王晉晨，熊曉星

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)外科，武漢 430060)

缺血性腦卒中是指腦部的供血動脈(頸動脈和椎動脈)狹窄或閉塞、腦供血不足，從而導(dǎo)致腦組織缺血壞死的一類疾病。我國的腦卒中發(fā)病率呈逐漸升高趨勢，缺血性腦卒中在臨床具有發(fā)生率高、死亡率高、致殘率高等特點，對人們的身體健康造成極大威脅[1]。神經(jīng)細(xì)胞對于缺血缺氧損傷耐受性差，其在缺血性腦卒中發(fā)生后的數(shù)分鐘內(nèi)可產(chǎn)生嚴(yán)重病變。同時腦卒中的情況又十分復(fù)雜，腦缺血時間及嚴(yán)重程度等對腦卒中的預(yù)后均會產(chǎn)生不同影響。因此，建立動物或細(xì)胞模型，進(jìn)而為腦卒中的治療提供可能非常重要。一個好的腦卒中動物模型應(yīng)當(dāng)具備：①能夠控制缺血的時間、部位、程度；②與腦卒中相關(guān)的因素，如血壓、血氣、體溫、血糖等可以被控制；③避免其他疾病與腦血管解剖差異對實驗結(jié)果的影響。缺血性腦卒中模型經(jīng)過多年的發(fā)展，已建立了多種成熟的模型，體內(nèi)模型包括線栓模型、開顱電凝模型、光化學(xué)栓塞模型等，體外模型包括氧糖剝奪模型及器官型腦切片，這些模型為腦卒中的發(fā)病機制研究提供了基礎(chǔ)。每種動物模型均有其優(yōu)缺點，現(xiàn)就缺血性腦卒中動物模型研究進(jìn)展予以綜述。

1 缺血性腦卒中模型面臨的共同問題

1.1表觀遺傳差異 有證據(jù)表明，將動物實驗的結(jié)果應(yīng)用于人類時，不同物種之間的表觀遺傳差異有重要影響。通過對小鼠和人類包括大腦在內(nèi)的15個組織進(jìn)行RNA測序并比較其表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，同一物種不同組織中多組基因的表達(dá)存在顯著差異[2]。相關(guān)的表觀遺傳蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)一步驗證了這些發(fā)現(xiàn)。在嚙齒類動物與人類之間，趨化因子的表達(dá)和進(jìn)行氧糖剝奪后神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)均存在顯著差異[3]。另有研究表明，小鼠腦卒中后的趨化因子反應(yīng)與缺血性腦卒中患者的尸檢結(jié)果比較存在顯著差異[4]。近年來，腸道菌群對身體的影響越來越受關(guān)注，考慮到不同飼養(yǎng)環(huán)境下小鼠的糞便微生物群已存在顯著差異，故其對包括腦卒中在內(nèi)的各種疾病的研究可能產(chǎn)生巨大影響[5]。

1.2腦解剖和功能組織的差異 人類與其他物種的大腦解剖結(jié)果存在明顯的宏觀差異。腦卒中動物模型多使用無腦回動物。不同部位的解剖及功能差異不同，梗死后表現(xiàn)也不盡相同。動物模型的梗死面積并不能充分反映人類的腦卒中情況。腦梗死發(fā)生的部位不同，所產(chǎn)生的臨床癥狀及其相應(yīng)的預(yù)后也不同。同時，嚙齒類動物的腦白質(zhì)比例遠(yuǎn)低于人類，人類大腦中腦白質(zhì)約占60%，犬約占35%，兔子約占20%，大鼠約占15%，小鼠僅占10%[6]。研究表明，遠(yuǎn)端腦白質(zhì)的完整性與大腦長期認(rèn)知結(jié)果有顯著聯(lián)系[7]。在腔隙性腦梗死中，腦白質(zhì)損傷起非常重要的作用。人類大腦的左右腦存在差異，左腦多負(fù)責(zé)計算及認(rèn)知，而右腦負(fù)責(zé)情感及記憶。在嚙齒類動物中，雙側(cè)大腦中動脈閉塞所產(chǎn)生的癥狀不相同，右側(cè)大腦中動脈閉塞的大鼠可表現(xiàn)為短暫的亢進(jìn)，而左側(cè)大腦中閉塞后未見這種表現(xiàn)[8]。

1.3血管解剖差異 為了保護(hù)人類大腦免受血供變化的影響，在漫長的進(jìn)化過程中人體產(chǎn)生了多種保護(hù)措施。首先是在入顱之前，頸總動脈可分為頸外動脈與頸內(nèi)動脈。然后，位于大腦底部的Willis環(huán)連接前后循環(huán)及左右半球，當(dāng)一側(cè)動脈閉塞時，Willis環(huán)可改變血流方向。最后復(fù)雜的側(cè)支循環(huán)系統(tǒng)會盡力保護(hù)腦皮質(zhì)的供血[9]。在功能水平下，機體可通過血管收縮因子調(diào)節(jié)腦動脈的阻力，從而實現(xiàn)對腦灌注的調(diào)節(jié)。神經(jīng)元的活動與腦灌注水平密切相關(guān)，這種現(xiàn)象被稱為神經(jīng)血管耦合[10]。血管的結(jié)構(gòu)及功能不同，腦卒中后腦組織的損傷也不同，且物種間的差異將導(dǎo)致缺血損傷結(jié)果不同。在C57BL/6J小鼠中，一個完整的Willis環(huán)出現(xiàn)的概率約為10%[11]。與Sprague-Dawley大鼠相比，Wistar大鼠的后交通動脈大鼠更細(xì)，且Sprague-Dawley大鼠存在約20%的血管變異[12]。這在一定程度上解釋了動脈栓塞后，即使在同一品系甚至同一批小鼠中，梗死面積也會存在高度差異的情況。

雖然動脈系統(tǒng)的解剖差異會導(dǎo)致腦損傷的變化，但功能上的差異對缺血產(chǎn)生的病理生理也存在較大影響。神經(jīng)血管耦合與血腦屏障兩個在腦卒中病理生理中發(fā)揮關(guān)鍵作用的結(jié)構(gòu)在人類與動物中明顯不同。人類血腦屏障的缺血性損傷可能主要與血管網(wǎng)的其他成分有關(guān)。而在小鼠和大鼠尸檢組織中均可在動脈、毛細(xì)血管和靜脈周圍發(fā)現(xiàn)白蛋白外滲[13]。

1.4免疫系統(tǒng)差異 小鼠與大鼠的中性粒細(xì)胞比例為10%～20%，人類為50%～70%，而淋巴細(xì)胞比例相反，嚙齒類動物比例為50%～100%[14]。此外，在腦卒中發(fā)生后，嚙齒類動物中全基因組信使RNA與微RNA的表達(dá)變化與人類只有極小的交集[15]。腦卒中后，小鼠與大鼠的趨化因子網(wǎng)絡(luò)不同，同時嚙齒類動物與人類的小膠質(zhì)細(xì)胞也存在很大差異[16]。由于缺血性腦卒中后炎癥被認(rèn)為在缺血級聯(lián)的病理生理學(xué)和最終結(jié)果中起至關(guān)重要的作用，因此動物模型和人類腦卒中也會存在較大差異。

1.5實驗動物特異性 在臨床實踐中，腦卒中最明顯的差異為人群所產(chǎn)生的差異。缺血性腦卒中在老年人群中多發(fā)，且患者多伴有糖尿病、高血壓、高血脂、肥胖等基礎(chǔ)疾病，需多種藥物治療，多種因素對于腦卒中結(jié)果均有影響。而腦卒中實驗多是在沒有特定病原體的條件下，對健康雄性小鼠進(jìn)行的研究。腦卒中實驗可以在標(biāo)準(zhǔn)化的條件下，將梗死面積變異性降到最低，這與現(xiàn)實情況存在很大區(qū)別。

1.6麻醉 腦卒中模型與人類腦卒中的一項基本不同為動物模型均需要麻醉，麻醉藥物除了對血壓、腦血流及代謝的影響外，還可能具有神經(jīng)保護(hù)作用，從而對腦卒中結(jié)果產(chǎn)生影響[17]。實驗中常用的麻醉藥物均為全身麻醉藥物，分吸入麻醉及注射麻醉兩種。常用吸入性麻醉藥物主要為異氟烷，注射用麻醉藥物主要為戊巴比妥鈉及水合氯醛。吸入性麻醉誘導(dǎo)平均、迅速，蘇醒也很快，較注射麻醉更加安全。

2 體外腦卒中模型

缺血性腦卒中的復(fù)雜情況導(dǎo)致無法在沒有完整的血管、血流以及白細(xì)胞浸潤的單細(xì)胞或腦組織中建模。而體外模型可以通過剝奪細(xì)胞的能量來源模擬腦缺血，進(jìn)而研究特定的分子機制。誘導(dǎo)模擬腦缺血的方法主要有兩種：氧糖剝奪和阻斷細(xì)胞代謝的化合物或酶。在體外模型中，最常用的為氧糖聯(lián)合剝奪，在低氧環(huán)境中，正常的O2/CO2被N2/CO2所取代，而培養(yǎng)基中則省略了葡萄糖。通常，細(xì)胞培養(yǎng)物暴露于氧糖剝奪環(huán)境中1～24 h可引起廣泛的神經(jīng)元死亡[18]。而模擬腦缺血再灌注損傷可通過回歸正常培養(yǎng)條件來實現(xiàn)。

體外模型中主要有兩種細(xì)胞模式：器官型腦切片與原代細(xì)胞培養(yǎng)。器官型腦切片具有結(jié)構(gòu)方面的優(yōu)勢，可保持神經(jīng)元形態(tài)、膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接。所有的體外模型主要模擬全腦缺血的情況，而腦切片更好地模擬局灶性腦缺血的情況。缺血半暗帶中可發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元逐漸去極化，體外模型中器官型腦切片可模擬這一情況。此外，大腦切片可從人類腦組織中制備出來，并進(jìn)行氧糖剝奪試驗[19]。體外建立血腦屏障模型是了解腦卒中病理生理過程的一種重要方法，但血腦屏障只是由內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元所組成的神經(jīng)血管單元的部分。

3 幾種常見動物模型及其優(yōu)缺點

3.1線栓模型 嚙齒類動物缺血性腦卒中最常用的實驗?zāi)Ｐ蜑榇竽X中動脈栓塞模型，該模型不需要開顱。其沿頸內(nèi)動脈插入線栓并向前推進(jìn)，直至大腦中動脈起始部被阻斷。線栓模型主要用于永久性缺血模型，也可以作為局灶性缺血模型，可通過拔除線栓的方式實現(xiàn)再灌注。通常情況下，大鼠再灌注時間為栓塞后60～120 min內(nèi)，可導(dǎo)致同側(cè)半球大部分神經(jīng)元延遲死亡或壞死。而線栓模型在梗死后120 min或更長時間可導(dǎo)致鼠類下丘腦閉塞，從而導(dǎo)致自發(fā)高熱，在人類中較為罕見[20]。Carmichael[21]指出，在嚙齒類動物中，線栓法所致腦梗死可能與頸內(nèi)動脈閉塞所致大面積腦梗死較為相似，但與通常情況下小面積腦梗死不同。雖然線栓模型對腦缺血的病理生理學(xué)，特別是缺血半暗帶、血腦屏障損傷、炎癥過程、細(xì)胞死亡機制等研究提供了大量知識，但仍存在嚴(yán)重問題。在人類腦梗死中，血管閉塞往往不完全，大多數(shù)患者在腦卒中48 h內(nèi)因血栓的溶解發(fā)生部分自發(fā)再灌注[22-23]。在線栓模型中，拔除線栓后可導(dǎo)致全部再灌注，與人類情況不完全相同，而與機械取栓情況較為相似。

3.2開顱電凝模型 除了線栓模型，還可以通過直接閉塞腦表面血管引起局灶性缺血。通過外科手術(shù)方法灼燒或結(jié)扎腦部血管，可造成永久性腦梗死，不發(fā)生再灌注。但在制作模型過程中必須打開硬腦膜，故模型大腦可能直接受到鉆孔器損傷，或因電凝血管而受到腦部熱損傷[24]。同時打開硬腦膜之后，大腦暴露于空氣中，顱內(nèi)壓受到影響，局部腦區(qū)溫度也會發(fā)生改變[25]。但與線栓模型相比，開顱電凝模型狀態(tài)穩(wěn)定，成功率較高，且可以實現(xiàn)大型動物(如犬類)腦梗死。

3.3光化學(xué)栓塞模型 在光化學(xué)栓塞模型中，靜脈注射孟加拉玫瑰紅光敏感性染料后再使用特定波長的光透過顱骨照射大腦，光照可激活染料，形成單線態(tài)氧和超氧化物，進(jìn)而導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，血小板活化和聚集，最終使動脈末端缺血細(xì)胞迅速死亡，從而導(dǎo)致皮質(zhì)缺血損傷。該模型的一個優(yōu)點為利用立體定向儀激活特定的區(qū)域，從而研究特定皮質(zhì)腦區(qū)梗死性病變。另一優(yōu)點為高度重復(fù)性和較低的變異率與死亡率，這使其成為研究腦梗死后修復(fù)機制及長期功能結(jié)果的模型[26-27]。但這個模型與人類腦卒中情況仍存在差異，主要包括以下兩點：①腦卒中的主要特征為細(xì)胞毒性水腫，而光化學(xué)栓塞法中細(xì)胞毒性水腫與血管源性水腫幾乎同時發(fā)生，血腦屏障迅速破壞[28]。②腦卒中沒有缺血半暗帶及側(cè)支循環(huán)，而缺血半暗帶是神經(jīng)保護(hù)治療的重點。利用環(huán)形濾波器(環(huán)形模型)來調(diào)整光照參數(shù)，可得到一個沒有血栓形成、被受損大腦包圍的中心區(qū)域[29]，但是這個模型能否充分代表人類腦卒中后的缺血半暗帶仍存在爭議[21]。一般情況下，構(gòu)建光化學(xué)栓塞模型需要對動物進(jìn)行麻醉，但有一種新方法允許大鼠、小鼠自由活動，同時進(jìn)行光誘導(dǎo)，這種方法可以實時分析急性腦卒中多種參數(shù)，同時避免了麻醉的干擾[30-31]。

3.4內(nèi)皮素-1模型 內(nèi)皮素-1是一種可持續(xù)收縮血管的肽，可應(yīng)用于暴露的血管或直接在腦表面或注射到腦實質(zhì)內(nèi)導(dǎo)致血管收縮，從而引起遠(yuǎn)端缺血[32]。通過調(diào)整內(nèi)皮素-1水平可以改變腦缺血的嚴(yán)重程度、持續(xù)時間以及由此引起的梗死面積。當(dāng)內(nèi)皮素-1作用減弱時，血流量逐漸恢復(fù)，可模擬暫時性局灶性腦缺血情況。由于內(nèi)皮素-1應(yīng)用后缺血發(fā)展緩慢，且僅伴有輕微腦水腫，所以與人類缺血性腦卒中存在差異[33]。與光化學(xué)性栓塞模型相似，內(nèi)皮素-1模型對腔隙性腦梗死的模擬與長期的恢復(fù)機制也有重要研究價值。然而，內(nèi)皮素-1、內(nèi)皮素-1轉(zhuǎn)化酶和內(nèi)皮素-1受體不僅由內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，還存在于神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中[34-35]。此外，有研究表明內(nèi)皮素-1可用于誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖，這對于腦卒中后恢復(fù)機制的研究可能造成影響[21]。

3.5凝塊栓子栓塞模型 凝塊栓子栓塞模型分為血栓栓塞性及非血栓栓塞性腦卒中模型兩類。在血栓栓塞性模型中，凝塊可從自發(fā)形成或血栓素誘導(dǎo)的血栓物質(zhì)中獲得，主要來自自體血，也可來自異體血[36]。根據(jù)血栓的大小、數(shù)量及應(yīng)用給藥途徑，可以導(dǎo)致一個或多個血管阻塞，隨后在相應(yīng)供血區(qū)域發(fā)生梗死。也可將凝血酶直接注射到頸內(nèi)動脈或大腦中動脈模擬血管閉塞，但血凝塊主要由纖維蛋白組成，與人類腦卒中仍存在差異。與人類情況相似，栓塞模型在梗死灶定位及梗死面積上存在很大差異，在栓塞材料部分或完全溶解后再灌注也不可預(yù)測，但相較于其他模型更加接近臨床情況。因此，血栓模型是用來研究重組組織型纖溶酶原激活劑治療的理想模型。凝塊栓子栓塞模型與人類缺血性腦卒中的病理生理學(xué)較為吻合，主要包括由血管源性水腫引起的細(xì)胞毒性水腫與血腦屏障破壞、缺血半暗帶及炎癥反應(yīng)[37]，不僅可以分析急性期的變化，還可以分析慢性期的自我恢復(fù)機制。與人類腦卒中相似，凝塊栓子模型存在巨大的可變性，需要較多的動物模型才能獲得具有統(tǒng)計學(xué)意義的結(jié)果。

3.6微球/巨球栓塞模型 目前，已有許多材料(硅酮、膠原蛋白或二氧化鈦)被應(yīng)用于動物模型[36]。與血栓栓塞模型相比，人造微球無法溶解，可形成永久性缺血[38]。微球的直徑為20～50 μm，注射后24 h可導(dǎo)致多灶性及非均質(zhì)性梗死[39]。此模型主要用于模擬短暫性腦缺血發(fā)作，可以根據(jù)微球的大小及數(shù)量誘導(dǎo)分級梗死[37]。在微球模型中，毛細(xì)血管及小動脈被阻塞，導(dǎo)致血流重新分布，血腦屏障破壞，發(fā)生血管源性水腫[40]。

巨球模型直徑為300～400 μm，可放置入頸內(nèi)動脈導(dǎo)致大腦中動脈閉塞[38]。腦缺血與梗死的嚴(yán)重程度可由6個球體來決定。梗死后血流動力學(xué)、病變部位、梗死面積及結(jié)果與線栓模型相似。與線栓模型相比，巨球模型并未阻塞下丘腦動脈，因此不會出現(xiàn)體溫升高表現(xiàn)。對大鼠進(jìn)行磁共振成像或正電子發(fā)射計算機斷層顯像時，可延遲閉塞以誘導(dǎo)缺血，實時觀察梗死后改變[41]。

上述腦卒中模型的優(yōu)缺點總結(jié)見表1。

4 動物模型風(fēng)險與并發(fā)癥

近年來，將嚙齒類動物及非人類靈長類動物的神經(jīng)保護(hù)研究應(yīng)用于缺血性腦卒中患者持續(xù)失敗。除實驗本身外，其主要原因為絕大多數(shù)實驗使用年輕、健康的雄性小鼠。故人們嘗試用糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化、高脂血癥、肥胖或感染等較為常見的疾病動物模型來研究腦卒中，年齡與性別的影響也被進(jìn)行研究。在年老動物的實驗中，相較于年輕動物，其神經(jīng)損傷增加，再生能力降低[43]。有證據(jù)表明，年齡與上述各種危險因素會產(chǎn)生協(xié)同作用，導(dǎo)致炎癥程度升高，從而更易發(fā)生腦卒中[44-45]。此外，性別是影響腦卒中發(fā)生率和預(yù)后的另一個重要因素。

在腦卒中危險因素建模時，有兩種主要的實驗策略：①建立具有內(nèi)在危險因素的動物模型，最終導(dǎo)致自發(fā)性腦卒中，這種方法被廣泛應(yīng)用于高血壓動物模型。雖然這些模型與人類腦卒中情況更為相近，但成本高，且極其耗時。②在預(yù)先存在危險因素的動物中誘導(dǎo)腦卒中，但與人類的真實情況存在差異。設(shè)計實驗性缺血性腦卒中的主要困難為如何在人類各種因素相互作用的高度復(fù)雜性和特定科學(xué)問題研究之間找到平衡點。

5 小 結(jié)

缺血性腦卒中發(fā)病原因較為簡單，即血供中斷，遠(yuǎn)端組織損傷。但同時缺血性腦卒中又非常復(fù)雜，大量因素對腦卒中的結(jié)果均有影響，如局部缺血的持續(xù)時間及嚴(yán)重程度，血壓的高低，梗死的病因以及年齡、性別、基礎(chǔ)疾病和遺傳背景等。但腦卒中不是單一的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，而是一種系統(tǒng)性表現(xiàn)，如動脈粥樣硬化、炎癥或感染等，這些疾病可能導(dǎo)致大腦以外其他器官的梗死。缺血性腦卒中的實驗?zāi)Ｐ蛯?/p>

表1 不同缺血性腦卒中模型的優(yōu)缺點

研究人類腦卒中模型提供了很大的幫助。但在得到人類腦卒中的結(jié)論之前，認(rèn)識到單個模型的局限性，并從動物組織中獲取更加接近人類腦卒中疾病變化真實情況的結(jié)果十分重要。而在實驗過程中發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)保護(hù)策略未能成功在人類身上轉(zhuǎn)化，仍需要神經(jīng)科學(xué)工作者更加深入的研究。