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        miR-1與miR-499調(diào)控心肌細(xì)胞增殖與凋亡機(jī)制研究

        2020-06-01 10:12:31李倩曉于勤那榮妹劉百亭
        中國實(shí)用醫(yī)藥 2020年12期
        關(guān)鍵詞:空白對照心肌細(xì)胞陰性

        李倩曉 于勤 那榮妹 劉百亭

        【摘要】 目的 探究微小RNA(miR)-1與miR-499在心肌細(xì)胞增殖與凋亡過程中的調(diào)控作用及其機(jī)制。方法 選取大鼠H9C2心肌細(xì)胞株, 培養(yǎng)DMEM培養(yǎng)基, 將培養(yǎng)好的H9C2心肌細(xì)胞分為空白對照組、陰性對照組(采用隨機(jī)合成的miRNA片段通過脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染)、miR-1 inhibitor組(采用隨機(jī)合成的miR-1 inhibitor片段通過脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染)、miR-499 mimics組(采用隨機(jī)合成的miR-499 mimics片段通過脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染)。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測轉(zhuǎn)染情況, 設(shè)置空白對照組、H2O2組(未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的H9C2心肌細(xì)胞)、干預(yù)組A(miR-1 inhibitor轉(zhuǎn)染的H9C2心肌細(xì)胞)、干預(yù)組B(miR-499 mimics轉(zhuǎn)染的H9C2心肌細(xì)胞)、干預(yù)組C(miR-1 inhibitor+miR-499 mimics轉(zhuǎn)染的H9C2心肌細(xì)胞)。通過H2O2誘導(dǎo)建立H9C2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激模型。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)法檢測細(xì)胞增殖情況, 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況, Western Blot檢測B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、特異性半胱氨酸酶3(Caspase-3)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 miR-1?inhibitor組的心肌細(xì)胞miR-1表達(dá)明顯低于空白對照組和陰性對照組, miR-499 mimics組心肌細(xì)胞miR-499表達(dá)明顯高于空白對照組和陰性對照組, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)??瞻讓φ战M與陰性對照組的miR-1與miR-499表達(dá)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與空白對照組的(0.47±0.23)OD比較, H2O2組心肌細(xì)胞增殖(0.12±0.09)OD顯著降低, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與H2O2組比較, 干預(yù)組A心肌細(xì)胞增殖(0.27±0.12)OD和干預(yù)組B心肌細(xì)胞增殖(0.29±0.13)OD均明顯升高, 干預(yù)組C心肌細(xì)胞增殖(0.36±0.17)OD進(jìn)一步升高, 但仍低于空白對照組, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與空白對照組比較, H2O2組細(xì)胞凋亡率顯著升高, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);對比H2O2組, 干預(yù)組A、干預(yù)組B細(xì)胞凋亡率均明顯降低, 干預(yù)組C細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步降低, 但仍高于空白對照組, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與空白對照組比較, H2O2組心肌細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低, 而Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與H2O2組比較, 干預(yù)組A和干預(yù)組B的Bcl-2蛋白表達(dá)水平均明顯升高、Caspase-3蛋白表達(dá)水平均明顯降低, 但仍低于空白對照組, 而干預(yù)組C的Bcl-2蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步升高、Caspase-3蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步降低, 但仍高于空白對照組, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 miR-1與miR-499在心肌細(xì)胞增殖與凋亡過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用, miR-1可能通過下調(diào)Bcl-2、上調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡, 而miR-499則通過上調(diào)Bcl-2、下調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)抑制心肌細(xì)胞凋亡, 針對這兩個環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù)有望成為將來臨床治療心臟疾病的新途徑。

        【關(guān)鍵詞】 微小RNA-1;微小RNA-499;心肌細(xì)胞;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡

        DOI:10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.12.086

        心肌細(xì)胞凋亡在心力衰竭、心臟重構(gòu)中扮演著重要角色, 減少心肌細(xì)胞凋亡可改善心臟重構(gòu), 改善心功能[1]。近年研究發(fā)現(xiàn), 微小RNA(microRNA, miRNA, miR)在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、凋亡、代謝、腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮重要作用[2]。其中, miR-1、miR-499與心臟疾病的關(guān)系極為密切。本研究將miR-1?inhibitor、miR-499 mimics轉(zhuǎn)染至H2O2處理的心肌細(xì)胞, 探究miR-1與miR-499在心肌細(xì)胞增殖與凋亡過程中的調(diào)控作用及其機(jī)制?,F(xiàn)報(bào)告如下。

        1 材料與方法

        1. 1 實(shí)驗(yàn)材料 大鼠H9C2心肌細(xì)胞株, 購自中科院上海細(xì)胞庫;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、0.05%胰酶/EDTA(美國Hycloneo公司);miR-1 inhibitor、競爭性短核糖核苷酸陰性對照序列(scramble-NC)、miR-499、miR-1和U6引物序列(上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司);miR-499 mimics(廣州銳博公司);H2O2、CCK-8、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(中國碧云天試劑公司);β-肌動蛋白(β-actin)、Bcl-2、Caspase-3單抗(美國Epitmics公司);ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國millipore公司);脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司);二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(美國Thermo公司);miRNeasy Serum/plasma Kit、miScript SYBR Green PCR Kit、RNase-free ddH2O、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國QIAGEN公司)。RT-PCR檢測儀(美國ABI公司), 流式細(xì)胞儀(美國BD公司), 酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)。

        1. 2 細(xì)胞培養(yǎng) 配置含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基, 加入H9C2心肌細(xì)胞, 置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2~3 d細(xì)胞傳代1次。在實(shí)驗(yàn)前24 h取對數(shù)生長期的H9C2心肌細(xì)胞換液備用。

        1. 3 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 將培養(yǎng)好的H9C2心肌細(xì)胞分為空白對照組、陰性對照組、miR-1 inhibitor組、miR-499 mimics組。除空白對照組外, 陰性對照組、miR-1 inhibitor組、miR-499 mimics組H9C2心肌細(xì)胞分別采用隨機(jī)合成的miRNA片段、miR-1 inhibitor片段、miR-499 mimics片段通過脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染, 濃度均為200 nmol/L, 處理時間均為6 h。轉(zhuǎn)染結(jié)束后將細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 48 h后收集細(xì)胞。

        1. 4 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染情況 采用miRNeasy Serum/plasma Kit試劑盒提取血清RNA, 并檢測RNA的純度。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將miRNA逆轉(zhuǎn)錄為特定的cDNA, 并置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩T-PCR反應(yīng):應(yīng)用制備好的cDNA作為模版, 分別配置空白對照組、陰性對照組、miR-1 inhibitor組、miR-499 mimics組反應(yīng)管, 以U6作內(nèi)參。采用ABI 7500軟件分析熔解曲線, 用2-△Ct計(jì)算miRNA基因相對表達(dá)量。

        1. 5 實(shí)驗(yàn)分組及H2O2處理 設(shè)置空白對照組、H2O2組(未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的H9C2心肌細(xì)胞)、干預(yù)組A(miR-1 inhibitor轉(zhuǎn)染的H9C2心肌細(xì)胞)、干預(yù)組B(miR-499 mimics轉(zhuǎn)染的H9C2心肌細(xì)胞)、干預(yù)組C(miR-1 inhibitor+miR-499 mimics轉(zhuǎn)染的H9C2心肌細(xì)胞)。除空白對照組外, 其余四組H9C2心肌細(xì)胞均采用200 μmol/L的H2O2處理6 h。

        1. 6 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況 取對數(shù)生長期的H9C2心肌細(xì)胞, 接種到96孔板中(1×104個細(xì)胞/孔), 置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中, 培養(yǎng)12 h后, 待細(xì)胞貼壁, 將H2O2處理后的各組細(xì)胞加入貼壁均勻的96孔板中, 用CCK-8進(jìn)行處理并繼續(xù)置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2 h后震蕩5 min, 在570 nm波長處測定各組細(xì)胞的吸光度(OD)值。

        1. 7 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況 取H2O2處理后的各組細(xì)胞, 經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌后, 消化, 離心, 收集細(xì)胞。在收集到的細(xì)胞沉淀中加入200 ?l binding buffer并吹打成單細(xì)胞懸液, 再分別加入濃度為250 μg/ml的Annexin V-FITC和PI試劑各5 μl, 避光室溫下反應(yīng)5~15 min, 在1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

        1. 8 Western Blot檢測Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)水平 取H2O2處理后的各組細(xì)胞, 加入裂解液處理30 min, 收集蛋白并用蛋白質(zhì)定量(BCA)法測定蛋白濃度, 煮沸10 min使蛋白變性, 上樣, 按20 μg/泳道蛋白量經(jīng)12% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜), 以5%脫脂奶粉封閉60 min, 分別加入β-actin、Bcl-2、Caspase-3特異性抗體(均按照1∶1000稀釋), 4℃孵育過夜。次日用PBS-T液洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗, 室溫孵育2 h后增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)進(jìn)行顯色, 曝光后采用Image J軟件分析各個條帶的光密度, 目標(biāo)蛋白相對表達(dá)量=目標(biāo)條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

        1. 9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x-±s)表示, 兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn), 多組間比較采用單因素方差分析;計(jì)數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2. 1 各組轉(zhuǎn)染結(jié)果比較 miR-1 inhibitor組的心肌細(xì)胞miR-1表達(dá)明顯低于空白對照組和陰性對照組, miR-499 mimics組心肌細(xì)胞miR-499表達(dá)明顯高于空白對照組和陰性對照組, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)??瞻讓φ战M與陰性對照組的miR-1與miR-499表達(dá)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

        2. 2 各組心肌細(xì)胞增殖檢測結(jié)果比較 與空白對照組比較, H2O2組心肌細(xì)胞增殖顯著降低, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與H2O2組比較, 干預(yù)組A心肌細(xì)胞增殖和干預(yù)組B心肌細(xì)胞增殖均升高, 干預(yù)組C心肌細(xì)胞增殖進(jìn)一步升高, 但仍低于空白對照組, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

        2. 3 各組心肌細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果比較 與空白對照組比較, H2O2組細(xì)胞凋亡率顯著升高, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與H2O2組比較, 干預(yù)組A、干預(yù)組B細(xì)胞凋亡率均明顯降低, 干預(yù)組C細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步降低, 但仍高于空白對照組, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

        2. 4 各組心肌細(xì)胞Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較 與空白對照組比較, H2O2組心肌細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低, 而Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與H2O2組比較, 干預(yù)組A和干預(yù)組B的Bcl-2蛋白表達(dá)水平均明顯升高、Caspase-3蛋白表達(dá)水平均明顯降低, 但仍低于空白對照組, 而干預(yù)組C的Bcl-2蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步升高、Caspase-3蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步降低, 但仍高于空白對照組, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

        3 討論

        miRNA是一種非編碼RNA, 是可以影響轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)水平的調(diào)控分子[3]。人類基因組中約有30%基因受miRNA調(diào)控, 且同一種miRNA可能參與上百種基因的表達(dá)調(diào)節(jié)[4]。miRNA通過種子序列與信使RNA的3非翻譯區(qū)互補(bǔ)結(jié)合, 從而調(diào)控基因表達(dá)。miRNA轉(zhuǎn)錄后誘導(dǎo)沉默復(fù)合體, 抑制信使RNA翻譯, 或促進(jìn)其降解, 從而抑制蛋白質(zhì)翻譯[5]。研究發(fā)現(xiàn), 動物體內(nèi)表達(dá)多種miRNA, 參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及凋亡, 參與心血管疾病進(jìn)程[6]。

        在眾多凋亡基因中, Bcl-2蛋白家族發(fā)揮著重要作用, 是調(diào)控細(xì)胞線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵因子, 其中Bcl-2屬于抗凋亡蛋白[7, 8]。Bcl-2可維持鈣離子動態(tài)平衡、穩(wěn)定細(xì)胞線粒體膜、拮抗促凋亡蛋白表達(dá)、控制細(xì)胞色素C和其他凋亡因子釋放, 從而抑制細(xì)胞凋亡[9, 10]。有研究發(fā)現(xiàn), miR-1可通過抑制Bcl-2表達(dá)促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡[11]。

        Caspase-3屬于促凋亡蛋白, 是細(xì)胞凋亡過程的執(zhí)行者, 在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段及線粒體凋亡途徑中具有重要作用, 也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑的最終凋亡因子, 只有Caspase-3表達(dá)增高, 才能說明發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡。在心肌缺血缺氧狀態(tài)下, Caspase-3可激活其前體, 啟動細(xì)胞凋亡。有研究發(fā)現(xiàn), miR-1可通過正性調(diào)控Caspase-3促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12]。

        本次研究發(fā)現(xiàn), 轉(zhuǎn)染miR-1 inhibitor、miR-499 mimics心肌細(xì)胞, Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯升高, Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯降低, 而聯(lián)合干預(yù)的Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高幅度及Caspase-3蛋白表達(dá)水平降低幅度更為顯著, 提示miR-1可能是通過下調(diào)Bcl-2、上調(diào)Caspase-3蛋白發(fā)揮促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡作用, 而miR-499則相反, 通過上調(diào)Bcl-2、下調(diào)Caspase-3蛋白發(fā)揮抑制心肌細(xì)胞凋亡作用。

        綜上所述, miR-1與miR-499在心肌細(xì)胞增殖與凋亡過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用, 針對這兩個環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù)有望成為將來臨床治療心臟疾病的新途徑。

        參考文獻(xiàn)

        [1] Abbate A, Narula J. Role of apoptosis in adverse ventricular remodeling. Heart Fail Clin, 2012, 8(1):79-86.

        [2] Hata A. Functions of microRNAs in cardiovascular biology and disease. Annu Rev Physiol, 2013, 75(1):69-93.

        [3] Schober A, Weber C. Mechanisms of microRNAs in atherosclerosis. Annu Rev Pathol, 2016(11):583-616.

        [4] Samanta S, Balasubramanian S, Rajasingh S, et al. MicroRNA:a new therapeutic strategy for cardiovascular diseases. Trends Cardiovasc Med, 2016, 26(5):407-419.

        [5] Ryan BC, Lowe K, Hanson L, et al. Mapping the Pax6 3untranslated region microRNA regulatory landscape. BMC Genomics, 2018, 19(1):820.

        [6] Cheng HL, Fu CY, Kuo WC, et al. Detecting miRNA biomarkers from extracellular vesicles for cardiovascular disease with a microfluidic system. Lab Chip, 2018, 18(19):2917-2925.

        [7] Cvejic D, Selemetiev S, Savin S, et al. Apoptosis and proliferation related molecules(Bcl-2, Bax, p53, PCNA)in papillary microcarcinoma versus papillary carcinoma of the thyroid. Pathology, 2008, 40(5):475-480.

        [8] Youle RJ, Strasser A. The BCL-2 protein family:opposing activities that mediate cell death. Nature Reviews, 2008, 9(1):47-59.

        [9] Kvansakul M, Hinds MG. The Bcl-2 family:structures, interactions and targets for drug discovery. Apoptosis, 2015, 20(2):136-150.

        [10] Green DR, Kroemer G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science, 2004, 305(5684):626-629.

        [11] Shan ZX, Lin QX, Fu YH, et al. Upregulated expression of miR-1/miR-206 in a rat model of myocardial infarction. Biochem Biophys Res Commun, 2009, 381(4):597-601.

        [12] Nasser MW, Datta J, Nuovo G, et al. Down-regulation of miR-1 in lung cancer suppression of tumorigenic property of lung cancer cells and their sensitization to doxorubicin-induced apoptosis by miR-1. J Biol Chem, 2008, 283(48):33394-33405.

        [收稿日期:2020-01-21]

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