陳韻，陸麗珠，張瑾，梁舒妍，江志彬，王漫君，鐘先鋒

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東佛山528225）

當(dāng)今社會(huì)的快速發(fā)展，使得人類所面臨的能源和環(huán)境壓力日益增大，為解決這個(gè)問題，各國均在努力多渠道開發(fā)可再生生物質(zhì)資源。生物柴油因其具有可再生、環(huán)境友好、與柴油成分相近等優(yōu)點(diǎn)成為解決此問題的熱點(diǎn)研究方向[1]。目前用于生物柴油生產(chǎn)的原料主要是動(dòng)植物油脂、餐飲地溝油等[2-3]。但動(dòng)植物油脂成本較高，且供給有限，限制了生物柴油規(guī)?；a(chǎn)[4-7]。產(chǎn)油微生物中酵母菌油脂脂肪酸組成與植物油相似，且含量高，是代替動(dòng)植物油脂成為制備生物柴油的重要原料[6，8-9]。與植物油和動(dòng)物油生產(chǎn)相比，微生物細(xì)胞生長十分迅速、生長周期較短，同時(shí)微生物生長所需原料來源比較廣泛，具有利用一些農(nóng)業(yè)廢棄物的水解物作為生長所需營養(yǎng)物質(zhì)的能力，能夠解決能源短缺問題的同時(shí)還有利于環(huán)境保護(hù)[10-12]。

微生物油脂的合成都是從乙酰輔酶A的合成開始，再經(jīng)過多次碳鏈延長后，在去飽和酶的去飽和作用下，最終生成油脂[13]。在油脂合成的過程中，添加脂肪酸合成過程中所產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，或能影響脂肪酶活性的物質(zhì)，如乙酸鹽、甘油等，以及某些維生素B類物質(zhì)，可提高油脂的含量[13]。本研究以充分利用木質(zhì)纖維且進(jìn)一步生產(chǎn)微生物油脂為目的，采用響應(yīng)面優(yōu)化法研究添加外源因子對酵母菌產(chǎn)油脂代謝的影響，通過因素交互作用分析，建立響應(yīng)面回歸模型，對各因素進(jìn)行優(yōu)化，以確定各外源因子的最佳添加配方，以期加快利用木質(zhì)纖維素水解液生產(chǎn)微生物油脂的工業(yè)進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

圓紅冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）CICC 32489：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

玉米秸稈：佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院。

1.1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基：5°Bé麥芽汁 1.0 L，瓊脂 15.0 g，自然pH值。

種子培養(yǎng)基：KH2PO41 g/L，MgSO41.5 g/L，（NH4）2SO40.5 g/L，酵母粉2 g/L，葡萄糖4 g/L，自然pH值。

玉米秸稈水解液的培養(yǎng)基：KH2PO41 g/L，MgSO41.5 g/L，（NH4）2SO40.5 g/L，酵母粉 2 g/L。

以上培養(yǎng)基均要在121℃，0.1MPa下滅菌20min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)

斜面培養(yǎng)：將已活化的菌種接種到固體培養(yǎng)基中，在28℃，180 r/min的條件下培養(yǎng)2 d。

種子培養(yǎng)：將斜面培養(yǎng)基中菌種接種幾環(huán)到裝有100 mL液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，在28℃，180 r/min條件下培養(yǎng)48 h后，得到種子液。

產(chǎn)脂發(fā)酵：將上述得到的種子液接種到玉米秸稈水解液培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)1 d～12 d。

1.2.2 玉米秸稈粗水解液的制備

稱取80 g玉米秸稈粉末，置于1 000 mL三角瓶中，加入800 mL濃度0.5%的稀硫酸，振蕩搖勻，121℃預(yù)處理90 min，冷卻后調(diào)節(jié)pH值至5.5，再加入2.5%纖維素酶和木聚糖酶混合物（1∶1，質(zhì)量比），50℃水解48 h后，離心取上清液，得玉米秸稈粗水解液。

1.2.3 玉米秸稈水解液脫毒處理

向粗水解液中加入Ca（OH）2粉末，調(diào)節(jié)pH值至10，靜置1.5 h，過濾，除去水解液中的沉淀。濾液用5 mol/L的H2SO4調(diào)節(jié)pH值到5.5，靜置1 h后過濾取上清液，然后沸水浴20 min，待其冷卻后過濾備用。

向經(jīng)脫毒處理的玉米秸稈水解液中添加KH2PO41 g/L，MgSO41.5 g/L，（NH4）2SO40.5 g/L，CaCl20.5 g/L，酵母粉2 g/L，制備利于微生物發(fā)酵產(chǎn)油脂的玉米秸稈水解液培養(yǎng)基。

1.2.4 生物量的測定

發(fā)酵液在4 000 r/min離心10 min，收集菌體在105℃烘干至恒重。

1.2.5 油脂含量、油脂產(chǎn)量測定

將發(fā)酵液離心收集菌體，每克濕菌體加入10 mL濃度4 mol/L的鹽酸，振蕩搖勾，室溫（25℃）放置半小時(shí)后，沸水浴10 min，-20℃冷凍30 min。加入乙醚和石油醚的混合液20 mL（體積比為1∶1）振蕩搖勻，4 000 r/min離心10 min，萃取有機(jī)層。再加入乙醚和石油醚的混合液，重復(fù)上述步驟，合并有機(jī)層，混合后離心，揮發(fā)機(jī)層。于105℃，烘至恒重，冷卻后計(jì)算油脂含量和油脂產(chǎn)量。

1.2.6 總糖測定

試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[14]的方法，采用3，5-二硝基水楊酸法測定培養(yǎng)基中還原糖濃度。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得到線性回歸方程y=0.486x+0.001 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5。

1.2.7 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別添加不同濃度的甘油（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、乙酸鈉（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、檸檬酸鈉（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）、維生素B6（0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%）至玉米秸稈水解液培養(yǎng)基中，考察了4種外源因子對酵母菌發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)油脂的影響。

1.2.8 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以乙酸鈉（A）、維生素B6（B）、甘油（C）、檸檬酸鈉（D）為自變量，以生物量（Y1）、油脂含量（Y2）、油脂產(chǎn)量（Y3）為響應(yīng)值，使用 Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，因子編碼及水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平Table 1 Factor and levels in response surface analysis

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Office Excel 2010統(tǒng)計(jì)分析，Design-Expert 8.0.6軟件，Origin 9.0軟件等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、作圖。單因素試驗(yàn)中用單因素試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)進(jìn)行方差分析處理，處理后采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行比較，并使用字母標(biāo)記法進(jìn)行標(biāo)記。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌發(fā)酵玉米秸稈水解液培養(yǎng)基產(chǎn)油脂

采用酸水解結(jié)合酶解的方法制備玉米秸稈水解液培養(yǎng)基，3，5-二硝基水楊酸法測到培養(yǎng)基的總糖為24.332 g/L。將種子液接種到玉米秸稈水解液培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)7 d，測到生物量為18.79 g/L、油脂含量30.31%、油脂產(chǎn)量5.70 g/L。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 甘油對酵母產(chǎn)油脂的影響

甘油在磷酸化作用下轉(zhuǎn)變?yōu)橛椭铣伤枰?-磷酸甘油，從而為油脂提供合成的前體[15]。甘油對菌體生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量的影響見圖1。

圖1 甘油對菌體生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of glycerin on biomass，lipid content and lipid yield of bacteria

由圖1可知，當(dāng)添加0.1%～0.5%甘油時(shí)，生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量都呈現(xiàn)先增大后減小的變化趨勢，在甘油添加量為0.3%時(shí)有最大值，分別為生物量20.12 g/L、油脂含量30.68%、油脂產(chǎn)量6.17 g/L。隨著甘油濃度增大，以上指標(biāo)均下降，原因可能是加入過量甘油后培養(yǎng)基在搖瓶培養(yǎng)的過程中容易起泡，泡沫過多會(huì)影響到培養(yǎng)基中氧氣的溶解度，最終會(huì)影響菌體油脂的積累[16]。綜合上述指標(biāo)評(píng)價(jià)，選擇添加甘油0.20%～0.40%進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2.2 乙酸鈉對酵母產(chǎn)油脂的影響

乙酸鈉可促進(jìn)無活性的單體聚合成有活性的全酶，從而加速脂肪酸的合成。乙酸鈉中含有的乙?；芎洼o酶A結(jié)合，轉(zhuǎn)化生成的乙酰輔酶A是脂肪酸合成和能量代謝的重要前體，因而可以為脂肪酸合成提供更多的底物供應(yīng)[17-18]。乙酸鈉對菌體生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量的影響見圖2。

圖2 乙酸鈉對菌體生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of sodium on biomass，lipid content and lipid yield of bacteria

由圖2可知，乙酸鈉添加量0.1%～0.3%，生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量均增加，在0.3%時(shí)有最大值，分別為17.28 g/L、30.26%、5.23 g/L。當(dāng)添加量超過0.3%時(shí)，生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量都顯著減小。原因可能是乙酸鈉添加過量會(huì)改變培養(yǎng)基的pH值，從而影菌體的正常的生長[17]。綜合上述指標(biāo)評(píng)價(jià)，選擇添加乙酸鈉0.20%～0.40%進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2.3 檸檬酸鈉對酵母產(chǎn)油脂的影響

乙酰輔酶A是微生物在體內(nèi)積累油脂的必備因子，它主要存在于線粒體中，而脂肪酸的合成是在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，乙酰輔酶A以檸檬酸的形式通過三羧酸循環(huán)系統(tǒng)從線粒體運(yùn)送到細(xì)胞質(zhì)中，其中檸檬酸作為重要的中間產(chǎn)物，對油脂的合成起著重要的作用[19]。Brown等[20]研究表明檸檬酸是脂肪酸合成的主要前體物質(zhì)，是油脂合成啟動(dòng)的源頭。研究檸檬酸鈉添加量對酵母菌產(chǎn)油脂的影響結(jié)果見圖3。

圖3 檸檬酸鈉對菌體生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of sodium citrate on biomass，lipid content and lipid yield of bacteria

如圖3所示，加入一定量的檸檬酸鈉，菌體的生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量等升高，但加入過量時(shí)以上指標(biāo)均下降，原因可能是檸檬酸鈉作為一種鹽類，加入過量時(shí)對菌體表面細(xì)胞膜產(chǎn)生負(fù)面影響，從而影響菌體對培養(yǎng)基中離子的吸收利用。綜合上述指標(biāo)評(píng)價(jià)，選擇添加檸檬酸鈉0.40%～0.80%進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2.4 維生素B6對酵母產(chǎn)油脂的影響

丙酮酸羧化酶（pyruvate carboxylase，Pyc）是胞質(zhì)還原三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA循環(huán)）途徑中的關(guān)鍵酶，它通過CO2固定催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸，而如果體系中沒有足夠的草酰乙酸參與到檸檬酸的合成，檸檬酸的缺乏會(huì)成為油脂合成的限速步驟[21]。因此，Pyc在脂肪酸的生物合成中發(fā)揮重要作用，維生素B6提高Pyc的活性，減少丙酮酸的積累，最終促進(jìn)油脂的合成[22-23]。同時(shí)，維生素B6是脫氫酶的輔酶，它能提高脫飽和酶的活性，促進(jìn)脂肪酸脫氫生成雙鍵，最終能夠提高脂肪酸的不飽和度[24]。維生素B6對菌體生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量的影響見圖4。

如圖4所示，當(dāng)維生素B6添加量0.01%到0.05%，菌體生物量在14.96 g/L到16.16 g/L變化，在添加量為0.04%時(shí)有最大值16.16 g/L，變化幅度不大，說明添加維生素B6對圓紅冬孢酵母菌體的生長影響不明顯。在添加量為0.02%時(shí)，油脂含量、油脂產(chǎn)量最大，分別為31.26%、4.6 g/L，說明添加適量維生素B6是有助于菌體發(fā)酵產(chǎn)油脂。綜合上述指標(biāo)評(píng)價(jià)，選擇添加維生素B60.01%～0.03%進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)。

圖4 維生素B6對菌體生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of vtamin B6on biomass，lipid content and lipid yield of bacteria

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化外源因子對微生物產(chǎn)油脂的影響

在單因素試驗(yàn)結(jié)的基礎(chǔ)上，使用Design-Expert 8.0.6軟件建立數(shù)學(xué)模型，以生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量為響應(yīng)值，共設(shè)計(jì)了29個(gè)處理組，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值Table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding experimental polysaccharide yields

續(xù)表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值Continue table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding experimental polysaccharide yields

2.3.1 響應(yīng)面回歸模型的建立和分析

利用Design-Expert軟件對表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合和方差分析，得到各因子對響應(yīng)值的二次多項(xiàng)回歸模型為：

回歸方程模型方差分析（生物量）見表3，回歸方程模型方差分析（油脂含量）見表4，回歸方程模型方差分析（油脂產(chǎn)量）見表5。

表3 回歸方程模型方差分析（生物量）Table 3 ANOVA for response surface quadratic model（biomass）

表4 回歸方程模型方差分析（油脂含量）Table 4 ANOVA for response surface quadratic model（lipid content）

續(xù)表4 回歸方程模型方差分析（油脂含量）Continue table 4 ANOVA for response surface quadratic model（lipid content）

表5 回歸方程模型方差分析（油脂產(chǎn)量）Table 5 ANOVA for response surface quadratic model（lipid yied）

方差分析結(jié)果顯示，模型的p值均＜0.01，差異極顯著，而失擬項(xiàng)p值分別為0.785 3、0.175 3、0.624 3（p＞0.05），差異不顯著，說明未知因素對試驗(yàn)結(jié)果的干擾較小，該試驗(yàn)?zāi)Ｐ统浞謹(jǐn)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，即可以利用此回歸模型反映各因素對菌體生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量的影響。

在表3回歸方程模型方差分析（生物量）中，A、B、C、D、A2、B2、C2、D2影響均為極顯著（p＜0.01），交互項(xiàng)AB 影響顯著（p＜0.05），CD 影響極顯著（p＜0.01）。根據(jù)F值對各因素的影響大小順序?yàn)椋篋＞C＞A＞B，說明檸檬酸鈉對圓紅冬孢酵母生物量大小影響最大。

在表4回歸方程模型方差分析（油脂含量）中，交互項(xiàng) AB、AC、AD、BC、BD、CD 的交互作用對響應(yīng)值沒有顯著影響，而一次項(xiàng)和二次項(xiàng)對圓紅冬孢酵母發(fā)酵玉米秸稈水解液培養(yǎng)基的油脂含量的影響均為極顯著（p＜0.01），根據(jù)F值大小，一次項(xiàng)對響應(yīng)值影響大小順序?yàn)椋篋＞B＞A＞C。

在表5回歸方程模型方差分析（油脂產(chǎn)量）中，A、B、C、D、A2、B2、C2、D2對響應(yīng)值影響均為極顯著 （p＜0.01），A、B、C、D 各因素對酵母菌油脂產(chǎn)量的顯著性大小依次為：D＞B＞C＞A。交互項(xiàng)AD、CD對響應(yīng)值影響極顯著（p＜0.01），BD 影響顯著（p＜0.05）。

乙酸鈉、維生素B6、甘油、檸檬酸鈉對菌體發(fā)酵玉米秸稈水解液產(chǎn)油脂影響顯著。

2.3.2 響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化

響應(yīng)面坡度越陡峭，等高線越密集并形成橢圓，說明兩因素對響應(yīng)值的交互作用越顯著，反之則越不顯著[25]。圖5為各因素對菌體生物量的響應(yīng)面分析圖。

圖5 各因素對生物量的響應(yīng)面立體分析圖Fig.5 Three-dimensional analysis map of the response surface of each factor to biomass

由圖5可見，結(jié)合表3方差分析結(jié)果，檸檬酸鈉和甘油的交互作用極顯著（p＜0.01），控制檸檬酸鈉濃度不變，隨著甘油濃度增大，生物量呈先上升后下降的趨勢，檸檬酸鈉也是如此；維生素B6和乙酸鈉的交互作用顯著（p＜0.05），生物量隨著兩者增大，表現(xiàn)出先增大后減小的趨勢，與方差分析結(jié)果一致。圖6為各因素對菌體油脂含量的響應(yīng)面分析圖。

圖6 各因素對油脂含量的響應(yīng)面立體分析圖Fig.6 Three-dimensional analysis map of the response surface of each factor to lipid content

由圖6可見，6組響應(yīng)面立體分析圖的坡度都較陡，說明乙酸鈉、維生素B6、檸檬酸鈉、甘油等濃度增大都會(huì)使酵母的油脂含量產(chǎn)生顯著性的先增大后減小的變化趨勢。結(jié)合表4的方差分析結(jié)果，各因素間的交互作用對菌體油脂含量影響均不顯著（p＞0.05），但各因素對酵母發(fā)酵玉米秸稈水解液培養(yǎng)基產(chǎn)油脂影響顯著。圖7為各因素對菌體油脂產(chǎn)量的響應(yīng)面分析圖。

由圖7可見，響應(yīng)面立體分析圖的坡度較陡，說明各因素對酵母發(fā)酵玉米秸稈水解液培養(yǎng)基產(chǎn)油脂影響顯著。各響應(yīng)值隨著各因素在一定范圍內(nèi)變化，均表現(xiàn)出是先增大再減少的變化趨勢，說明在研究的因素水平范圍內(nèi)有最大值，結(jié)合表5回歸模型方差分析結(jié)果，檸檬酸鈉和乙酸鈉、甘油的交互作用影響極顯著（p＜0.01），維生素B6和檸檬酸鈉的交互作用影響顯著（p＜0.05）。

圖7 各因素對油脂產(chǎn)量的響應(yīng)面立體分析圖Fig.7 Three-dimensional analysis map of the response surface of each factor to lipid yield

2.3.3 最佳添加量驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

通過Design-Expert8.0.6軟件分析得到各外源因子添加量的最佳配方為乙酸鈉0.33%、維生素B60.02%、甘油0.27%、檸檬酸0.66%，在此條件下，模型預(yù)測的生物量為28.82 g/L、油脂含量為43.18%、油脂產(chǎn)量為11.55 g/L。為了方便實(shí)際試驗(yàn)操作，將試驗(yàn)條件調(diào)整為乙酸鈉0.35%、維生素B60.02%、甘油0.3%、檸檬酸0.65%，得到的生物量為（29.32±0.35）g/L、油脂含量為（43.75±0.26）%、油脂產(chǎn)量為（12.11±0.18）g/L，相比優(yōu)化前分別提高了56.04%、41.95%、109.15%，試驗(yàn)結(jié)果偏差較小，數(shù)據(jù)穩(wěn)定，證明該模型合理可靠。

3 結(jié)論

為進(jìn)一步提高圓紅冬孢酵母菌（Rhodosporidium toruloides）CICC 32489菌株的油脂產(chǎn)量，本課題研究了外源因子對菌體生物量和產(chǎn)油脂情況的影響，先通過單因素試驗(yàn)，確定外源因子的最佳添加量，在此基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對乙酸鈉、甘油、維生素B6、檸檬酸鈉等4個(gè)因子進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，得到的工藝參數(shù)為乙酸鈉0.33%、維生素B60.02%、甘油0.27%、檸檬酸鈉0.66%，生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)量等相比優(yōu)化前分別提高了56.04%、41.95%、109.15%，說明4種外源因子對酵母菌發(fā)酵玉米秸稈水解液培養(yǎng)基產(chǎn)油脂影響顯著。