現(xiàn)批量和自動(dòng)化鑒定[119]?；诟哂椭备行?yīng)鑒定玉米單倍體系統(tǒng)克服了花青素基因的局限性。具體來(lái)說(shuō)，高油誘導(dǎo)系與單交種雜交后誘導(dǎo)產(chǎn)生的單倍體油份含量低于單交種，而雜種油份含量介于高油誘導(dǎo)系與單交種之間，與單倍體存在顯著性差異，通過(guò)油份含量可以準(zhǔn)確鑒定單倍體[118]。玉米籽粒油份含量可以通過(guò)快速、準(zhǔn)確的自動(dòng)化核磁共振篩選系統(tǒng)進(jìn)行，具有較強(qiáng)的可操作性[120]。

最近，利用胚特異型啟動(dòng)子和胚乳特異性啟動(dòng)子分別構(gòu)建胚特異表達(dá)綠色熒光蛋白和胚乳特異表達(dá)紅色熒光蛋白的雙熒光單倍體篩選與標(biāo)記鑒定系統(tǒng)，可有效、準(zhǔn)確鑒定玉米單倍體種子，即：用CRISPR/Cas9編輯基因并攜帶雙熒光蛋白標(biāo)記的誘導(dǎo)系做父本與其他玉米品種雜交，單倍體胚乳中顯紅色熒光、胚中沒(méi)有熒光，而二倍體胚乳顯紅色熒光、胚中顯綠色熒光，為作物單倍體鑒定提供了新思路[76]。但是，遺傳標(biāo)記的添加需要借助轉(zhuǎn)基因技術(shù)，操作比較繁瑣。流式細(xì)胞技術(shù)是一種根據(jù)細(xì)胞核DNA含量可快速、準(zhǔn)確判斷植物倍性的方法，已廣泛用于多種作物的單倍體鑒定[74]。

4.5 安全高效單倍體加倍技術(shù)建立和完善

單倍體植株的自然加倍率因物種和所采用的技術(shù)而不同。以小麥為例，花藥培養(yǎng)獲得單倍體植株的自然加倍率為20.0%~30.0%，小孢子培養(yǎng)的自然加倍率為30.0%~40.0%，玉米花粉誘導(dǎo)的單倍體植株完全不能自然加倍，需要用人工方法進(jìn)行染色體加倍。目前，單倍體植株染色體加倍主要采用秋水仙素處理，但秋水仙素存在毒性較強(qiáng)、危及人體健康、污染環(huán)境、用量較大和價(jià)格較高等問(wèn)題，需要尋找安全、低廉和環(huán)境友好型加倍試劑。在加倍方法上，利用最多的是在通氣泵介導(dǎo)的供氧條件下處理單倍體幼苗分蘗節(jié)，然后流水沖洗若干小時(shí)。研究表明，甲基胺草磷、炔苯酰草胺和氟樂(lè)靈等除草劑對(duì)單倍體植株具有加倍效果，利用適宜濃度甲基胺草磷溶液滴心處理三葉期至五葉期源自玉米誘導(dǎo)系誘導(dǎo)的玉米單倍體植株，加倍率20.0%~30.0%。利用適宜濃度秋水仙素溶液涂抹拔節(jié)期源于玉米花粉誘導(dǎo)的小麥單倍體植株的葉片，加倍率7.7%。培養(yǎng)基表面添加不同濃度秋水仙素溶液處理來(lái)自花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)的小麥單倍體植株，加倍率26.7%~85.7%；培養(yǎng)基表面添加不同濃度炔苯酰草胺溶液處理來(lái)自玉米花粉誘導(dǎo)的小麥單倍體植株，加倍率28.6%~ 100.0%。說(shuō)明炔苯酰草胺溶液對(duì)小麥和玉米單倍體植株均有較好加倍效果，可以在其他作物中嘗試；培養(yǎng)基表面添加適宜濃度加倍試劑不但加倍效果明顯，而且簡(jiǎn)單易行。另外，利用植物中存在的自然加倍的遺傳機(jī)制實(shí)現(xiàn)對(duì)人工誘導(dǎo)單倍體植株的自然加倍，也是一個(gè)極具潛力的研究方向。研究表明，小麥單倍體染色體組自然加倍率與未減數(shù)配子形成率呈高度正相關(guān)，并在四倍體小麥–節(jié)節(jié)麥的單倍體群體中檢測(cè)到1個(gè)依賴單倍體、影響未減數(shù)配子形成的主效QTL位點(diǎn)，該位點(diǎn)可能位于基因區(qū)域，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)基因的低表達(dá)可能促進(jìn)小麥單倍體中高頻率未減數(shù)配子發(fā)生[121,122]。所以，利用基因編輯技術(shù)沉默小麥中的基因可能會(huì)提高單倍體植株自然加倍頻率。

盡管單倍體誘導(dǎo)技術(shù)已經(jīng)取得了良好進(jìn)展，但在利用方面依然存在很多挑戰(zhàn)，如單倍體誘導(dǎo)嚴(yán)重受物種和基因型的影響，高粱、大豆等重要經(jīng)濟(jì)作物至今仍然無(wú)法大量獲得單倍體植株。雖然著絲粒介導(dǎo)基因組消失法在理論上可用于誘導(dǎo)所有植物的單倍體，然而目前除了擬南芥外很少有成功的實(shí)例，需要進(jìn)一步研究。另外，利用單倍體器官和組織進(jìn)行的轉(zhuǎn)基因效率還非常低[64]。對(duì)單倍體誘導(dǎo)及胚胎形成的分子遺傳機(jī)制和單倍體基因組自然加倍的遺傳機(jī)理等方面的了解還比較少，尚不清楚玉米體內(nèi)單倍體誘導(dǎo)的機(jī)制是染色體消除還是單一受精。通過(guò)深入了解單倍體誘導(dǎo)過(guò)程，可以改進(jìn)單倍體誘導(dǎo)系統(tǒng)并將單倍體誘導(dǎo)技術(shù)應(yīng)用到重要作物遺傳改良中。

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Development and innovation of haploid induction technologies in plants

Haiqiang Chen1, Huiyun Liu1, Ke Wang1, Shuangxi Zhang2, Xingguo Ye1

Haploid induction is one of the main techniques for breeding new varieties of major crops, and its key steps are improving the haploid induction rate and simplifying the induction procedure. With the development and innovation of plant haploid induction technologies, haploid breeding has been widely used in varietal improvement of important crops, showing the advantages of rapid homozygosity of heterozygous genes, shortening breeding period, and improving breeding efficiency. The combination of haploid breeding with crossing breeding, mutation breeding, reverse breeding, and molecular marker-assisted selection will greatly improve the effectiveness of crop breeding. Haploids and doubled haploids have demonstrated their usefulness in production of genetic populations, characterization of gene functions, and transgenic and cytological studies in plants. In this review, we summarize the progress of haploid induction technologies in view of various haploid induction techniques and applications of haploids and double haploids. In particular, the advances on the haploid induction in several major crops by genome editing were briefly described. Finally, we discuss current issues and future perspectives in this field, so as to promote the application of the haploid induction techniques, especially the techniques of creating haploid inducer lines by genome editing in crop breeding.

haploid induction; androgenesis; gynogenesis; haploid inducer

2020-02-07;

2020-04-22

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2016YFD0102001)和寧夏回族自治區(qū)重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2019BBF02020)資助[Supported by the National Key Research and Development Program of China (No. 2016YFD0102001) , and the Key Research and Development Program of Ningxia in China (No. 019BBF02020)]

陳海強(qiáng)，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：小麥分子育種。E-mail: Haiqiang_Chen@163.com

葉興國(guó)，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：小麥細(xì)胞工程和基因工程育種。E-mail: yexingguo@caas.cn

10.16288/j.yczz.20-033

2020/5/8 10:10:39

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20200507.1732.006.html

(責(zé)任編委: 嚴(yán)建兵)