李倩曉 于勤 那榮妹 劉百亭

【摘要】 目的 探究微小RNA（miR）-1與miR-499在心肌細(xì)胞增殖與凋亡過程中的調(diào)控作用及其機(jī)制。方法 選取大鼠H9C2心肌細(xì)胞株， 培養(yǎng)DMEM培養(yǎng)基， 將培養(yǎng)好的H9C2心肌細(xì)胞分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組（采用隨機(jī)合成的miRNA片段通過脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染）、miR-1 inhibitor組（采用隨機(jī)合成的miR-1 inhibitor片段通過脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染）、miR-499 mimics組（采用隨機(jī)合成的miR-499 mimics片段通過脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染）。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)轉(zhuǎn)染情況， 設(shè)置空白對(duì)照組、H2O2組（未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的H9C2心肌細(xì)胞）、干預(yù)組A（miR-1 inhibitor轉(zhuǎn)染的H9C2心肌細(xì)胞）、干預(yù)組B（miR-499 mimics轉(zhuǎn)染的H9C2心肌細(xì)胞）、干預(yù)組C（miR-1 inhibitor+miR-499 mimics轉(zhuǎn)染的H9C2心肌細(xì)胞）。通過H2O2誘導(dǎo)建立H9C2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激模型。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況， 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況， Western Blot檢測(cè)B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、特異性半胱氨酸酶3（Caspase-3）蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 miR-1?inhibitor組的心肌細(xì)胞miR-1表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組， miR-499 mimics組心肌細(xì)胞miR-499表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）?？瞻讓?duì)照組與陰性對(duì)照組的miR-1與miR-499表達(dá)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與空白對(duì)照組的（0.47±0.23）OD比較， H2O2組心肌細(xì)胞增殖（0.12±0.09）OD顯著降低， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與H2O2組比較， 干預(yù)組A心肌細(xì)胞增殖（0.27±0.12）OD和干預(yù)組B心肌細(xì)胞增殖（0.29±0.13）OD均明顯升高， 干預(yù)組C心肌細(xì)胞增殖（0.36±0.17）OD進(jìn)一步升高， 但仍低于空白對(duì)照組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與空白對(duì)照組比較， H2O2組細(xì)胞凋亡率顯著升高， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;對(duì)比H2O2組， 干預(yù)組A、干預(yù)組B細(xì)胞凋亡率均明顯降低， 干預(yù)組C細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步降低， 但仍高于空白對(duì)照組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與空白對(duì)照組比較， H2O2組心肌細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低， 而Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與H2O2組比較， 干預(yù)組A和干預(yù)組B的Bcl-2蛋白表達(dá)水平均明顯升高、Caspase-3蛋白表達(dá)水平均明顯降低， 但仍低于空白對(duì)照組， 而干預(yù)組C的Bcl-2蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步升高、Caspase-3蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步降低， 但仍高于空白對(duì)照組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 miR-1與miR-499在心肌細(xì)胞增殖與凋亡過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用， miR-1可能通過下調(diào)Bcl-2、上調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡， 而miR-499則通過上調(diào)Bcl-2、下調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)抑制心肌細(xì)胞凋亡， 針對(duì)這兩個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù)有望成為將來臨床治療心臟疾病的新途徑。

【關(guān)鍵詞】 微小RNA-1;微小RNA-499;心肌細(xì)胞;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.12.086

心肌細(xì)胞凋亡在心力衰竭、心臟重構(gòu)中扮演著重要角色， 減少心肌細(xì)胞凋亡可改善心臟重構(gòu)， 改善心功能[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)， 微小RNA（microRNA， miRNA， miR）在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、凋亡、代謝、腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮重要作用[2]。其中， miR-1、miR-499與心臟疾病的關(guān)系極為密切。本研究將miR-1?inhibitor、miR-499 mimics轉(zhuǎn)染至H2O2處理的心肌細(xì)胞， 探究miR-1與miR-499在心肌細(xì)胞增殖與凋亡過程中的調(diào)控作用及其機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)材料 大鼠H9C2心肌細(xì)胞株， 購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、0.05%胰酶/EDTA（美國(guó)Hycloneo公司）;miR-1 inhibitor、競(jìng)爭(zhēng)性短核糖核苷酸陰性對(duì)照序列（scramble-NC）、miR-499、miR-1和U6引物序列（上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司）;miR-499 mimics（廣州銳博公司）;H2O2、CCK-8、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（中國(guó)碧云天試劑公司）;β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）、Bcl-2、Caspase-3單抗（美國(guó)Epitmics公司）;ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國(guó)millipore公司）;脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑（美國(guó)Invitrogen公司）;二喹啉甲酸（BCA）試劑盒（美國(guó)Thermo公司）;miRNeasy Serum/plasma Kit、miScript SYBR Green PCR Kit、RNase-free ddH2O、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（德國(guó)QIAGEN公司）。RT-PCR檢測(cè)儀（美國(guó)ABI公司）， 流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）， 酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）。

1. 2 細(xì)胞培養(yǎng) 配置含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基， 加入H9C2心肌細(xì)胞， 置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2～3 d細(xì)胞傳代1次。在實(shí)驗(yàn)前24 h取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2心肌細(xì)胞換液備用。

1. 3 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 將培養(yǎng)好的H9C2心肌細(xì)胞分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-1 inhibitor組、miR-499 mimics組。除空白對(duì)照組外， 陰性對(duì)照組、miR-1 inhibitor組、miR-499 mimics組H9C2心肌細(xì)胞分別采用隨機(jī)合成的miRNA片段、miR-1 inhibitor片段、miR-499 mimics片段通過脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染， 濃度均為200 nmol/L， 處理時(shí)間均為6 h。轉(zhuǎn)染結(jié)束后將細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 48 h后收集細(xì)胞。

1. 4 RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染情況 采用miRNeasy Serum/plasma Kit試劑盒提取血清RNA， 并檢測(cè)RNA的純度。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將miRNA逆轉(zhuǎn)錄為特定的cDNA， 并置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。RT-PCR反應(yīng)：應(yīng)用制備好的cDNA作為模版， 分別配置空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-1 inhibitor組、miR-499 mimics組反應(yīng)管， 以U6作內(nèi)參。采用ABI 7500軟件分析熔解曲線， 用2-△Ct計(jì)算miRNA基因相對(duì)表達(dá)量。

1. 5 實(shí)驗(yàn)分組及H2O2處理 設(shè)置空白對(duì)照組、H2O2組（未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的H9C2心肌細(xì)胞）、干預(yù)組A（miR-1 inhibitor轉(zhuǎn)染的H9C2心肌細(xì)胞）、干預(yù)組B（miR-499 mimics轉(zhuǎn)染的H9C2心肌細(xì)胞）、干預(yù)組C（miR-1 inhibitor+miR-499 mimics轉(zhuǎn)染的H9C2心肌細(xì)胞）。除空白對(duì)照組外， 其余四組H9C2心肌細(xì)胞均采用200 μmol/L的H2O2處理6 h。

1. 6 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2心肌細(xì)胞， 接種到96孔板中（1×104個(gè)細(xì)胞/孔）， 置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中， 培養(yǎng)12 h后， 待細(xì)胞貼壁， 將H2O2處理后的各組細(xì)胞加入貼壁均勻的96孔板中， 用CCK-8進(jìn)行處理并繼續(xù)置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2 h后震蕩5 min， 在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各組細(xì)胞的吸光度（OD）值。

1. 7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 取H2O2處理后的各組細(xì)胞， 經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌后， 消化， 離心， 收集細(xì)胞。在收集到的細(xì)胞沉淀中加入200 ?l binding buffer并吹打成單細(xì)胞懸液， 再分別加入濃度為250 μg/ml的Annexin V-FITC和PI試劑各5 μl， 避光室溫下反應(yīng)5～15 min， 在1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1. 8 Western Blot檢測(cè)Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)水平 取H2O2處理后的各組細(xì)胞， 加入裂解液處理30 min， 收集蛋白并用蛋白質(zhì)定量（BCA）法測(cè)定蛋白濃度， 煮沸10 min使蛋白變性， 上樣， 按20 μg/泳道蛋白量經(jīng)12% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）， 以5%脫脂奶粉封閉60 min， 分別加入β-actin、Bcl-2、Caspase-3特異性抗體（均按照1∶1000稀釋）， 4℃孵育過夜。次日用PBS-T液洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗， 室溫孵育2 h后增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）進(jìn)行顯色， 曝光后采用Image J軟件分析各個(gè)條帶的光密度， 目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量=目標(biāo)條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1. 9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)， 多組間比較采用單因素方差分析;計(jì)數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 各組轉(zhuǎn)染結(jié)果比較 miR-1 inhibitor組的心肌細(xì)胞miR-1表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組， miR-499 mimics組心肌細(xì)胞miR-499表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）?？瞻讓?duì)照組與陰性對(duì)照組的miR-1與miR-499表達(dá)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2. 2 各組心肌細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果比較 與空白對(duì)照組比較， H2O2組心肌細(xì)胞增殖顯著降低， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與H2O2組比較， 干預(yù)組A心肌細(xì)胞增殖和干預(yù)組B心肌細(xì)胞增殖均升高， 干預(yù)組C心肌細(xì)胞增殖進(jìn)一步升高， 但仍低于空白對(duì)照組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2. 3 各組心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果比較 與空白對(duì)照組比較， H2O2組細(xì)胞凋亡率顯著升高， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與H2O2組比較， 干預(yù)組A、干預(yù)組B細(xì)胞凋亡率均明顯降低， 干預(yù)組C細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步降低， 但仍高于空白對(duì)照組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

2. 4 各組心肌細(xì)胞Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較 與空白對(duì)照組比較， H2O2組心肌細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低， 而Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與H2O2組比較， 干預(yù)組A和干預(yù)組B的Bcl-2蛋白表達(dá)水平均明顯升高、Caspase-3蛋白表達(dá)水平均明顯降低， 但仍低于空白對(duì)照組， 而干預(yù)組C的Bcl-2蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步升高、Caspase-3蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步降低， 但仍高于空白對(duì)照組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表4。

3 討論

miRNA是一種非編碼RNA， 是可以影響轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)水平的調(diào)控分子[3]。人類基因組中約有30%基因受miRNA調(diào)控， 且同一種miRNA可能參與上百種基因的表達(dá)調(diào)節(jié)[4]。miRNA通過種子序列與信使RNA的3非翻譯區(qū)互補(bǔ)結(jié)合， 從而調(diào)控基因表達(dá)。miRNA轉(zhuǎn)錄后誘導(dǎo)沉默復(fù)合體， 抑制信使RNA翻譯， 或促進(jìn)其降解， 從而抑制蛋白質(zhì)翻譯[5]。研究發(fā)現(xiàn)， 動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)多種miRNA， 參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及凋亡， 參與心血管疾病進(jìn)程[6]。

在眾多凋亡基因中， Bcl-2蛋白家族發(fā)揮著重要作用， 是調(diào)控細(xì)胞線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵因子， 其中Bcl-2屬于抗凋亡蛋白[7， 8]。Bcl-2可維持鈣離子動(dòng)態(tài)平衡、穩(wěn)定細(xì)胞線粒體膜、拮抗促凋亡蛋白表達(dá)、控制細(xì)胞色素C和其他凋亡因子釋放， 從而抑制細(xì)胞凋亡[9， 10]。有研究發(fā)現(xiàn)， miR-1可通過抑制Bcl-2表達(dá)促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡[11]。

Caspase-3屬于促凋亡蛋白， 是細(xì)胞凋亡過程的執(zhí)行者， 在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段及線粒體凋亡途徑中具有重要作用， 也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑的最終凋亡因子， 只有Caspase-3表達(dá)增高， 才能說明發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡。在心肌缺血缺氧狀態(tài)下， Caspase-3可激活其前體， 啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)， miR-1可通過正性調(diào)控Caspase-3促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12]。

本次研究發(fā)現(xiàn)， 轉(zhuǎn)染miR-1 inhibitor、miR-499 mimics心肌細(xì)胞， Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯升高， Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯降低， 而聯(lián)合干預(yù)的Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高幅度及Caspase-3蛋白表達(dá)水平降低幅度更為顯著， 提示miR-1可能是通過下調(diào)Bcl-2、上調(diào)Caspase-3蛋白發(fā)揮促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡作用， 而miR-499則相反， 通過上調(diào)Bcl-2、下調(diào)Caspase-3蛋白發(fā)揮抑制心肌細(xì)胞凋亡作用。

綜上所述， miR-1與miR-499在心肌細(xì)胞增殖與凋亡過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用， 針對(duì)這兩個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù)有望成為將來臨床治療心臟疾病的新途徑。

參考文獻(xiàn)

[1] Abbate A， Narula J. Role of apoptosis in adverse ventricular remodeling. Heart Fail Clin， 2012， 8（1）：79-86.

[2] Hata A. Functions of microRNAs in cardiovascular biology and disease. Annu Rev Physiol， 2013， 75（1）：69-93.

[3] Schober A， Weber C. Mechanisms of microRNAs in atherosclerosis. Annu Rev Pathol， 2016（11）：583-616.

[4] Samanta S， Balasubramanian S， Rajasingh S， et al. MicroRNA：a new therapeutic strategy for cardiovascular diseases. Trends Cardiovasc Med， 2016， 26（5）：407-419.

[5] Ryan BC， Lowe K， Hanson L， et al. Mapping the Pax6 3untranslated region microRNA regulatory landscape. BMC Genomics， 2018， 19（1）：820.

[6] Cheng HL， Fu CY， Kuo WC， et al. Detecting miRNA biomarkers from extracellular vesicles for cardiovascular disease with a microfluidic system. Lab Chip， 2018， 18（19）：2917-2925.

[7] Cvejic D， Selemetiev S， Savin S， et al. Apoptosis and proliferation related molecules（Bcl-2， Bax， p53， PCNA）in papillary microcarcinoma versus papillary carcinoma of the thyroid. Pathology， 2008， 40（5）：475-480.

[8] Youle RJ， Strasser A. The BCL-2 protein family：opposing activities that mediate cell death. Nature Reviews， 2008， 9（1）：47-59.

[9] Kvansakul M， Hinds MG. The Bcl-2 family：structures， interactions and targets for drug discovery. Apoptosis， 2015， 20（2）：136-150.

[10] Green DR， Kroemer G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science， 2004， 305（5684）：626-629.

[11] Shan ZX， Lin QX， Fu YH， et al. Upregulated expression of miR-1/miR-206 in a rat model of myocardial infarction. Biochem Biophys Res Commun， 2009， 381（4）：597-601.

[12] Nasser MW， Datta J， Nuovo G， et al. Down-regulation of miR-1 in lung cancer suppression of tumorigenic property of lung cancer cells and their sensitization to doxorubicin-induced apoptosis by miR-1. J Biol Chem， 2008， 283（48）：33394-33405.

[收稿日期：2020-01-21]