俞華芬

(余杭區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)站，杭州311100)

雌二醇、己烷雌酚、己烯雌酚、己二烯雌酚是結(jié)構(gòu)相近的人工合成雌激素，均含有酚羥基，為弱酸性化合物。由于其致癌作用[1]，歐盟(96/23/EC)已禁止使用，美國(guó)和加拿大則限量使用，我國(guó)農(nóng)業(yè)部在2002年第193號(hào)公告里明令禁止性激素和具有雌激素作用的物質(zhì)在食品動(dòng)物中的使用。國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)計(jì)劃每年均將雌二醇、己烷雌酚、己烯雌酚、己二烯雌酚等列為監(jiān)測(cè)對(duì)象，尤其是嬰兒配方奶粉中的雌二醇、己烷雌酚、己烯雌酚、己二烯雌酚更是監(jiān)測(cè)的重點(diǎn)對(duì)象。

目前乳制品中雌二醇、己烷雌酚、己烯雌酚、己二烯雌酚等4種雌激素的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法[2-3]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[4]。高效液相色譜法雖容易普及，但靈敏度低，且需要較為苛刻的條件才可使4種物質(zhì)完全分離，達(dá)到準(zhǔn)確定量的要求；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因具有極高的選擇性和靈敏度，可不要求高分離度亦可準(zhǔn)確定量，但該設(shè)備較為昂貴，普及率不及高效液相色譜法，且往往需要固相萃取及同位素內(nèi)標(biāo)，測(cè)定成本極高。

柱切換-液相色譜法[5]是近幾年興起的應(yīng)用于復(fù)雜基質(zhì)的測(cè)定方法，其主要特點(diǎn)是在線凈化、濃縮，在獲得較為理想的凈化效果和靈敏度的同時(shí)，簡(jiǎn)化了樣品的前處理步驟，達(dá)到降低測(cè)定成本及減少人為誤差的目的。文獻(xiàn)[6]應(yīng)用二維液相色譜法建立了配方奶粉中維生素B12的測(cè)定方法，該方法相比于傳統(tǒng)的免疫親和柱固相萃取-液相色譜法，測(cè)定周期縮短了40 min，測(cè)定成本降低了85%。本工作針對(duì)配方奶粉中的雌二醇、己烷雌酚、己烯雌酚、己二烯雌酚等4種雌激素建立了柱切換-液相色譜法，在獲得極高靈敏度的同時(shí)，大大降低了測(cè)定成本，可適用于一般實(shí)驗(yàn)室的日常風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Dionex UltiMate 3000 型高效液相色譜儀，配六通閥、大體積自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外檢測(cè)器；Beckman Coulter Allegra 64R 型高速離心機(jī)；Millipore Integral 3 型 超 純 水 裝 置；N-EVAP 112 型 氮 氣 吹干儀。

4種雌激素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:100.0 mg·L－1，分別稱取10.0 mg的雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品、己烷雌酚標(biāo)準(zhǔn)品、己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品、己二烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品，用適量的甲醇溶解并定容至100.0 m L。

4種雌激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:分別移取適量的4種雌激素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用甲醇稀釋配制成1.0，2.5，5.0，10，20 μg·L－1的 混 合 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液系列。

雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品、己烷雌酚標(biāo)準(zhǔn)品、己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品、己二烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品的純度依次為99.0%，98.5%，99.0%，99.5%。

甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲酸均為色譜純，試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

Thermo BioBasic SEC-120凈化柱(300 mm×7.8 mm，5μm)，Waters XBridge BEH C18分析柱(150 mm×4.6 mm，2.5μm)；樣品室溫度15 ℃，柱溫45 ℃；流量0.8 m L·min－1；進(jìn)樣量1.0 m L；測(cè)定波長(zhǎng)280 nm。流動(dòng)相:A 為水，B 為甲醇。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program

柱切換模式見(jiàn)圖1。

圖1中閥位置為1～2時(shí)，試驗(yàn)進(jìn)行系統(tǒng)平衡、分析，即開(kāi)啟凈化模式；當(dāng)閥位置切換為1～6時(shí)，試驗(yàn)進(jìn)行目標(biāo)物洗脫及收集，即開(kāi)啟分析模式。切換時(shí)間為0 min 時(shí)，閥位置為1～2；切換時(shí)間為15.0 min時(shí)，閥位置為1～6；切換時(shí)間為16.5 min時(shí)，閥位置為1～2。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取嬰兒配方奶粉樣品約5.0 g于50 m L帶蓋離心管中，加入10 m L 水超聲溶解后，加入20 m L乙腈，混勻后超聲提取30 min，以15 000 r·min－1轉(zhuǎn)速在5 ℃下離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液于另一離心管中。殘?jiān)?0 m L乙酸乙酯提取，合并兩次提取液，充分振蕩后靜置，待分層。轉(zhuǎn)移上層有機(jī)相，棄去下層水相，有機(jī)相于40 ℃下用氮?dú)獯抵两?，加? m L的50%(體積分?jǐn)?shù))甲醇溶液溶解，溶解液過(guò)0.22μm 濾膜，按儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。

圖1 柱切換模式Fig.1 Column switching mode

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

4種雌激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 4種雌激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.2 Chromatogram of mixed standard solution of 4 estrogens

2.2 分析柱的選擇

文獻(xiàn)[3]用Nova-Pak C18色譜柱(150 mm×3.9 mm，4μm)使原本較難分離的己烷雌酚、己烯雌酚和己二烯雌酚得到了較好的分離，但其使用的流動(dòng)相p H 為3.5，色譜柱柱溫為55 ℃，為色譜柱耐受的極限條件，不利于色譜柱的使用壽命。文獻(xiàn)[7]使用Xterra C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm)獲得了4種雌激素的分離，所使用的流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖溶液，該流動(dòng)相穩(wěn)定時(shí)間較長(zhǎng)，且極易造成色譜柱及管路系統(tǒng)的腐蝕、堵塞，實(shí)用性受限。考慮到此類(lèi)問(wèn)題后，試驗(yàn)嘗試僅用水和甲醇作為流動(dòng)相，對(duì)3種不同規(guī)格的分析柱進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 使用不同分析柱時(shí)4種雌激素的色譜圖Fig.3 Chromatograms of 4 estrogens with different analytical columns

由圖3 可知:Dionex Acclaim120 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm)的分離度較差，無(wú)法將4種目標(biāo)化合物進(jìn)行分離；Waters XBridge C8色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)較 之Dionex Acclaim120 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm)有顯著提高，但己烷雌酚和己烯雌酚未能達(dá)到完全分離，影響準(zhǔn)確定量；Waters XBridge BEH C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，2.5μm)的分離度最佳，4種目標(biāo)化合物均得到完全分離，完全滿足準(zhǔn)確定量的要求。原因主要為Waters XBridge BEH C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，2.5μm)的填料顆粒直徑為2.5μm，相比于其他色譜柱的5μm 填料具有更好的柱效，且填料使用了核殼技術(shù)，在相同的流量下具有更低的柱壓。試驗(yàn)選擇Waters XBridge BEH C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，2.5μm)作為分析柱(即第二根色譜柱)。

2.3 凈化柱的選擇

凈化柱(即第一根色譜柱)是用于樣品的凈化與富集，并與第二根色譜柱配合使用，也就要求其既具有高通量又要能與第二根色譜柱兼容。試驗(yàn)采用兩根流動(dòng)相體系可與反相C18兼容的凈化柱進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知:雖然兩者對(duì)目標(biāo)物均有較好的保留，但 Thermo BioBasic SEC-120 色 譜 柱(300 mm×7.8 mm，5μm)的效果較好，不僅將目標(biāo)物與部分雜質(zhì)分離，且峰形較為對(duì)稱，峰寬較窄，有利于后續(xù)操作；Agilent ZORBAX GF-250 色譜柱(250 mm×9.4 mm，4μm)的凈化效果不明顯，雜質(zhì)與目標(biāo)物基本共流出。因此，試驗(yàn)選擇Thermo BioBasic SEC-120 色 譜 柱(300 mm×7.8 mm，5μm)為凈化柱，目標(biāo)峰的截取時(shí)間為15.0～16.5 min。

2.4 提取溶劑的選擇

雌二醇、己烷雌酚、己烯雌酚和己二烯雌酚是強(qiáng)親脂性物質(zhì)，在甲醇、乙腈、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑中的溶解度較高。試驗(yàn)針對(duì)的是配方奶粉基質(zhì)，富含蛋白質(zhì)和脂肪，因此首選的提取溶劑為乙腈，其具有極佳的蛋白沉淀效果[8-9]。試驗(yàn)分別比較了乙腈提取1次、乙腈提取2次以及先乙腈提取，再乙酸乙酯提取對(duì)4種雌激素提取效率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5 可知:僅用乙腈提取1 次，提取效率僅50%左右，進(jìn)行2次提取后，提取效率明顯提高；先乙腈提取，再乙酸乙酯提取的效果要優(yōu)于兩次均用乙腈提取的效果。兩次乙腈提取的提取效率略低的原因可能是乙腈提取后需用鹽析使有機(jī)相與水相分離，有極少目標(biāo)物被包裹或吸附在固體鹽中。乙酸乙酯與水不互溶，將兩次提取液合并靜置數(shù)分鐘后，無(wú)需鹽析水相與有機(jī)相即可分離，因此可獲得較好的提取效率。試驗(yàn)選擇先乙腈提取，再乙酸乙酯提取。

圖4 使用不同凈化柱時(shí)4種雌激素的色譜圖Fig.4 Chromatograms of 4 estrogens with different purification columns

圖5 提取溶劑對(duì)4種雌激素提取效率的影響Fig.5 Effect of extraction solvent on extraction efficiency of 4 estrogens

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按儀器工作條件對(duì)1.0，2.5，5.0，10，20μg·L－1的4種雌激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:4種雌激素的質(zhì)量濃度均在1.0～20μg·L－1內(nèi)與其對(duì)應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系，線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。

以3倍信噪比計(jì)算方法的檢出限(3S/N)，以10倍信噪比計(jì)算方法的測(cè)定下限(10S/N)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和測(cè)定下限Tab.2 Linear regression equations，correlation coefficients，detection limits and lower limits of determination

2.6 精密度和回收試驗(yàn)

按試驗(yàn)方法對(duì)空白配方奶粉樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每天平行測(cè)定6次，重復(fù)測(cè)定11 d，計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3 可 知:回收率為90.0% ～105%，日內(nèi)RSD為1.6%～5.4%，日 間RSD 為3.5%～6.2%。

表3 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of tests for precision and recovery

2.7 方法比較

使用本方法及國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T 22992－2008對(duì)同一加標(biāo)的空白配方奶粉樣品(加標(biāo)量0.5μg·kg－1)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 本方法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的比較(n＝5)Tab.4 Comparison between the method and the GB method(n＝5)

由表4 可知:本方法相比于GB/T 22992－2008，時(shí)間可節(jié)省30%，費(fèi)用節(jié)省80%。本方法準(zhǔn)確度、精密度與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法相當(dāng)[10-11]。

本工作先用乙腈沉淀配方奶粉中的蛋白，再用乙酸乙酯提取、濃縮提取液，然后采用凝膠柱凈化、濃縮，反相C18分析柱分離，紫外檢測(cè)器測(cè)定，方法的靈敏度與穩(wěn)定性得到了大大的提高，而樣品的測(cè)定周期及測(cè)定成本卻顯著降低，非常適用于配方奶粉中雌二醇、己烷雌酚、己烯雌酚和己二烯雌酚等4種雌激素的測(cè)定。