蔣潔　王丹妹　牛海艷　蔡仁?！∽T蓉　黃用豪

【摘要】 目的 為探討低相對(duì)分子質(zhì)量蛋白酶體（LMP）和抗原處理相關(guān)載體（TAP）基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）與甲狀腺癌易感性的關(guān)系， 為我國(guó)人類(lèi)基因組多樣性的研究提供理論依據(jù)。方法 124例甲狀腺癌患者設(shè)為病例組， 另選取111例健康人群設(shè)為對(duì)照組， 采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）對(duì)LMP2/LMP7/TAP1-1/TAP1-2基因中研究最多的四個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)片段（Codon60/Codon145/Codon333/Codon637）進(jìn)行檢測(cè)， 并對(duì)其易感性進(jìn)行分析。結(jié)果 遺傳多態(tài)性分析和單倍型聯(lián)合分析結(jié)果均表明， 四種多態(tài)性位點(diǎn)與甲狀腺癌的發(fā)生無(wú)顯著相關(guān)性（P>0.05）。結(jié)論 說(shuō)明選擇分析的Codon60/Codon145/Codon333/Codon637這四種多態(tài)性位點(diǎn)片段與甲狀腺癌的發(fā)生可能不存在關(guān)聯(lián)性。

【關(guān)鍵詞】 低相對(duì)分子質(zhì)量蛋白酶體;抗原處理相關(guān)載體;基因單核苷酸多態(tài)性;甲狀腺癌

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.13.041

低分子量蛋白酶體（Low Molecular Proteasome， LMP）和抗原處理相關(guān)運(yùn)載體（Transporter associated with Antigen?Processing， TAP）基因單核苷酸多態(tài)性與微生物感染和一系列免疫相關(guān)性疾病的發(fā)生有著密切關(guān)聯(lián)[1， 2]， 但目前國(guó)內(nèi)外的研究尚未有與甲狀腺癌感染的易感性關(guān)聯(lián)的報(bào)道， 為此本研究選取LMP2/LMP7/TAP1-1/TAP1-2基因中四個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)片段（Codon60/Codon145/Codon333/Codon637）， 對(duì)海南省疾病預(yù)防控制中心收集的124例甲狀腺癌患者進(jìn)行了SNP位點(diǎn)的檢測(cè)， 并對(duì)其進(jìn)行了易感性的關(guān)聯(lián)分析。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 納入2017年6月～2019年6月收治的124例甲狀腺癌患者設(shè)為病例組， 另選取同期體檢的111例健康人群設(shè)為對(duì)照組。病例組男28例， 女96例;年齡21～69歲， 平均年齡（44.9±12.0）歲。對(duì)照組男51例， 女60例;年齡21～71歲， 平均年齡（45.1±12.4）歲。對(duì)照組為在海南居住與病例組無(wú)直接血緣關(guān)系的健康人群， 經(jīng)病史詢(xún)問(wèn)以及常規(guī)體格檢查確定健康狀況良好， 無(wú)長(zhǎng)期用藥史， 無(wú)癌癥病史。本研究經(jīng)海南省疾病預(yù)防控制中心機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)批準(zhǔn)， 獲得書(shū)面知情同意。所有研究對(duì)象均由海南省疾病預(yù)防控制中心協(xié)助采集靜脈血。病例組和對(duì)照組的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征見(jiàn)表1。

1. 2 方法

1. 2. 1 提取基因組DNA 每例研究對(duì)象抽取靜脈血

2 ml， 使用全血DNA快速提取試劑盒（亞能生物）， 按照試劑盒操作說(shuō)明操作。

1. 2. 2 基因多態(tài)性分析 提取基因組DNA后， 利用引物對(duì)LMP基因和TAP基因的多態(tài)性進(jìn)行基因分型。采用采用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)上述四種多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)在50 μl反應(yīng)混合物進(jìn)行， 包括基因組DNA 4 μl， 10×PCR緩沖液5 μl， dNTPs（2.5 mM）4 μl， 每個(gè)特定引物2 μl， Taq DNA聚合酶（5 U/μl）0.5 μl和ddH2O 32.5 μl。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min， 然后94℃變性30 s，

57℃退火30 s， 72℃延伸30 s， 共35個(gè)循環(huán)， 最后在72℃延伸3 min（所有試劑均為T(mén)akara公司。PCR儀SureCycler8800為美國(guó)AGILENT公司）。擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)純化后， 取PCR產(chǎn)物10 μl（DNA約1 μg）， 在不同的條件下， 根據(jù)制造商的說(shuō)明， 使用特定的限制性?xún)?nèi)切酶消化。消化后的片段在2.5%瓊脂糖凝膠中電泳， 溴化乙錠染色。通過(guò)對(duì)所有多態(tài)位點(diǎn)的病例和對(duì)照組的隨機(jī)DNA樣本（n=10）進(jìn)行直接測(cè)序， 確定基因分型的準(zhǔn)確性。最后， 利用Phase1.0軟件構(gòu)建四種基因多態(tài)性的單倍型。

1. 3 觀察指標(biāo) 觀察分析PCR及酶切結(jié)果、Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果、單倍型與甲狀腺癌的相關(guān)性、 基因型、等位基因頻率和性別特異性相關(guān)分析、遺傳多態(tài)性與甲狀腺癌的相關(guān)性。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。采用χ2檢驗(yàn)驗(yàn)證病例組與對(duì)照組之間基因型頻數(shù)是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。多態(tài)性與甲狀腺癌癥之間的相關(guān)性以比值比（OR）及其95%置信區(qū)間（95%CI）表示， OR值及其95%CI以無(wú)條件邏輯回歸模型分析， 均經(jīng)年齡、性別等混雜因素校正， P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 PCR及酶切結(jié)果 本研究選擇了4個(gè)非同義編碼SNP。利用RFLP方法， 根據(jù)酶片段數(shù)目的不同， 確定基因型（純合子和雜合子）。LMP2擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)HhaI酶切后可觀察到3種不同的基因型：367 bp的多態(tài)純和型（Leu/Leu）， 208 bp和159 bp兩條區(qū)帶的野生純和型（Arg/Arg）;208 bp、159 bp和367 bp三條區(qū)帶的雜合型（Arg/Leu）。LMP7擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)BsmI酶切后可觀察到3種不同的基因型：351 bp的多態(tài)純和型（Lys/Lys）， 148 bp和203 bp兩條區(qū)帶的野生純和型（Gln/Gln）;148 bp、203 bp和351 bp三條區(qū)帶的雜合型（Lys/Gln）。TAP1-1擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Bcl-1酶切后可觀察到3種不同的基因型：430 bp的多態(tài)純和型（Val/Val）， 155 bp和275 bp兩條區(qū)帶的野生純和型（Ile/Ile）;155 bp、275 bp和430 bp三條區(qū)帶的雜合型（Val/Ile）。TAP1-2擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Acc I酶切后可觀察到3種不同的基因型：357 bp的多態(tài)純和型（Gly/Gly）， 94 bp和263 bp兩條區(qū)帶的野生純和型（Asp/Asp）;94 bp、263 bp和357 bp三條區(qū)帶的雜合型（Gly/Asp）。見(jiàn)表2。

2. 2 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 通過(guò)對(duì)病例組和對(duì)照組人群中4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析， 結(jié)果表明其等位基因頻數(shù)的分布沒(méi)有顯著偏離Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）。

2. 3 遺傳多態(tài)性與甲狀腺癌的相關(guān)性 4種多態(tài)性位點(diǎn)（LMP2/LMP7/TAP1-1/TAP1-2）的等位基因和基因型頻率在病例組和對(duì)照組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。LMP7 AA純合子的基因型頻率高于對(duì)照組， OR值5.3 [95%CI（0.5， 52.9）]， 但由于具有該基因型的樣本數(shù)太少而不具有統(tǒng)計(jì)意義。見(jiàn)表3。

2. 4 基因型、等位基因頻率和性別特異性相關(guān)分析

考慮到病例組和對(duì)照組在性別分布上的差異， 通過(guò)將男性和女性分開(kāi)來(lái)進(jìn)一步分析數(shù)據(jù)。當(dāng)樣本按性別分層時(shí)， 得到的結(jié)果與上述結(jié)果類(lèi)似， 雖然LMP7在男性組中比較P<0.05， 但由于樣本數(shù)量的限制， 認(rèn)為其不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其余多態(tài)性位點(diǎn)（LMP2/LMP7/TAP1-1/TAP1-2）的等位基因和基因型頻率在甲狀腺癌患者和對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表4。

2. 5 單倍型與甲狀腺癌的相關(guān)性 基于遺傳學(xué)的研究， 單個(gè)SNP的存在對(duì)于復(fù)雜性疾病的發(fā)生、發(fā)展未必是一個(gè)個(gè)分散性的作用， 相互之間可能存在一定的內(nèi)在關(guān)聯(lián)和相互作用。為了研究LMP/TAP基因中四個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的聯(lián)合作用， 進(jìn)行了單倍型聯(lián)合分析共有6種單倍體組合， 純和單倍體型出現(xiàn)的頻率相對(duì)較低， 而純合子單倍體型可能會(huì)增加單倍型頻率估計(jì)的不準(zhǔn)確性， 從而導(dǎo)致錯(cuò)誤的推斷， 因而統(tǒng)計(jì)將-/Haplotype和Haplotype/Haplotype合并， 并評(píng)估了整體單倍型分布于甲狀腺癌的關(guān)系。結(jié)果顯示， 甲狀腺癌與選取的LMP2/LMP7/TAP1-1/TAP1-2基因中四個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)片段（Codon60/Codon145/Codon333/Codon637）可能不存在關(guān)聯(lián)性。見(jiàn)表5， 表6。

3 討論

甲狀腺癌的發(fā)病原因及機(jī)制至今仍未闡明， 一般認(rèn)為在多基因遺傳的背景下， 由自身免疫紊亂所介導(dǎo)， 在感染、精神因素等環(huán)境因素作用下發(fā)病， 遺傳因素在發(fā)病機(jī)制中起重要作用[3]。有研究表明：甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展與某些基因及其基因的多態(tài)性有關(guān)[4， 5]， 如RET原癌基因、TSHR基因、BARF基因和RAS 基因等。近年來(lái)有研究顯示HLA-DQA1、DQB1是甲狀腺癌的易感基因， 但并不能完全解釋甲狀腺癌復(fù)雜的遺傳背景[5， 6]。自從發(fā)現(xiàn)LMP、TAP在內(nèi)源性抗原的處理、提呈中所起的關(guān)鍵作用以來(lái)， 已可見(jiàn)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道毒性彌漫性甲狀腺腫（GD）患者淋巴細(xì)胞內(nèi)的mRNA量減少且與其表面表面HLA-Ⅰ類(lèi)抗原表達(dá)減少程度平行;應(yīng)用雙色-間接免疫熒光技術(shù)觀察， 發(fā)現(xiàn)LMP2、LMP7過(guò)高表達(dá)且與HLA-Ⅰ類(lèi)抗原、TAP1過(guò)高平行[6， 7]。這兩項(xiàng)研究所得出不同結(jié)論或可用組織取材、人群差異等因素解釋?zhuān)?但在肯定LMP、TAP在GD發(fā)病中充當(dāng)一定角色這一方面是一致的， 同時(shí)亦提示LMP、TAP基因多態(tài)性所致的細(xì)胞表面HLA-Ⅰ類(lèi)抗原過(guò)低或過(guò)高表達(dá)， 使胚胎時(shí)期產(chǎn)生對(duì)自身抗原免疫耐受的缺失或自身免疫傾向而觸發(fā)了GD。為此本選擇研究了LMP2/LMP7/TAP1-1/TAP1-2基因中研究最多的四個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)片段（Codon60/Codon145/Codon333/Codon637）。

基于遺傳學(xué)的研究， 單個(gè)SNP的存在對(duì)于復(fù)雜性疾病的發(fā)生、發(fā)展未必是一個(gè)個(gè)分散性的作用， 相互之間可能存在一定的內(nèi)在關(guān)聯(lián)和相互作用， 而單倍型則是這種遺傳相互作用與關(guān)聯(lián)的體現(xiàn)， 所以對(duì)于單倍型的研究則能夠揭示多個(gè)LMPs和TAPs與疾病的易感關(guān)聯(lián)[8， 9]。但的研究結(jié)果表明LMP/TAP基因多態(tài)性與甲狀腺癌無(wú)顯著關(guān)聯(lián)性[10]。本研究收集了124例甲狀腺癌病例樣本， 樣本量大小適中， 因此該結(jié)果具有一定的可信度。但是SNP基因的多態(tài)性有著與種族、民族、個(gè)體差異、不同人群的疾病易感性和藥物治療的敏感性以及對(duì)環(huán)境反應(yīng)的分子基礎(chǔ)、地域分布頻率差異性， 因此LMP/TAP基因與甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] Nix P， Nicolaides A， Coatesworth AP. Thyroid cancer review： presentation and investigation of thyriod cancer. Int J ClinPract， 2005， 59（11）：1304-1344.

[2] Ferlay J， Bray F， Pisani P， et al. Cancer interplay incidence， Mortality and Prevalence Worldwide M. Lyon： IARC Press， 2001.

[3] 蘇智廣， 張思仲. 人類(lèi)基因組單核苷酸多態(tài)性的研究進(jìn)展. 生命的化學(xué)， 2001， 21（6）：452-455.

[4] 施靜藝， 陳賽娟. 藥物基因組學(xué)-指導(dǎo)合理用藥的基因組學(xué). 中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志， 2002， 19（2）：156-158.

[5] Ho T， Li G， Zhao C， et al. RET polymorphisms and haplotypes and risk of differentiated thyroid cancer. Laryngoscope， 2005， 115（6）： 1035-1041.

[6] 蔡夢(mèng)茵. LMP、TAP基因多態(tài)性與自身免疫病關(guān)系的研究進(jìn)展. 國(guó)外醫(yī)學(xué)內(nèi)科學(xué)分冊(cè)， 2001， 28（7）：294-297.

[7] 錢(qián)碧云， 陳可欣， 何敏， 等. 天津市區(qū)甲狀腺癌流行狀況調(diào)查. 中國(guó)腫瘤臨床， 2005， 32（4）：218-221.

[8] 王建華， 張濤. 上海市楊浦區(qū)2002-2006年甲狀腺癌發(fā)病情況分析. 中國(guó)初級(jí)衛(wèi)生保健， 2011， 24（1）：63-64.

[9] Iribarren C， Haselkorn T， Tekawa IS， et al. Cohort study of thyroid cancer in San Francisco Bay area population. Int J Cancer， 2001， 93（5）：745-750.

[10] Fehling HJ， Swat W， Laplace C， et al. MHC class Ⅰ expression in ice lacking the proteasome subunit LMP-7. Science， 1994（265）： 1234-1236.

[收稿日期：2020-01-15]