蔡玉華,李云鵬
馬凡氏綜合征(Marfan syndrome, MFS)是一種常染色體顯性遺傳疾病,主要由原纖維蛋白-1基因(fibrillin-1 gene,F(xiàn)BN1)的不同突變引起結(jié)締組織結(jié)構(gòu)和功能的改變,常累及主動脈形成馬凡動脈瘤而致死[1]。MFS動脈瘤的病理機(jī)制與血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的存活和死亡密切相關(guān)。研究表明可通過促進(jìn)VSMCs的凋亡反應(yīng)進(jìn)而改善動脈瘤的過度增殖,最終減緩MFS動脈瘤病程的發(fā)生發(fā)展[2-3]。在臨床治療中,目前仍未研發(fā)出有效治療MFS動脈瘤形成的藥物,大多數(shù)MFS病人最終采用手術(shù)治療動脈瘤,但是治療效果一般[4]。因此,探討MFS動脈瘤的病理機(jī)制及藥物靶點治療研究具有重要的臨床意義。
1.1 主要試劑 馬凡氏模型小鼠(FBN1C1039G/+)購自美國賽業(yè)生物科技有限公司,DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自Hyclone公司,胎牛血清購自德國PAN公司,增殖活性檢測MTT試劑盒、BCA蛋白定量檢測試劑盒購自上海碧云天公司,兔抗鼠Bax、Bcl-2以及β-actin抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。
1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 鈍性分離C57野生小鼠和馬凡模型小鼠的胸主動脈,提取野生小鼠和馬凡小鼠的原代VSMCs,將各組VSMCs置于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,置于37 ℃細(xì)胞孵育箱中,2~3 d以后換液,待細(xì)胞生長至培養(yǎng)皿的80%以上,采用胰蛋白酶消化傳代至新的培養(yǎng)皿中,將4~8代的VSMCs用于實驗檢測。
1.3 細(xì)胞分組 各組細(xì)胞生長至培養(yǎng)皿的80%以上,采用無血清饑餓各組細(xì)胞24 h后,根據(jù)是否采用白藜蘆醇處理,將本細(xì)胞實驗分為4組:Control組,采用含有10%胎牛血清的DMEM處理野生小鼠的原代VSMCs;Control+Resveratrol組,采用含有10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基+10 μm白藜蘆醇處理野生小鼠的原代VSMCs;MFS組,采用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基處理FBN1C1039G/+小鼠的原代VSMCs;MFS+Resveratrol組,采用含有10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基+10 μm白藜蘆醇處理FBN1 C1039G/+小鼠的原代VSMCs。將處理后的細(xì)胞培養(yǎng)24h后,收集各組細(xì)胞,以備后續(xù)實驗檢測相關(guān)指標(biāo)。
1.4 MTT檢測細(xì)胞增殖率 將4組細(xì)胞以密度為1×104個/孔接種于96孔中,待細(xì)胞生長至80%以上,根據(jù)實驗設(shè)計處理各組細(xì)胞24 h后,每孔再加入MTT溶液10 μL,將各組細(xì)胞置于37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育3 h后,取出各組細(xì)胞,棄培養(yǎng)液,加入DMSO液體孵育10 min,最后在酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度,換算各組細(xì)胞增殖率。
1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 將4組細(xì)胞根據(jù)實驗設(shè)計分別處理24 h,處理步驟同前。將處理后的細(xì)胞采用胰蛋白酶消化懸浮各組VSMC后,將各組細(xì)胞依次進(jìn)行以下步驟:加預(yù)冷的PBS液體洗滌、離心、加入RNA酶室溫孵育30 min,加入5 μL的PI溶液,移入至流式細(xì)胞檢測管內(nèi),最后將各組細(xì)胞置于流式細(xì)胞儀下檢測,采用Flow Jo軟件分析各組細(xì)胞凋亡水平。
1.6 Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá) 將4組細(xì)胞根據(jù)實驗設(shè)計分別處理24 h,處理步驟同前。將處理后的細(xì)胞加入蛋白裂解液后提取總蛋白,根據(jù)BCA試劑盒說明書檢測各組細(xì)胞蛋白濃度后,再加入蛋白裂解液將各組細(xì)胞蛋白濃度調(diào)至相同。將各組蛋白依次進(jìn)行電泳分離、轉(zhuǎn)膜、5%牛奶封閉2 h,最后將各組蛋白條帶與Bax、Bcl-2和β-actin的一抗置于4 ℃冰箱孵育過夜。次日將各組條帶洗滌后,再加入相應(yīng)的二抗置于室溫下孵育2 h,最后于暗室加入ECL試劑盒顯影和記錄分析結(jié)果。
2.1 白藜蘆醇抑制馬凡動脈瘤的增殖率情況 采用MTT試劑盒檢測各組VSMCs的增殖水平,結(jié)果表明MFS組的VMSCs增殖率明顯高于Control組(P<0.05),提示MFS小鼠的體外血管平滑肌細(xì)胞過度增殖模型建立成功。而與Control組相比,Control+Resveratrol組的VSMCs增殖率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),提示白藜蘆醇對野生小鼠的VSMCs增殖水平無明顯改變。與MFS組相比,MFS+Resveratrol組的VSMCs增殖率明顯下降(P<0.05),提示白藜蘆醇可明顯抑制MFS的VSMCs過度增殖反應(yīng)。同時白藜蘆醇對普通小鼠和MFS小鼠的VSMCs增殖率差異表現(xiàn),也進(jìn)一步提示白藜蘆醇對MFS動脈瘤的病理機(jī)制具有一定的調(diào)控功能。詳見圖1。
與Control組比較,*P<0.05;
2.2 白藜蘆醇促進(jìn)馬凡動脈瘤的凋亡率情況 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組VSMCs的凋亡情況,結(jié)果表明MFS組的VMSCs凋亡率明顯低于Control組(P<0.05),提示MFS小鼠的VSMCs凋亡水平下降進(jìn)而促進(jìn)動脈瘤的形成。而與MFS組相比,MFS+Resveratrol組的VSMCs凋亡率明顯上升(P<0.05),提示白藜蘆醇可促進(jìn)VSMCs的凋亡反應(yīng)進(jìn)而減緩動脈瘤形成。詳見表1。通過檢測各組增殖與凋亡水平發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇對MFS小鼠的VSMCs具有促凋亡和抗增殖的作用功能,具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。
表1 各組VSMCs的凋亡率比較(±s)
2.3 白藜蘆醇調(diào)節(jié)凋亡蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)情況 采用Western blot檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá),結(jié)果表明,與Control組比較,MFS組的Bax的蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05),Bcl-2的蛋白表達(dá)改變無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而Bax/Bcl-2也明顯下降(P<0.05)。與MFS組比較,MFS+Resveratrol組的Bax的蛋白表達(dá)上升(P<0.05),Bcl-2蛋白表達(dá)改變無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而Bax/Bcl-2也明顯上升(P<0.05)。提示MFS小鼠的VSMCs的促凋亡蛋白Bax表達(dá)明顯下降進(jìn)而有助于MFS動脈瘤的形成,而白藜蘆醇則可明顯上調(diào)MFS的VSMCs的促凋亡蛋白Bax的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)凋亡反應(yīng),最終改善MFS動脈瘤的形成。詳見圖2。
與Control組比較,*P<0.05;與MFS組比較,#P<0.05。
白藜蘆醇作為天然的多酚化合物具有多重生物學(xué)效應(yīng),主要包括抗氧化、抗炎癥以及調(diào)節(jié)血脂代謝,可對機(jī)體內(nèi)多個系統(tǒng)疾病發(fā)揮重要的藥理學(xué)意義[5-7]。而在心血管系統(tǒng)疾病研究中,白藜蘆醇被證實可改善心肌缺血、動脈粥樣硬化和抗心律失常等保護(hù)心血管功能的作用[8-10]。但關(guān)于白藜蘆醇對馬凡綜合征動脈瘤作用機(jī)制的研究較少,有研究證實白藜蘆醇可明顯抑制VSMCs的增殖、炎癥及氧化應(yīng)激等病理過程進(jìn)而改善血管損傷的發(fā)生發(fā)展[11-12]。在血管損傷中,VSMCs的凋亡與增殖常為對立關(guān)系,凋亡增強可限制增殖過度,抑制增殖過度則可促進(jìn)凋亡的發(fā)生[13-14]。而MFS動脈瘤的形成也與VSMCs增殖過度和凋亡下降明顯相關(guān)[2]?;贛FS動脈瘤與VSMCs的存活與死亡密切相關(guān),本研究通過體外培養(yǎng)原代VSMCs,采用白藜蘆醇處理細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可明顯抑制馬凡小鼠VSMCs的過度增殖進(jìn)而改善MFS動脈瘤的形成。分析VSMCs增殖與凋亡的對立關(guān)系,進(jìn)一步驗證白藜蘆醇對馬凡小鼠VSMCs的具體調(diào)控作用,檢測白藜蘆醇對VSMCs的凋亡反應(yīng)影響,結(jié)果表明白藜蘆醇可明顯促進(jìn)VSMCs的凋亡反應(yīng)進(jìn)而抑制VSMCs的增殖水平,最終改善MFS動脈瘤的形成。
而VSMCs凋亡具體作用機(jī)制可受促凋亡基因Bax和抗凋亡基因Bcl-2調(diào)控。研究證實Bax/Bcl-2的增加可改變線粒體膜通透性和調(diào)節(jié)細(xì)胞色素C的釋放,進(jìn)而明顯促進(jìn)凋亡反應(yīng)[15]。因此,掌握Bax和Bcl-2之間的平衡則為調(diào)控VSMCs凋亡機(jī)制的關(guān)鍵。本研究已驗證白藜蘆醇可通過上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)MFS的VSMCs凋亡反應(yīng),同時也抑制VSMCs的增殖反應(yīng),最終改善MFS動脈瘤病理過程。此外,TGF-β信號通路在MFS的主動脈中明顯激活,而有效抑制TGF-β信號通路可明顯抑制MFS病人主動脈擴(kuò)張[16]。已有研究驗證白藜蘆醇可通過抑制TGF-β信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡反應(yīng)[17]。因此,根據(jù)本實驗結(jié)果,推測白藜蘆醇可能通過抑制TGF-β信號通路進(jìn)而調(diào)控VSMCs的存亡,最終改善MFS動脈瘤的形成。
綜上所述,白藜蘆醇可通過上調(diào)促凋亡基因Bax的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)VSMCs的凋亡反應(yīng),同時抑制VSMCs的增殖水平,最終可改善馬凡小鼠動脈瘤的病理發(fā)展過程。