李倩曉 于勤 那榮妹 劉百亭

【摘要】 目的 探究微小RNA（miR）-1與miR-499在心肌細胞增殖與凋亡過程中的調(diào)控作用及其機制。方法 選取大鼠H9C2心肌細胞株， 培養(yǎng)DMEM培養(yǎng)基， 將培養(yǎng)好的H9C2心肌細胞分為空白對照組、陰性對照組（采用隨機合成的miRNA片段通過脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染）、miR-1 inhibitor組（采用隨機合成的miR-1 inhibitor片段通過脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染）、miR-499 mimics組（采用隨機合成的miR-499 mimics片段通過脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染）。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測轉(zhuǎn)染情況， 設(shè)置空白對照組、H2O2組（未進行轉(zhuǎn)染的H9C2心肌細胞）、干預(yù)組A（miR-1 inhibitor轉(zhuǎn)染的H9C2心肌細胞）、干預(yù)組B（miR-499 mimics轉(zhuǎn)染的H9C2心肌細胞）、干預(yù)組C（miR-1 inhibitor+miR-499 mimics轉(zhuǎn)染的H9C2心肌細胞）。通過H2O2誘導(dǎo)建立H9C2心肌細胞氧化應(yīng)激模型。采用細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）法檢測細胞增殖情況， 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況， Western Blot檢測B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、特異性半胱氨酸酶3（Caspase-3）蛋白表達水平。結(jié)果 miR-1?inhibitor組的心肌細胞miR-1表達明顯低于空白對照組和陰性對照組， miR-499 mimics組心肌細胞miR-499表達明顯高于空白對照組和陰性對照組， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）?？瞻讓φ战M與陰性對照組的miR-1與miR-499表達比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與空白對照組的（0.47±0.23）OD比較， H2O2組心肌細胞增殖（0.12±0.09）OD顯著降低， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與H2O2組比較， 干預(yù)組A心肌細胞增殖（0.27±0.12）OD和干預(yù)組B心肌細胞增殖（0.29±0.13）OD均明顯升高， 干預(yù)組C心肌細胞增殖（0.36±0.17）OD進一步升高， 但仍低于空白對照組， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與空白對照組比較， H2O2組細胞凋亡率顯著升高， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;對比H2O2組， 干預(yù)組A、干預(yù)組B細胞凋亡率均明顯降低， 干預(yù)組C細胞凋亡率進一步降低， 但仍高于空白對照組， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與空白對照組比較， H2O2組心肌細胞Bcl-2蛋白表達水平明顯降低， 而Caspase-3蛋白表達水平明顯升高， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與H2O2組比較， 干預(yù)組A和干預(yù)組B的Bcl-2蛋白表達水平均明顯升高、Caspase-3蛋白表達水平均明顯降低， 但仍低于空白對照組， 而干預(yù)組C的Bcl-2蛋白表達水平進一步升高、Caspase-3蛋白表達水平進一步降低， 但仍高于空白對照組， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 miR-1與miR-499在心肌細胞增殖與凋亡過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用， miR-1可能通過下調(diào)Bcl-2、上調(diào)Caspase-3蛋白表達促進心肌細胞凋亡， 而miR-499則通過上調(diào)Bcl-2、下調(diào)Caspase-3蛋白表達抑制心肌細胞凋亡， 針對這兩個環(huán)節(jié)進行干預(yù)有望成為將來臨床治療心臟疾病的新途徑。

【關(guān)鍵詞】 微小RNA-1;微小RNA-499;心肌細胞;細胞增殖;細胞凋亡

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.12.086

心肌細胞凋亡在心力衰竭、心臟重構(gòu)中扮演著重要角色， 減少心肌細胞凋亡可改善心臟重構(gòu)， 改善心功能[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)， 微小RNA（microRNA， miRNA， miR）在胚胎發(fā)育、細胞增殖、分化、凋亡、代謝、腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮重要作用[2]。其中， miR-1、miR-499與心臟疾病的關(guān)系極為密切。本研究將miR-1?inhibitor、miR-499 mimics轉(zhuǎn)染至H2O2處理的心肌細胞， 探究miR-1與miR-499在心肌細胞增殖與凋亡過程中的調(diào)控作用及其機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1. 1 實驗材料 大鼠H9C2心肌細胞株， 購自中科院上海細胞庫;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、0.05%胰酶/EDTA（美國Hycloneo公司）;miR-1 inhibitor、競爭性短核糖核苷酸陰性對照序列（scramble-NC）、miR-499、miR-1和U6引物序列（上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司）;miR-499 mimics（廣州銳博公司）;H2O2、CCK-8、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（中國碧云天試劑公司）;β-肌動蛋白（β-actin）、Bcl-2、Caspase-3單抗（美國Epitmics公司）;ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國millipore公司）;脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitrogen公司）;二喹啉甲酸（BCA）試劑盒（美國Thermo公司）;miRNeasy Serum/plasma Kit、miScript SYBR Green PCR Kit、RNase-free ddH2O、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（德國QIAGEN公司）。RT-PCR檢測儀（美國ABI公司）， 流式細胞儀（美國BD公司）， 酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司）。

1. 2 細胞培養(yǎng) 配置含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基， 加入H9C2心肌細胞， 置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2～3 d細胞傳代1次。在實驗前24 h取對數(shù)生長期的H9C2心肌細胞換液備用。

1. 3 細胞分組及轉(zhuǎn)染 將培養(yǎng)好的H9C2心肌細胞分為空白對照組、陰性對照組、miR-1 inhibitor組、miR-499 mimics組。除空白對照組外， 陰性對照組、miR-1 inhibitor組、miR-499 mimics組H9C2心肌細胞分別采用隨機合成的miRNA片段、miR-1 inhibitor片段、miR-499 mimics片段通過脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染， 濃度均為200 nmol/L， 處理時間均為6 h。轉(zhuǎn)染結(jié)束后將細胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 48 h后收集細胞。

1. 4 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染情況 采用miRNeasy Serum/plasma Kit試劑盒提取血清RNA， 并檢測RNA的純度。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將miRNA逆轉(zhuǎn)錄為特定的cDNA， 并置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩T-PCR反應(yīng)：應(yīng)用制備好的cDNA作為模版， 分別配置空白對照組、陰性對照組、miR-1 inhibitor組、miR-499 mimics組反應(yīng)管， 以U6作內(nèi)參。采用ABI 7500軟件分析熔解曲線， 用2-△Ct計算miRNA基因相對表達量。

1. 5 實驗分組及H2O2處理 設(shè)置空白對照組、H2O2組（未進行轉(zhuǎn)染的H9C2心肌細胞）、干預(yù)組A（miR-1 inhibitor轉(zhuǎn)染的H9C2心肌細胞）、干預(yù)組B（miR-499 mimics轉(zhuǎn)染的H9C2心肌細胞）、干預(yù)組C（miR-1 inhibitor+miR-499 mimics轉(zhuǎn)染的H9C2心肌細胞）。除空白對照組外， 其余四組H9C2心肌細胞均采用200 μmol/L的H2O2處理6 h。

1. 6 CCK-8法檢測細胞增殖情況 取對數(shù)生長期的H9C2心肌細胞， 接種到96孔板中（1×104個細胞/孔）， 置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中， 培養(yǎng)12 h后， 待細胞貼壁， 將H2O2處理后的各組細胞加入貼壁均勻的96孔板中， 用CCK-8進行處理并繼續(xù)置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2 h后震蕩5 min， 在570 nm波長處測定各組細胞的吸光度（OD）值。

1. 7 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 取H2O2處理后的各組細胞， 經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌后， 消化， 離心， 收集細胞。在收集到的細胞沉淀中加入200 ?l binding buffer并吹打成單細胞懸液， 再分別加入濃度為250 μg/ml的Annexin V-FITC和PI試劑各5 μl， 避光室溫下反應(yīng)5～15 min， 在1 h內(nèi)采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1. 8 Western Blot檢測Bcl-2、Caspase-3蛋白表達水平 取H2O2處理后的各組細胞， 加入裂解液處理30 min， 收集蛋白并用蛋白質(zhì)定量（BCA）法測定蛋白濃度， 煮沸10 min使蛋白變性， 上樣， 按20 μg/泳道蛋白量經(jīng)12% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）， 以5%脫脂奶粉封閉60 min， 分別加入β-actin、Bcl-2、Caspase-3特異性抗體（均按照1∶1000稀釋）， 4℃孵育過夜。次日用PBS-T液洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗， 室溫孵育2 h后增強化學(xué)發(fā)光法（ECL）進行顯色， 曝光后采用Image J軟件分析各個條帶的光密度， 目標(biāo)蛋白相對表達量=目標(biāo)條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1. 9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差（ x-±s）表示， 兩兩比較采用LSD-t檢驗， 多組間比較采用單因素方差分析;計數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 各組轉(zhuǎn)染結(jié)果比較 miR-1 inhibitor組的心肌細胞miR-1表達明顯低于空白對照組和陰性對照組， miR-499 mimics組心肌細胞miR-499表達明顯高于空白對照組和陰性對照組， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）?？瞻讓φ战M與陰性對照組的miR-1與miR-499表達比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2. 2 各組心肌細胞增殖檢測結(jié)果比較 與空白對照組比較， H2O2組心肌細胞增殖顯著降低， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與H2O2組比較， 干預(yù)組A心肌細胞增殖和干預(yù)組B心肌細胞增殖均升高， 干預(yù)組C心肌細胞增殖進一步升高， 但仍低于空白對照組， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2. 3 各組心肌細胞凋亡檢測結(jié)果比較 與空白對照組比較， H2O2組細胞凋亡率顯著升高， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與H2O2組比較， 干預(yù)組A、干預(yù)組B細胞凋亡率均明顯降低， 干預(yù)組C細胞凋亡率進一步降低， 但仍高于空白對照組， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

2. 4 各組心肌細胞Bcl-2、Caspase-3蛋白表達水平比較 與空白對照組比較， H2O2組心肌細胞Bcl-2蛋白表達水平明顯降低， 而Caspase-3蛋白表達水平明顯升高， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與H2O2組比較， 干預(yù)組A和干預(yù)組B的Bcl-2蛋白表達水平均明顯升高、Caspase-3蛋白表達水平均明顯降低， 但仍低于空白對照組， 而干預(yù)組C的Bcl-2蛋白表達水平進一步升高、Caspase-3蛋白表達水平進一步降低， 但仍高于空白對照組， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表4。

3 討論

miRNA是一種非編碼RNA， 是可以影響轉(zhuǎn)錄后基因表達水平的調(diào)控分子[3]。人類基因組中約有30%基因受miRNA調(diào)控， 且同一種miRNA可能參與上百種基因的表達調(diào)節(jié)[4]。miRNA通過種子序列與信使RNA的3非翻譯區(qū)互補結(jié)合， 從而調(diào)控基因表達。miRNA轉(zhuǎn)錄后誘導(dǎo)沉默復(fù)合體， 抑制信使RNA翻譯， 或促進其降解， 從而抑制蛋白質(zhì)翻譯[5]。研究發(fā)現(xiàn)， 動物體內(nèi)表達多種miRNA， 參與調(diào)節(jié)細胞增殖及凋亡， 參與心血管疾病進程[6]。

在眾多凋亡基因中， Bcl-2蛋白家族發(fā)揮著重要作用， 是調(diào)控細胞線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵因子， 其中Bcl-2屬于抗凋亡蛋白[7， 8]。Bcl-2可維持鈣離子動態(tài)平衡、穩(wěn)定細胞線粒體膜、拮抗促凋亡蛋白表達、控制細胞色素C和其他凋亡因子釋放， 從而抑制細胞凋亡[9， 10]。有研究發(fā)現(xiàn)， miR-1可通過抑制Bcl-2表達促進心肌細胞凋亡[11]。

Caspase-3屬于促凋亡蛋白， 是細胞凋亡過程的執(zhí)行者， 在細胞凋亡的執(zhí)行階段及線粒體凋亡途徑中具有重要作用， 也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑的最終凋亡因子， 只有Caspase-3表達增高， 才能說明發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡。在心肌缺血缺氧狀態(tài)下， Caspase-3可激活其前體， 啟動細胞凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)， miR-1可通過正性調(diào)控Caspase-3促進細胞凋亡[12]。

本次研究發(fā)現(xiàn)， 轉(zhuǎn)染miR-1 inhibitor、miR-499 mimics心肌細胞， Bcl-2蛋白表達水平明顯升高， Caspase-3蛋白表達水平明顯降低， 而聯(lián)合干預(yù)的Bcl-2蛋白表達水平升高幅度及Caspase-3蛋白表達水平降低幅度更為顯著， 提示miR-1可能是通過下調(diào)Bcl-2、上調(diào)Caspase-3蛋白發(fā)揮促進心肌細胞凋亡作用， 而miR-499則相反， 通過上調(diào)Bcl-2、下調(diào)Caspase-3蛋白發(fā)揮抑制心肌細胞凋亡作用。

綜上所述， miR-1與miR-499在心肌細胞增殖與凋亡過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用， 針對這兩個環(huán)節(jié)進行干預(yù)有望成為將來臨床治療心臟疾病的新途徑。

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[收稿日期：2020-01-21]