鄭帥龍，李利，張紅平

綜 述

環(huán)狀RNA翻譯能力研究進(jìn)展

鄭帥龍，李利，張紅平

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物遺傳育種研究所，成都 611130

隨著高通量測(cè)序技術(shù)和翻譯組學(xué)研究的快速發(fā)展，對(duì)環(huán)狀RNA (circular RNA, circRNA)翻譯能力的研究日益成為熱點(diǎn)。已有研究表明，circRNA自身可以翻譯為蛋白，其蛋白功能與人類疾病發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系，而且其有望成為mRNA的理想替代品，未來(lái)可被廣泛地應(yīng)用在蛋白質(zhì)工程。本文系統(tǒng)綜述了circRNA來(lái)源、形成方式和主要特征、翻譯蛋白的方式、翻譯能力的鑒定和功能驗(yàn)證，歸納了近年來(lái)circRNA翻譯在人類疾病中的研究進(jìn)展及其在蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用，并對(duì)后續(xù)研究關(guān)注的問(wèn)題進(jìn)行了展望，以期為相關(guān)領(lǐng)域的研究提供參考。

環(huán)狀RNA；蛋白翻譯；鑒定方法

環(huán)狀RNA(circular RNA)是一類不具有5?端m7G帽和3?端poly(A)尾、以共價(jià)鍵首尾連接的環(huán)形RNA。20世紀(jì)70年代，研究者首次在馬鈴薯()塊莖類病毒中發(fā)現(xiàn)了circRNA[1]，隨后在四膜蟲(chóng)()、古細(xì)菌()、人類()、小鼠()和大鼠()等物種中也相繼發(fā)現(xiàn)了circRNA[2~6]。circRNA由于其在組織中表達(dá)量低，起初認(rèn)為是RNA錯(cuò)誤剪切產(chǎn)生的副產(chǎn)物，沒(méi)有引起足夠重視。但隨著circRNA相關(guān)研究深入開(kāi)展，人們發(fā)現(xiàn)circRNA在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用，比如circRNA自身可以翻譯為蛋白。1986年，Kos等[7]首次發(fā)現(xiàn)肝炎病毒(hepatitis virus)中的circRNA可以翻譯為122個(gè)氨基酸的多肽。隨后，人工構(gòu)建的外源circRNA分別在大腸桿菌()、兔()網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液和果蠅() S2細(xì)胞中成功地表達(dá)出蛋白[8~10]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)源性circRNA也可以在一些翻譯起始因子的作用下招募核糖體翻譯蛋白，并且蛋白產(chǎn)物功能與人類疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系[11~14]。自此，circRNA翻譯能力的研究迅速成為了焦點(diǎn)。本文結(jié)合國(guó)內(nèi)外circRNA翻譯能力的最新研究，對(duì)circRNA的翻譯方式、翻譯能力的鑒定和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法等進(jìn)行了系統(tǒng)總結(jié)，旨在為深入揭示circRNA的作用機(jī)制提供參考。

1 circRNA概述

1.1 circRNA來(lái)源、環(huán)化方式和主要特征

circRNA由pre-mRNA經(jīng)可變剪切(alternative splicing, AS)后產(chǎn)生，AS事件主要包括外顯子跳躍(exon skipping, ES)、3?端可變剪切(alternative 3? splicing site, A3SS)、5?端可變剪切(alternative 5? splicing site, A5SS)和內(nèi)含子保留(intron retention, IR)等。AS后生成的circRNA由于ICFs(intronic circRNA fragments)的不同，可分為由外顯子形成的exon circ-RNA、由內(nèi)含子形成的ciRNA (circular intronic RNA)和由外顯子與內(nèi)含子共同形成的EIciRNA (exon- intron circRNA)[15]。circRNA的環(huán)化方式主要有套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化、內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)環(huán)化和RNA結(jié)合蛋白驅(qū)動(dòng)環(huán)化3種(圖1)[16~18]。circRNA呈共價(jià)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在生物體內(nèi)非常穩(wěn)定，不易被RNase R (ribonuclease R)降解[19]，Jeck等[20]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)由外顯子環(huán)化生成的circRNA的半衰期超過(guò)48 h。circRNA在不同的物種間具有保守性，Ven?等[21]研究發(fā)現(xiàn)小鼠大腦中有15%~20%的circRNA的剪切位點(diǎn)與豬腦中circ-RNA的剪切位點(diǎn)高度保守。circRNA表達(dá)具有組織特異性和時(shí)空特異性，在人、小鼠和豬的不同組織中，皮質(zhì)和小腦中circRNA的水平最高；在豬胚胎發(fā)育過(guò)程中，豬大腦中circRNA的表達(dá)水平呈動(dòng)態(tài)變化，60天時(shí)表達(dá)量最高[21~24]。

1.2 circRNA作用機(jī)制

circRNA在生物體內(nèi)表達(dá)量很低，其主要在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平等多個(gè)層面調(diào)控機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞凋亡和疾病的發(fā)生等過(guò)程。其主要的作用機(jī)制有：(1) circRNA的形成會(huì)影響其同源線性轉(zhuǎn)錄本的生成，環(huán)化生成的circRNA越多，其同源線性轉(zhuǎn)錄本生成量就越少(圖2A)[24]。(2)調(diào)控親本基因的表達(dá)。EIciRNA與U1小核糖核蛋白形成復(fù)合體作用于其親本基因啟動(dòng)子區(qū)，和RNA poly-merase II發(fā)生相互作用，促進(jìn)親本基因表達(dá)(圖2B)[25]。(3)調(diào)節(jié)其同源線性轉(zhuǎn)錄本的剪切。擬南芥SEP3基因轉(zhuǎn)錄生成的circSEP3，可與SEP3基因強(qiáng)烈結(jié)合，形成RNA:DNA雜合體，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄暫停，影響線性轉(zhuǎn)錄本的生成(圖2C)[26]。(4)充當(dāng)miRNA 分子海綿，調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。如CDR1as可競(jìng)爭(zhēng)miR-7靶向位點(diǎn)，作為miR-7的分子海綿參與基因表達(dá)調(diào)控；circFGFR4在牛成肌細(xì)胞中可以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-107，促進(jìn)成肌細(xì)胞分化(圖2D)[27,28]。(5) circRNA可以結(jié)合相應(yīng)的蛋白，通過(guò)調(diào)控蛋白對(duì)下游靶基因的作用來(lái)發(fā)揮作用(圖 2E)[29]。(6) circ-RNA自身可以翻譯為蛋白(圖2F)[11~14]。(7) circRNA發(fā)揮假基因效應(yīng)。可以反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，cDNA可以進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，破壞基因組DNA的完整性(圖2G)[30]。(8) circRNA可以作為生物標(biāo)志物，診斷早期癌癥(圖2H)[31]。

2 circRNA翻譯方式

真核生物mRNA的翻譯依賴于m7G帽結(jié)構(gòu)的核糖體掃描機(jī)制(m7G cap-dependent scanning mecha-nism)，其過(guò)程主要包括43S前起始復(fù)合物的組裝、43S前起始復(fù)合物與mRNA 5?末端m7G帽的結(jié)合、起始密碼子的選擇、60S核糖體亞基的加入和80S亞基的形成等[32]。而circRNA由于其共價(jià)環(huán)狀結(jié)構(gòu)[33]，不能通過(guò)上述機(jī)制翻譯蛋白，需要依賴一些翻譯啟動(dòng)元件的參與啟動(dòng)翻譯。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的circRNA的翻譯方式主要有核糖體介入位點(diǎn)(internal ribosome entry site，IRES)介導(dǎo)的翻譯、滾環(huán)擴(kuò)增翻譯、由UTR (untranslated region)翻譯激活元件介導(dǎo)的翻譯和m6A修飾介導(dǎo)的翻譯。

圖1 circRNA的環(huán)化方式

A：套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化。當(dāng)mRNA前體(pre-mRNA)進(jìn)行GU/AG剪切時(shí)，可以跨外顯子進(jìn)行剪切，形成含有外顯子和內(nèi)含子的套索中間體，然后加工形成circRNA。B：內(nèi)含子套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化。一些內(nèi)含子的5?端附近含有7 nt的GU富集序列，3?端附近含有11 nt的C富集序列，它們可以在RNA polymerase II作用下形成一個(gè)套索內(nèi)含子，進(jìn)一步剪切形成ciRNA。C：內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)環(huán)化。某些外顯子兩側(cè)的內(nèi)含子序列中含有反向互補(bǔ)序列，如RCMs (reverse complementary matches)、ICSs (intronic complementary sequences)及Alu元件，它們之間互補(bǔ)配對(duì)形成RNA雙鏈，促進(jìn)circRNA的形成。D：RNA結(jié)合蛋白驅(qū)動(dòng)環(huán)化。一些RNA結(jié)合蛋白可以結(jié)合到外顯子側(cè)翼的內(nèi)含子序列上，促進(jìn)circRNA的形成。

2.1 核糖體介入位點(diǎn)介導(dǎo)的翻譯

IRES是circRNA起始密碼子ATG上游的一段長(zhǎng)度150~250 bp的序列，能夠折疊成類似tRNA的結(jié)構(gòu)，可以被eIF4G2 (eukaryotic initiation factor 4G2)識(shí)別，驅(qū)動(dòng)cirRNA翻譯蛋白(圖3A)。1995年，Chen等[8]將含有IRES的circRNA轉(zhuǎn)入兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液中，檢測(cè)到了其翻譯產(chǎn)物。Perriman等[9]將含有GFP (green fluorescent protein)標(biāo)簽序列和IRES的circRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)大腸桿菌后，檢測(cè)到了完整的GFP蛋白。2015年，Wang等[10]將人工構(gòu)建的迷你基因(minigene)轉(zhuǎn)染進(jìn)果蠅S2細(xì)胞內(nèi)，其轉(zhuǎn)錄本可以在細(xì)胞內(nèi)自我環(huán)化形成帶有GFP標(biāo)簽序列和IRES的circRNA，該circRNA成功地表達(dá)出了GFP蛋白。

圖2 circRNA的作用機(jī)制

A：circRNA的形成會(huì)影響其同源線性轉(zhuǎn)錄本的生成；B：可調(diào)控親本基因的表達(dá)；C：調(diào)節(jié)其同源線性轉(zhuǎn)錄本的剪切；D：充當(dāng)miRNA的分子海綿；E：充當(dāng)RNA結(jié)合蛋白的分子海綿；F：可以翻譯蛋白或多肽；G：衍生假基因；H：可以作為生物標(biāo)記物。

圖3 circRNA的翻譯方式

A：核糖體介入位點(diǎn)介導(dǎo)circRNA翻譯；B：滾環(huán)擴(kuò)增翻譯；C：UTR翻譯激活元件介導(dǎo)circRNA翻譯；D：m6A修飾介導(dǎo)circRNA 翻譯。

2.2 滾環(huán)擴(kuò)增翻譯

DNA滾環(huán)擴(kuò)增(rolling circle amplification, RCA)是噬菌體感染病毒后進(jìn)行自我復(fù)制的一種方式，可以對(duì)環(huán)狀DNA分子進(jìn)行無(wú)限單鏈擴(kuò)增。部分circ-RNA由于缺失終止密碼子，導(dǎo)致其具有無(wú)限開(kāi)放閱讀框，可以像RCA一樣滾環(huán)翻譯蛋白(圖3B)。Perriman等[9]構(gòu)建了一種含有無(wú)限閱讀框的circ-RNA，發(fā)現(xiàn)其能模擬RCA在大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行翻譯，且產(chǎn)物分子量是其同源線性mRNA的100倍。Abe等[34]將含有無(wú)限閱讀框的circRNA轉(zhuǎn)入兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液中，發(fā)現(xiàn)其也可以進(jìn)行翻譯。

2.3 由UTR翻譯激活元件介導(dǎo)的翻譯

部分circRNA由pre-mRNA反向剪切時(shí)，其剪切位點(diǎn)位于UTR區(qū)，導(dǎo)致生成的circRNA與其線性同源轉(zhuǎn)錄本具有部分相同的UTR序列，UTR可募集核糖體，驅(qū)動(dòng)circRNA翻譯蛋白(圖3C)。4EBP (eukaryotic initiation factor 4E binding protein)可與翻譯起始因子eIF4E (eukaryotic initiation factor 4E)結(jié)合，阻止了翻譯起始復(fù)合物eIF4F(eukaryotic initia-tion factor 4F)的形成，抑制mRNA的翻譯[35]。Pamu-durti等[11]發(fā)現(xiàn)果蠅大腦中部分circRNA的UTR區(qū)結(jié)合有核糖體，并且檢測(cè)到了生成的蛋白產(chǎn)物，為排除同源線性mRNA翻譯干擾，過(guò)表達(dá)4EBP抑制線性mRNA翻譯，發(fā)現(xiàn)circRNA的蛋白生成量未受影響，表明circRNA可由UTR驅(qū)動(dòng)進(jìn)行翻譯。

2.4 m6A修飾介導(dǎo)的翻譯

RNA甲基化修飾約占所有RNA修飾的60%以上，N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine, m6A)是RNA甲基化的一種，其通常發(fā)生在RRm6ACH (R = G或A; H = A, C或U)基序的A堿基上。m6A修飾同時(shí)受到甲基轉(zhuǎn)移酶(METTL3、METTL4和WTAP等)、去甲基化酶(FTO和ALKBH5等)和一些m6A修飾結(jié)合蛋白閱讀器(YTHDF1/2/3和ELAVL1等)的共同調(diào)控。Yang等[13]發(fā)現(xiàn)一些circRNA的UTR存在保守的m6A基序，其經(jīng)甲基轉(zhuǎn)移酶修飾后可以被YTHDF3蛋白識(shí)別，隨后YTHDF3蛋白與翻譯起始因子eIF4G2結(jié)合，eIF4G2招募翻譯起始因子eIF4A (eukaryotic initiation factor 4A)和eIF4B (eukaryotic initiation factor 4B)組成翻譯起始復(fù)合物eIF4 (eukaryotic initiation complex 4)，啟動(dòng)circRNA翻譯(圖3D)。2019年，Zhao等[36]在被HPV16 (human papillomavirus 16)病毒感染的組織中發(fā)現(xiàn)了表達(dá)異常的circE7，其經(jīng)m6A修飾后可以翻譯E7蛋白，E7蛋白可以促進(jìn)人乳頭瘤細(xì)胞的增殖。

3 circRNA翻譯能力的鑒定與功能驗(yàn)證

3.1 circRNA翻譯能力鑒定的方法和工具

近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序和生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，在不同物種的組織和細(xì)胞中鑒定出了大量的circRNAs。但是，以往絕大多數(shù)circRNA鑒別方法僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)BSJ (back-spliced junction)的預(yù)測(cè)，無(wú)法對(duì)circRNA轉(zhuǎn)錄本全長(zhǎng)進(jìn)行預(yù)測(cè)和重建，導(dǎo)致絕大部分鑒定出的circRNA仍然缺乏全長(zhǎng)序列信息，給具有潛在翻譯能力的circRNA的篩選造成了障礙?；谝陨蠁?wèn)題，Gao等[15]開(kāi)發(fā)了CIRI-AS工具，實(shí)現(xiàn)了對(duì)個(gè)體內(nèi)AS事件的高效檢測(cè)，可以對(duì)具有相同BSJ的circRNAs的ICF進(jìn)行預(yù)測(cè)，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對(duì)circRNA全長(zhǎng)的重建提供了可能。隨后，其團(tuán)隊(duì)發(fā)布了CIRI-full方法，根據(jù)circRNA的識(shí)別特征—反向重疊區(qū)(reverse overlap)實(shí)現(xiàn)了對(duì)circRNA全長(zhǎng)序列的重建和相對(duì)豐度的預(yù)測(cè)[37]。最近，其團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了CIRIquant工具，實(shí)現(xiàn)了在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中對(duì)circ-RNA的準(zhǔn)確識(shí)別和定量，對(duì)環(huán)狀RNA差異表達(dá)分析方法進(jìn)行了改進(jìn)，并提供了高效的分析流程[38]。這3個(gè)分析工具從根本上解決了在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中對(duì)circRNA精確識(shí)別、全長(zhǎng)預(yù)測(cè)和重建的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了circRNA保守性和表達(dá)差異的高效分析，為后續(xù)具有潛在翻譯能力的circRNA的準(zhǔn)確篩選提供了可能。

circRNA必須具備開(kāi)放閱讀框以及一些翻譯調(diào)控元件才可以啟動(dòng)翻譯，獲得具有全長(zhǎng)序列信息的circRNA后，需要利用生物信息學(xué)工具(表1)對(duì)其翻譯能力進(jìn)行多方面預(yù)測(cè)：(1) ORF (open reading frame)預(yù)測(cè)。ORFfinder可以對(duì)circRNA序列進(jìn)行搜索，列出所有潛在的ORFs，并可以推導(dǎo)出其氨基酸序列。通常篩選含有跨越剪切位點(diǎn)的ORF的circRNA，因?yàn)榫哂锌缂羟形稽c(diǎn)ORF的circRNA與其同源線性轉(zhuǎn)錄本具有編碼序列差異，便于后期的驗(yàn)證[39]。(2) circRNA翻譯能力的評(píng)估。CPC2和CPAT可根據(jù)序列特征從大量候選轉(zhuǎn)錄本中快速識(shí)別編碼和非編碼轉(zhuǎn)錄本，對(duì)circRNA翻譯潛力進(jìn)行評(píng)估[40,41]；它們預(yù)測(cè)的分值越接近1，則表明circ-RNA翻譯蛋白的可能性越大，通常綜合兩者預(yù)測(cè)結(jié)果確定候選circRNA。(3) circRNA翻譯啟動(dòng)方式預(yù)測(cè)。circRNA大部分由IRES或經(jīng)m6A修飾后啟動(dòng)翻譯，因此需要預(yù)測(cè)circRNA序列是否含有IRES或m6A基序。IRESite對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道和實(shí)驗(yàn)證實(shí)的IRES進(jìn)行了匯總，當(dāng)輸入circRNA序列后，IRESite可以對(duì)circRNA上所有潛在的IRES進(jìn)行評(píng)分并給出其在序列上的相應(yīng)位置。IRESfinder基于k-mer特征識(shí)別真核細(xì)胞中RNA序列上的IRES，相比于IRESite有著較高的精確性[42,43]，SRAMP軟件可基于序列特征對(duì)哺乳動(dòng)物中circRNA的m6A基序進(jìn)行預(yù)測(cè)[44]，m6Apred軟件可對(duì)釀酒酵母()中circRNA的m6A基序進(jìn)行預(yù)測(cè)[45]。(4)蛋白產(chǎn)物功能預(yù)測(cè)。pfam 32.0可用于蛋白功能預(yù)測(cè)，將circRNA的ORF理論產(chǎn)物序列輸入pfam 32.0數(shù)據(jù)庫(kù)后，數(shù)據(jù)庫(kù)可根據(jù)序列同源性檢索其潛在蛋白結(jié)構(gòu)域，預(yù)測(cè)蛋白功能[46]。

表1 研究circRNA翻譯能力常用的預(yù)測(cè)工具

借助計(jì)算機(jī)科學(xué)、深度測(cè)序和生物信息學(xué)分析，研究人員研發(fā)了多個(gè)人性化、可視化的circRNA數(shù)據(jù)庫(kù)(表2)。它們將多個(gè)物種的circRNA的序列、可變剪切的方式、亞細(xì)胞定位、甲基化修飾和編碼能力等信息進(jìn)行了匯總。2016年，Chen等[48]開(kāi)發(fā)了circRNAdb數(shù)據(jù)庫(kù)，其是首個(gè)匯總?cè)祟惪删幋a蛋白的circRNA信息的數(shù)據(jù)庫(kù)，可以根據(jù)基因名稱查詢相應(yīng)circRNA的ORF、蛋白特征、外顯子數(shù)目、IRES和m6A基序等信息。但是，幾大數(shù)據(jù)庫(kù)也存在一些不足，需要進(jìn)一步完善，比如各數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)circ-RNA沒(méi)有進(jìn)行統(tǒng)一命名，不便于跨數(shù)據(jù)庫(kù)查詢circRNA信息，各數(shù)據(jù)庫(kù)具有物種局限性，對(duì)非模式生物的circRNA信息收錄很少。

3.2 circRNA翻譯能力的功能驗(yàn)證

利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)工具對(duì)circRNA序列進(jìn)行預(yù)測(cè)分析后，需要從多方面對(duì)circRNA翻譯能力進(jìn)行功能驗(yàn)證：(1)核糖體印記與深度測(cè)序技術(shù)篩選結(jié)合有核糖體的circRNA。被核糖體包裹的RNA片段不易被Rnase降解，對(duì)該部分片段進(jìn)行測(cè)序后，利用CircCode將片段序列信息與circRNA序列信息進(jìn)行比對(duì)，篩選出結(jié)合有核糖體的circRNA[59,60]。 (2)體外circRNA的ORF翻譯能力驗(yàn)證。構(gòu)建含有circRNA的ORF和Flag標(biāo)簽的載體，將載體轉(zhuǎn)入體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)，利用Flag抗體檢測(cè)有無(wú)Flag融合蛋白生成，驗(yàn)證ORF是否可以在體外編碼。 (3)細(xì)胞內(nèi)circRNA的翻譯能力驗(yàn)證。在circRNA的ORF終止密碼子前插入Flag標(biāo)簽，構(gòu)建含有Flag標(biāo)簽的circRNA過(guò)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，利用Flag抗體檢測(cè)有無(wú)融合蛋白的生成或利用抗Flag標(biāo)簽蛋白的免疫熒光探針進(jìn)行檢測(cè)。(4)根據(jù)ORF理論蛋白產(chǎn)物序列設(shè)計(jì)特異性抗體，通過(guò)免疫組化或Western Blot進(jìn)一步檢測(cè)circRNA是否在體內(nèi)進(jìn)行翻譯，后續(xù)通過(guò)免疫沉淀并結(jié)合質(zhì)譜分析驗(yàn)證產(chǎn)物序列是否與理論蛋白序列一致[12,61]。(5)驗(yàn)證circRNA與翻譯起始因子的相互作用。利用RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀 (RNA binding protein immunoprecipitation, RIP)和蛋白質(zhì)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)(RNA pull-down)雙向驗(yàn)證circ-RNA與IRES介導(dǎo)翻譯相關(guān)的eIF4G2和ITAF(IRES trans-acting factors)的相互作用或與m6A介導(dǎo)翻譯相關(guān)的YTHDF1/2/3的相互作用[62,63]。(6)驗(yàn)證特定刺激或蛋白對(duì)circRNA翻譯的影響，例如對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熱應(yīng)激或饑餓處理，以及對(duì)eIF4E、4E-BP、FOXO (forkhead box O)、FTO (fat mass and obesity associated)和METTL3/14等蛋白進(jìn)行過(guò)表達(dá)或敲低處理，檢測(cè)circRNA的蛋白產(chǎn)物是否受到影響[11~14]。circRNA翻譯功能驗(yàn)證中常用的實(shí)驗(yàn)方法如表3。

表2 研究circRNA翻譯能力常用的數(shù)據(jù)庫(kù)

4 circRNA翻譯在人類疾病領(lǐng)域研究進(jìn)展

近年來(lái)，關(guān)于circRNA翻譯能力研究的報(bào)道較多，大部分報(bào)道集中在癌癥腫瘤領(lǐng)域，人們發(fā)現(xiàn)circRNA翻譯的蛋白可以影響腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。circFBXW7在惡性膠質(zhì)瘤中高度表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)circFBXW7可以被IRES介導(dǎo)翻譯FBXW7- 185aa蛋白，F(xiàn)BXW7-185aa協(xié)同母基因編碼的FBXW7蛋白調(diào)控原癌基因C-Myc蛋白的穩(wěn)定性，抑制惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)生[14]。長(zhǎng)非編碼RNA lincPINT的第2外顯子通過(guò)自身環(huán)化形成了circPINT，其序列上的IRES可驅(qū)動(dòng)其翻譯PINT-87aa蛋白，PINT- 87aa蛋白結(jié)合聚合酶相關(guān)因子復(fù)合物PAF1，抑制多種致癌基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)生[64]。來(lái)自致癌基因的circβ-catenin，可以由IRES介導(dǎo)翻譯β-catenin-370aa蛋白，β-catenin-370aa蛋白競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合GSK3β蛋白，避免了β-catenin蛋白與GSK3β蛋白結(jié)合引起的磷酸化后泛素裂解反應(yīng)的發(fā)生，導(dǎo)致β-catenin蛋白持續(xù)激活Wnt/β-catenin通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖和轉(zhuǎn)移[65]；circGprc5a可以翻譯circGprc5a-peptide，促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[66]。此外，還有一些circRNA的蛋白產(chǎn)物也參與某些腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程(表4)。

除癌癥腫瘤外，研究者對(duì)杜氏型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(duchenne muscular dystrophy, DMD)和擴(kuò)張型心肌病(dilated cardiomyopathy, DCM)等疾病研究時(shí)也有很多發(fā)現(xiàn)。circZNF609在DMD組織中表達(dá)量升高，其是由ZNF609基因的第二外顯子獨(dú)自環(huán)化形成，參與調(diào)節(jié)肌細(xì)胞增殖，circ-ZNF609可由IRES驅(qū)動(dòng)翻譯蛋白，但其蛋白產(chǎn)物的詳細(xì)功能機(jī)制仍然未知[12]。Van Heesch等[67]在患有DCM的人心肌組織中發(fā)現(xiàn)多個(gè)circRNA表達(dá)量異常，通過(guò)核糖體印記與深度測(cè)序技術(shù)并結(jié)合質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其中6個(gè)circRNA可以進(jìn)行翻譯，包括CDR1as、circANKH、circASXL1、circCSNK1G3、circKIAA1429和circSIPA1L1，為后續(xù)科學(xué)研究提供了非常有價(jià)值的信息。

表3 研究circRNA翻譯常用的實(shí)驗(yàn)方法

表4 circRNA翻譯在人類疾病中的研究進(jìn)展

5 circRNA翻譯在蛋白質(zhì)工程中的應(yīng)用

已有大量研究發(fā)現(xiàn)真核細(xì)胞內(nèi)源性circRNA具有許多生物學(xué)功能，部分circRNA來(lái)源于外顯子，通過(guò)可變剪切機(jī)制產(chǎn)生，具有編碼蛋白的功能[11~14]。相比于線性mRNA，內(nèi)源性circRNA缺乏核酸外切酶介導(dǎo)降解的游離末端，可以抵抗RNA酶降解。Wesselhoeft等[69]通過(guò)設(shè)計(jì)同源互補(bǔ)序列輔助剪切，有效地環(huán)化長(zhǎng)達(dá)5 kb的pre-mRNA，延長(zhǎng)了mRNA的蛋白表達(dá)的持續(xù)時(shí)間，經(jīng)過(guò)高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)純化后翻譯出了數(shù)量多、活性高和穩(wěn)定性強(qiáng)的蛋白質(zhì)。該研究首次在真核細(xì)胞中利用由外源mRNA環(huán)化產(chǎn)生的circRNA翻譯蛋白，意味著未來(lái)circRNA有望成為線性mRNA的理想替代品，對(duì)于蛋白質(zhì)工程的發(fā)展具有重要意義。

自然界中存在很多RNA病毒，機(jī)體為有效抵御這些病毒的感染，進(jìn)化出了復(fù)雜的免疫系統(tǒng)，其中識(shí)別外源RNA分子的受體是激活相關(guān)免疫機(jī)制的觸發(fā)器。已知生物體內(nèi)RNA識(shí)別受體主要有RIG-I (retinoic acid–inducible protein I)、TLR-3 (toll-like receptor 3)、TLR-7 (toll-like receptor 7)和TLR-8 (toll-like receptor 8)等分子，它們可以識(shí)別不同的RNA及其降解產(chǎn)物。以往利用外源mRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)蛋白時(shí)，需要對(duì)RNA進(jìn)行假尿苷修飾(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和N5-甲氧基-尿苷修飾(5moU)等修飾，降低這些RNA感受器分子介導(dǎo)的免疫效應(yīng)。Wesselhoeft等[70]將mRNA環(huán)化成circRNA后，注射入小鼠后不會(huì)被TLR3/7/8識(shí)別，避免誘發(fā)TLR/ RIG-I介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，可以在小鼠組織中高效地翻譯蛋白，不需要再對(duì)mRNA進(jìn)行復(fù)雜修飾，為circRNA應(yīng)用于蛋白質(zhì)工程提供了新的依據(jù)。

6 結(jié)語(yǔ)與展望

受益于高通量測(cè)序和翻譯組學(xué)的不斷發(fā)展與運(yùn)用，circRNA翻譯研究近年來(lái)取得了一定的進(jìn)展。目前已完成了對(duì)翻譯啟動(dòng)方式的初步解析并開(kāi)展了蛋白產(chǎn)物功能研究，形成了生物信息學(xué)、翻譯組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)相結(jié)合的研究體系。醫(yī)學(xué)上，人們發(fā)現(xiàn)circRNA的蛋白產(chǎn)物與人類疾病有著密切的聯(lián)系，比如許多惡性腫瘤單靠傳統(tǒng)的化療沒(méi)有很好的治療效果，而circRNA翻譯的蛋白對(duì)部分腫瘤有著顯著的抑制作用，未來(lái)可以根據(jù)此特點(diǎn)開(kāi)發(fā)新的癌癥治療途徑。蛋白質(zhì)工程中，研究人員已利用由外源線性mRNA環(huán)化生成的circRNA在生物體內(nèi)高效地生產(chǎn)活性蛋白，但現(xiàn)有的純化方式不能獲得高純度的circRNA，未來(lái)若廣泛投入實(shí)際生產(chǎn)，需要進(jìn)一步改進(jìn)純化方式，提高其純度。

當(dāng)然，目前circRNA翻譯能力的研究仍然不夠成熟，還有很多問(wèn)題急待解決。比如：(1) circRNA是否存在其他的翻譯方式，仍然是科學(xué)家們未來(lái)持續(xù)研究的問(wèn)題；(2) circRNA蛋白產(chǎn)物的詳細(xì)功能機(jī)制仍待進(jìn)一步探究，需要結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)，探究其蛋白產(chǎn)物的詳細(xì)功能機(jī)制；(3)非模式生物circRNA缺乏相應(yīng)注釋信息，未來(lái)需加快對(duì)非模式生物circRNA的信息注釋并開(kāi)發(fā)相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行系統(tǒng)收錄；(4)生物信息學(xué)工具仍需進(jìn)一步完善，目前預(yù)測(cè)工具的算法存在一定的局限性，預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性仍待提高；(5)相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)和設(shè)備仍待改進(jìn)，比如核糖體圖譜與深度測(cè)序不夠成熟，質(zhì)譜檢測(cè)不能檢測(cè)10 kDa以下的小肽，造成某些circRNA翻譯產(chǎn)物無(wú)法被檢測(cè)，給circRNA翻譯能力研究帶來(lái)了障礙。

總之，circRNA翻譯能力研究開(kāi)啟了circRNA研究領(lǐng)域的新篇章，未來(lái)隨著研究的不斷深入，將會(huì)推動(dòng)生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)和蛋白質(zhì)工程多領(lǐng)域發(fā)展。

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Progress on translation ability of circular RNA

Shuailong Zheng, Li Li, Hongping Zhang

With the rapid development of high-throughput sequencing technology and translatome studies, the translational ability of circular RNA (circRNA) has gradually attracted much attention. Previous studies have shown that circRNA itself can be translated into proteins, whose function is closely related to the occurrence and development of human diseases. And it is expected to become an ideal substitute for mRNA, which can be widely used in protein engineering in the future. In this review, we systematically summarize the sources, biogenesis and features of circRNA, the driving models of circRNA translation,identification and functional verification of circRNA translation. We also sum up the latest research progress of circRNA translation in human diseases and its application in protein engineering, and make prospective anticipations for future research directions, which may offer more theoretical references for related researches in this field.

circular RNA; protein translation; identification methods

2020-01-07;

2020-03-24

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：31772578，31672402)和四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2016NYZ0045)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 31772578,31672402), and the Science and Technology Program of Sichuan Province (No. 2016NYZ0045)]

鄭帥龍，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：動(dòng)物遺傳育種。E-mail: 382581626@qq.com

李利，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：動(dòng)物遺傳育種。E-mail: lily@sicau.edu.cn張紅平，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：動(dòng)物遺傳育種。E-mail: zhp@sicau.edu.cn

10.16288/j.yczz.19-354

2020/4/2 13:18:10

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20200402.1034.003.html

(責(zé)任編委: 趙方慶)