錢(qián)揚(yáng)會(huì) 綜述，董建英 審校

北京京都兒童醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.院辦，北京 102200

2019年12月湖北省武漢市發(fā)現(xiàn)多起肺炎病例均診斷為冠狀病毒性肺炎/肺部感染，后來(lái)發(fā)現(xiàn)這種新型肺炎存在人傳人現(xiàn)象。國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)將這種被2019新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染導(dǎo)致的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)納入法定傳染病乙類(lèi)管理，采取甲類(lèi)傳染病的預(yù)防、控制措施。目前，國(guó)內(nèi)外醫(yī)療機(jī)構(gòu)及學(xué)者對(duì)SARS-CoV-2診療及防控進(jìn)行研究，取得了較多進(jìn)展。本院作為北京市首批開(kāi)設(shè)24 h發(fā)熱門(mén)診，并接收患兒的兒童醫(yī)院，在疾病的診療及防控方面具有一定的經(jīng)驗(yàn)。本文主要介紹SARS-CoV-2的生物學(xué)特性、致病特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)與預(yù)防。

1 SARS-CoV-2概述

SARS-CoV-2屬于冠狀病毒科，形態(tài)為圓形、橢圓形或輕度多形性，直徑為100～120 nm。人冠狀病毒有兩個(gè)血清型，即HcoV-229E和HcoV-OC43，是引起人呼吸道感染的重要病原體，人類(lèi)20%的普通感冒由冠狀病毒引起，兒童的冠狀病毒感染發(fā)病率較低[1-2]。隨著細(xì)胞培養(yǎng)和分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，臨床上對(duì)冠狀病毒的認(rèn)識(shí)也逐步深入。

2 SARS-CoV-2的分子生物學(xué)特征

2.1SARS-CoV-2的基因組結(jié)構(gòu) 近期，國(guó)內(nèi)外多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)對(duì)SARS-CoV-2基因組進(jìn)行研究，2020年1月22日，國(guó)家基因組科學(xué)數(shù)據(jù)中心正式發(fā)布SARS-CoV-2資源庫(kù)。該庫(kù)整合了WHO、中國(guó)疾病預(yù)防控制中心(CDC)、美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)、全球流感序列數(shù)據(jù)庫(kù)(GISAID)等機(jī)構(gòu)公開(kāi)發(fā)布的SARS-CoV-2基因組序列數(shù)據(jù)、元信息、學(xué)術(shù)文獻(xiàn)、新聞動(dòng)態(tài)、科普文章，通過(guò)對(duì)全基因組序列相似性比較和變異位點(diǎn)分析，獲取SARS-CoV-2病毒株之間、SARS-CoV-2病毒株與嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)冠狀病毒以及與類(lèi)SARS冠狀病毒蝙蝠株之間的變異程度、變異區(qū)域、變異堿基的詳細(xì)信息。經(jīng)數(shù)據(jù)分析，SARS-CoV-2與2003年爆發(fā)的SARS病毒基因組序列相似度為80%，與2017年2月從國(guó)內(nèi)的蝙蝠中采集到的Bat SARS-like coronavirus isolate bat-SL-CoVZC45基因組序列相似性最高，相似度為88%[3]。

2.2SARS-CoV-2病原學(xué)特點(diǎn) SARS-CoV-2屬于β屬的新型冠狀病毒，有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，為多形性，直徑60～140 nm[2]。體外分離培養(yǎng)時(shí)，SARS-CoV-2在96 h左右即可在人呼吸道上皮細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)，而在Vero E6和Huh-7細(xì)胞系中分離培養(yǎng)需要6 d。SARS-CoV-2在進(jìn)化樹(shù)上初步定位是β屬，與ZC45、ZXC21具有很高的同源性[4]。

3 SARS-CoV-2 臨床致病特點(diǎn)

基于目前的流行病學(xué)調(diào)查，COVID-19潛伏期為1～14 d，多為3～7 d，以發(fā)熱、乏力、干咳為主要表現(xiàn)，少數(shù)患者伴有鼻塞、流涕、咽痛和腹瀉等癥狀。重癥患者多在發(fā)病1周后出現(xiàn)呼吸困難和(或)低氧血癥，嚴(yán)重者快速進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒，以及出血和凝血功能障礙等，值得注意的是重型、危重型患者病程中可表現(xiàn)為中低熱，甚至無(wú)明顯發(fā)熱。輕型患者僅表現(xiàn)為低熱、輕微乏力等，無(wú)肺炎表現(xiàn)[5]。

從目前病例情況看，多數(shù)患者預(yù)后良好，少數(shù)患者病情危重。老年人和有慢性基礎(chǔ)疾病者預(yù)后較差。兒童病例癥狀相對(duì)較輕。

4 SARS-CoV-2 的檢測(cè)方法

4.1標(biāo)本的采集要求 (1)進(jìn)行SARS-CoV-2感染標(biāo)本采集的技術(shù)人員應(yīng)經(jīng)過(guò)生物安全培訓(xùn)(培訓(xùn)合格)和具備相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)技能，在標(biāo)本采集過(guò)程中，采樣人員需穿著個(gè)人防護(hù)裝備(PPE)。(2)病例標(biāo)本的采集由所在病區(qū)經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的醫(yī)護(hù)人員或在專業(yè)人員指導(dǎo)下完成。(3)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作的需要，可根據(jù)患者病程或研究需求多次采樣。(4)每個(gè)病例必須采集呼吸道標(biāo)本，重癥病例優(yōu)先采集下呼吸道標(biāo)本(如支氣管或肺泡灌洗液、肺組織活檢標(biāo)本等)，可根據(jù)臨床表現(xiàn)與采集標(biāo)本的時(shí)間間隔決定采集。

4.2標(biāo)本的采集種類(lèi) (1)上呼吸道標(biāo)本：口咽拭子、鼻咽拭子、鼻咽抽取物、深咳痰液。(2)下呼吸道標(biāo)本：呼吸道抽取物、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液、肺組織活檢標(biāo)本。(3)血清：應(yīng)盡量采集急性期血清，建議使用真空采血管。

4.3標(biāo)本的采集對(duì)象 (1)SARS-CoV-2感染疑似病例、疑似聚集性病例的患者。(2)其他需要進(jìn)行SARS-CoV-2 感染診斷或鑒別診斷的患者。(3)其他需要進(jìn)一步篩查檢測(cè)的環(huán)境或生物材料(如溯源分析)。

4.4采集標(biāo)本的包裝 (1)標(biāo)本采集后應(yīng)在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室生物安全柜內(nèi)分裝。(2)所有標(biāo)本應(yīng)放在大小適合的帶螺旋蓋、內(nèi)有墊圈、耐冷凍的標(biāo)本采集管里，擰緊，容器外注明標(biāo)本編號(hào)、種類(lèi)、姓名及采集日期。(3)將密閉后的標(biāo)本放入大小合適的塑料袋內(nèi)密封，每袋裝1份標(biāo)本。

4.5采集標(biāo)本的運(yùn)輸 (1)SARS-CoV-2毒株或其他潛在感染性生物材料的運(yùn)輸包裝分類(lèi)屬于A類(lèi)，對(duì)應(yīng)的聯(lián)合國(guó)編號(hào)為UN2814，包裝符合國(guó)際民航組織文件《危險(xiǎn)品航空安全運(yùn)輸技術(shù)細(xì)則》分類(lèi)包裝要求。(2)環(huán)境標(biāo)本屬于B類(lèi)，對(duì)應(yīng)的聯(lián)合國(guó)編號(hào)為UN3373，包裝符合國(guó)際民航組織文件《危險(xiǎn)品航空安全運(yùn)輸技術(shù)細(xì)則》的分類(lèi)包裝要求，通過(guò)其他交通工具運(yùn)輸?shù)目蓞⒄找陨蠘?biāo)準(zhǔn)包裝。(3)SARS-CoV-2毒株或其他潛在感染性材料運(yùn)輸應(yīng)按照《可感染人類(lèi)的高致病性病原微生物菌(毒)種或樣本運(yùn)輸管理規(guī)定》執(zhí)行。

4.6采集標(biāo)本的保存 用于病毒分離和核酸檢測(cè)的標(biāo)本應(yīng)盡快進(jìn)行檢測(cè)，24 h內(nèi)能檢測(cè)的標(biāo)本可置于4 ℃保存，24 h內(nèi)無(wú)法檢測(cè)的標(biāo)本則應(yīng)置于-70 ℃或以下保存(若無(wú)-70 ℃，則應(yīng)置于-20 ℃暫存)。血清可在4 ℃存放3 d，可在-20 ℃以下長(zhǎng)期保存。標(biāo)本運(yùn)送期間應(yīng)避免反復(fù)凍融，并應(yīng)設(shè)立專庫(kù)或?qū)９駟为?dú)保存標(biāo)本。

4.7SARS-CoV-2實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測(cè) 參照《新型冠狀病毒感染的肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南(第三版)》[6]和《新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室生物安全指南(第二版)》[7]進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)所用分子檢測(cè)引物與探針如下。

4.7.1靶標(biāo)一(ORF1a/b) 正向引物(F)：CCC TGT GGG TTT TAC ACT TAA；反向引物(R)：ACG ATT GTG CAT CAG CTG A；熒光探針(P)：5′-FAM-CCG TCT GCG GTA TGT GGA AAG GTT ATG G-BHQ1-3′。

4.7.2靶標(biāo)二(N) 正向引物(F)：GGG GAA CTT CTC CTG CTA GAA T；反向引物(R)：CAG ACA TTT TGC TCT CAA GCT G；熒光探針(P)：5′-FAM-TTG CTG CTG CTT GAC AGA TT-TAMRA-3′。

4.8檢測(cè)結(jié)果的判讀 陰性：無(wú)Ct值或Ct值為40。Ct值小于37，可報(bào)告為陽(yáng)性。Ct值為37～40，建議重復(fù)試驗(yàn)，若重做結(jié)果Ct值小于40，擴(kuò)增曲線有明顯起峰，該標(biāo)本判斷為陽(yáng)性，否則為陰性。

RT-PCR能夠在不同的樣品中測(cè)定SARS-CoV-2的基因物質(zhì)。總的來(lái)說(shuō)，現(xiàn)有的PCR方法特異度較高，但是靈敏度較低。這就意味著陰性的測(cè)試結(jié)果并不能排除患者SARS-CoV-2的感染。同時(shí)，由于缺乏實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制而導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)室樣品污染，可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。PCR結(jié)果可以輔助臨床診斷評(píng)價(jià)，但是不能確診或排除疾病。

到目前為止，醫(yī)生只能進(jìn)行一般的病毒測(cè)試，然后必須對(duì)基因組進(jìn)行排序和翻譯。設(shè)備齊全的大型實(shí)驗(yàn)室能夠做到這一點(diǎn)，但對(duì)于規(guī)模較小的實(shí)驗(yàn)室存在一定困難。德羅斯滕是SARS病毒的共同發(fā)現(xiàn)者之一，他認(rèn)為SARS-CoV-2 與SARS病毒關(guān)系密切，擁有SARS控制標(biāo)本庫(kù)存的實(shí)驗(yàn)室可以用其診斷SARS-CoV-2，從而縮短創(chuàng)建測(cè)試所需的時(shí)間[8]。

5 SARS-CoV-2的生物安全防護(hù)[9]

根據(jù)目前了解的SARS-CoV-2 的生物學(xué)特性、傳播特性、致病性、臨床資料等信息，考慮到SARS-CoV-2具有感染聚集性發(fā)病且有重癥病例和死亡病例的特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)應(yīng)按照病原微生物危害程度分類(lèi)中第二類(lèi)病原微生物對(duì)SARS-CoV-2 進(jìn)行管理。

5.1病毒的培養(yǎng) 指病毒的分離、培養(yǎng)、滴定、中和實(shí)驗(yàn)、活病毒及其蛋白的純化、病毒凍干以及產(chǎn)生活病毒的重組實(shí)驗(yàn)等操作，利用活病毒或其感染細(xì)胞(或細(xì)胞提取物)，不經(jīng)滅活進(jìn)行的生化分析、血清學(xué)檢測(cè)、免疫學(xué)檢測(cè)等操作視為病原培養(yǎng)。上述操作應(yīng)在生物安全三級(jí)(BSL-3)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。使用病毒培養(yǎng)物提取核酸，裂解劑或滅活劑的加入必須在與病毒培養(yǎng)等同條件的實(shí)驗(yàn)室或防護(hù)條件下進(jìn)行。滅活后的病毒培養(yǎng)物可在BSL-2或 BSL-1實(shí)驗(yàn)室操作。

5.2動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn) 指以活病毒感染動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)，應(yīng)在BSL-3實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行操作。

5.3未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料的操作 未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料在采用可靠的方法滅活前進(jìn)行病毒抗原檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)、核酸檢測(cè)、生物化學(xué)分析等操作，應(yīng)在BSL-2實(shí)驗(yàn)室操作，但個(gè)人防護(hù)應(yīng)參照BSL-3實(shí)驗(yàn)室的防護(hù)要求。

5.4滅活材料的操作 感染性材料或活病毒在采用可靠的方法滅活后可在BSL-1實(shí)驗(yàn)室操作。

5.5無(wú)感染性材料的操作 指針對(duì)確認(rèn)無(wú)感染性材料的各種操作，包括但不限于無(wú)感染性的病毒DNA的操作，可在BSL-1實(shí)驗(yàn)室操作。

6 SARS-CoV-2感染期間實(shí)驗(yàn)室防控[9]

6.1人員的個(gè)人防護(hù) (1)工作人員嚴(yán)格按照清潔區(qū)、緩沖區(qū)、污染區(qū)的人流走向進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室。(2)進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室前須穿戴好個(gè)人防護(hù)用品，至少應(yīng)佩戴帽子、口罩、手套，穿著工作服、工作褲和工作鞋。(3)所有標(biāo)本均應(yīng)視為具有潛在傳染性，須采取標(biāo)準(zhǔn)預(yù)防措施。(4)進(jìn)入發(fā)熱門(mén)診或患者留觀室、病區(qū)時(shí)穿戴防護(hù)用品程序見(jiàn)圖1。(5)離開(kāi)發(fā)熱門(mén)診或留觀室、病區(qū)前脫防護(hù)用品程序見(jiàn)圖2。

圖1 人員穿戴防護(hù)用品及進(jìn)入污染區(qū)程序圖

圖2 人員離開(kāi)污染區(qū)及脫防護(hù)用品程序圖

6.2實(shí)驗(yàn)操作的防護(hù) (1)呼吸道來(lái)源標(biāo)本的操作：呼吸道來(lái)源標(biāo)本應(yīng)留取至密閉容器，用密閉轉(zhuǎn)運(yùn)容器進(jìn)行送檢，標(biāo)本核收后應(yīng)立即轉(zhuǎn)入二級(jí)生物安全柜，操作過(guò)程小心謹(jǐn)慎，防溢、灑、滲、漏，一旦發(fā)生溢、灑后按照消毒程序進(jìn)行處置。(2)其他來(lái)源標(biāo)本：在尚未明確非呼吸道來(lái)源標(biāo)本是否具有傳染性的情況下，應(yīng)將所有類(lèi)型標(biāo)本視為具有潛在危險(xiǎn)性。(3)微量采血做到一人一針一管一消，對(duì)每位患者采血前后均應(yīng)洗手和(或)手消。(4)離心標(biāo)本應(yīng)在安全柜中打開(kāi)，離心機(jī)應(yīng)蓋嚴(yán)蓋子，標(biāo)本離心后應(yīng)靜置5 min以上方可打開(kāi)離心機(jī)蓋，如發(fā)生標(biāo)本管破裂、溢、灑，應(yīng)立即關(guān)閉離心機(jī)蓋，按照消毒程序進(jìn)行處置。(5)流感病毒檢測(cè)的咽拭子標(biāo)本被接收后，應(yīng)在安全柜中檢測(cè)，檢測(cè)完畢置于醫(yī)療廢物盒中，并蓋嚴(yán)蓋子。(6)在現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)室條件下嚴(yán)禁進(jìn)行SARS病毒毒株的分離鑒定和保存。

6.3實(shí)驗(yàn)室的清潔與消毒

6.3.1空氣清潔消毒 首選自然通風(fēng)，保證室內(nèi)外空氣的流通。室內(nèi)無(wú)人時(shí)使用紫外線燈照射消毒，每次照射不小于0.5 h，每天2～3次。

6.3.2物體表面、地面的清潔和消毒 實(shí)驗(yàn)室所有的物體表面、地面都應(yīng)當(dāng)進(jìn)行清潔，受到病原微生物污染時(shí)，應(yīng)當(dāng)先清潔，再進(jìn)行消毒。

實(shí)驗(yàn)室每天應(yīng)使用500～1 000 mg/L的含氯消毒劑擦拭臺(tái)面、地面和物體表面，每天至少2次，遇污染時(shí)隨時(shí)消毒。

現(xiàn)階段可定時(shí)用1 000 mg/L健之素溶液擦拭臺(tái)面、地面、垃圾容器盒表面等。

6.3.3標(biāo)本滲、漏、溢、灑的消毒 發(fā)生標(biāo)本溢、灑、滲、漏后應(yīng)立即用紙巾或抹布覆蓋，用75%的乙醇溶液或1 500～2 500 mg/L的有效氯溶液由外向內(nèi)傾倒，作用30 min以上，用鑷子移去紙巾或抹布，用消毒液擦拭后再用清水擦拭。溢灑處應(yīng)設(shè)置明顯標(biāo)識(shí)，防止其他人員靠近。

6.3.4手部的清潔與消毒 流動(dòng)水洗手，方法為非手觸式開(kāi)關(guān)，方法為七步洗手法，每一步驟均為10 s，最后用清水沖凈清洗劑。手部的消毒劑采用75%的乙醇溶液或70%的異丙醇或醇的復(fù)合制劑3～5 mL，按洗手方法搓揉1～2 min。

6.3.5防護(hù)用品的清洗與消毒 非一次性使用的防護(hù)用品，放入專用轉(zhuǎn)運(yùn)箱中，每周由專人送洗衣房進(jìn)行清洗、消毒。防護(hù)眼鏡可以用500～1 000 mg/L的含氯消毒劑消毒，采用0.2%的過(guò)氧乙酸溶液或75%的乙醇溶液浸泡30 min，清洗干燥后備用。

6.3.6實(shí)驗(yàn)器材的消毒與滅菌 非一次性使用的實(shí)驗(yàn)器材應(yīng)進(jìn)行121 ℃、20 min的壓力蒸汽滅菌，不適用于壓力蒸汽滅菌的物品可采用化學(xué)消毒法，可用75%的乙醇溶液浸泡作用15～30 min，干燥保存。

6.4醫(yī)療廢物的處置

6.4.1醫(yī)療廢物的收集 醫(yī)療廢物應(yīng)分類(lèi)收集，并按照類(lèi)別放置于防滲、防漏、防銳器的專用包裝物或密閉的容器內(nèi)。醫(yī)療廢物專用包裝物、容器，應(yīng)有明顯的中英文警示標(biāo)識(shí)。

醫(yī)療廢物收集容器應(yīng)符合有關(guān)部門(mén)的要求，所有廢物盛裝量不應(yīng)超過(guò)容器或包裝袋的3/4。嚴(yán)禁使用有破損或已經(jīng)污染的收集容器，見(jiàn)圖3。

圖3 醫(yī)療廢物的收集流程圖

6.4.2 醫(yī)療廢物的轉(zhuǎn)運(yùn) 醫(yī)療廢物應(yīng)每日由專人使用專用轉(zhuǎn)運(yùn)工具，按照規(guī)定的時(shí)間、路線及時(shí)清運(yùn)，就近轉(zhuǎn)送到醫(yī)院醫(yī)療廢物專門(mén)暫存場(chǎng)

所，定期由醫(yī)療廢物集中處置單位轉(zhuǎn)運(yùn)焚燒。運(yùn)送工具、暫存場(chǎng)所等需及時(shí)清潔，遇污染時(shí)及時(shí)用1 000 mg/L的含氯消毒劑或0.2%的過(guò)氧乙酸溶液消毒。

對(duì)外運(yùn)輸?shù)尼t(yī)療廢物必須做好交接工作，并認(rèn)真記錄，內(nèi)容包括醫(yī)療廢物的種類(lèi)、數(shù)量、交接時(shí)間、集中處置單位以及經(jīng)辦人簽名。登記資料至少保存兩年。