劉慧 紅華

前列腺癌是常見的男性泌尿生殖系惡性腫瘤之一，在美國男性腫瘤中發(fā)病率第一，死亡率第二［1］。與歐美國家相比，我國目前雖是前列腺癌發(fā)生的低危國家，但其發(fā)病率及死亡率亦逐年上升，且患者確診時多為較晚期病變，致其預(yù)后顯著低于歐美國家［2］，故早期診斷前列腺癌尤為重要。超聲造影能客觀反映腫瘤組織的血流灌注情況。Ki-67蛋白是腫瘤細(xì)胞增殖的標(biāo)記物，也可以作為前列腺癌獨立的預(yù)后參數(shù)［3］。目前關(guān)于超聲造影參數(shù)與Ki-67蛋白表達(dá)間關(guān)系的研究較少。本研究旨在分析前列腺癌超聲造影參數(shù)與Ki-67蛋白表達(dá)的相關(guān)性，以期為臨床評估前列腺癌腫瘤細(xì)胞增殖度、預(yù)測患者預(yù)后提供影像學(xué)參考。

資料與方法

一、研究對象

選取2015年7月至2019年6月于我院經(jīng)直腸前列腺穿刺活檢并確診為前列腺癌的男性患者95例，年齡45～87歲，平均（71.8±7.6）歲；前列腺特異性抗原（PSA）水平0.02～778.20 ng/ml，平均（17.59±100.00）ng/ml。入選標(biāo)準(zhǔn)：①前列腺MRI或超聲造影異常；②超聲引導(dǎo)靶向穿刺及系統(tǒng)穿刺結(jié)果均提示為前列腺癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他惡性腫瘤患者；②嚴(yán)重心肺疾病患者及其他造影及穿刺禁忌癥；③近期內(nèi)均未對前列腺進(jìn)行刺激性檢查。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

二、儀器與方法

1.超聲造影檢查及其引導(dǎo)下穿刺：使用Philips iU 22彩色多普勒超聲診斷儀，變頻經(jīng)直腸端掃式探頭，頻率5～10 MHz；配以專用穿刺架、18 G活檢針及美國Bard公司生產(chǎn)自動活檢槍；機械指數(shù)0.11～0.13。應(yīng)用經(jīng)直腸二維超聲觀察前列腺整體情況，結(jié)合MRI結(jié)果確定超聲造影平面，然后進(jìn)行超聲造影檢查。將SonoVue造影劑（意大利Barcco公司）用5.0 ml生理鹽水稀釋并輕微搖晃使其充分混合后，經(jīng)肘靜脈團(tuán)注2.4 ml，注射速度約為1～2 ml/s，隨后靜脈推注5.0 ml生理鹽水沖管，速度2 ml/s，同時儲存至少3 min的動態(tài)圖像。觀察圖像增強模式，并確定出異常增強區(qū)域，應(yīng)用QLAB軟件分析儲存的造影圖像異常增強區(qū)域的超聲造影時間-強度曲線形態(tài)，記錄定量參數(shù)，包括：上升時間（RT）、峰值強度（PI）、平均通過時間（MTT）、曲線下面積（AUC）、強度降半時間（HT）、上升支斜率（WIS）、達(dá)峰時間（TTP）。以上操作均由兩名經(jīng)驗豐富的超聲醫(yī)師協(xié)商進(jìn)行。最后行超聲造影引導(dǎo)下經(jīng)直腸前列腺穿刺活檢術(shù)，用18 G穿刺針分別在前列腺左右葉內(nèi)外腺的底、中、尖進(jìn)行12針系統(tǒng)穿刺，隨后對造影異常增強區(qū)域加穿1～2針，并標(biāo)記位置后送病理。所選標(biāo)本行病理穿刺的部位應(yīng)與超聲造影異常增強區(qū)域QLAB分析取點盡可能一致。

2.超聲造影增強模式判斷標(biāo)準(zhǔn)：①彌漫性增強，前列腺內(nèi)外腺分界不清，呈彌漫均勻性增強，造影劑流入為快速進(jìn)入，快速消退；②結(jié)節(jié)性增強，即前列腺局部區(qū)域呈高增強，造影劑流入為快速進(jìn)入，快速消退；③不均勻性增強，前列腺內(nèi)外腺分界不清，呈彌漫不均勻性增強，內(nèi)可見不規(guī)則低增強或無增強的區(qū)域；④無異常增強，即前列腺內(nèi)外腺均勻性增強，分界清晰。超聲造影異常區(qū)域判斷標(biāo)準(zhǔn)：①注射造影劑后相對其他區(qū)域快速對比增強；②增強病灶與鄰近組織相比對比增強且快速消退；③邊界不清的病變無增強或低增強。

3.Ki-67蛋白表達(dá)檢測及分組：對取樣組織標(biāo)本進(jìn)行Ki-67免疫組織化學(xué)染色。Ki-67蛋白經(jīng)免疫組化染色后出現(xiàn)黃色、棕黃色、棕褐色顆粒為Ki-67表達(dá)陽性，反之為陰性或未表達(dá)。Ki-67蛋白分級標(biāo)準(zhǔn)：①陰性（-）：陽性細(xì)胞數(shù)＜5%；②弱陽性（+）：陽性細(xì)胞數(shù)5%～25%；③陽性（++）：陽性細(xì)胞數(shù)26%～50%；④強陽性（+++）：陽性細(xì)胞數(shù)＞50%。根據(jù)Ki-67蛋白表達(dá)檢測結(jié)果分組：陰性組40例（陰性表達(dá)）、低表達(dá)組40例（弱陽性表達(dá)）和高表達(dá)組15例（陽性和強陽性表達(dá)）。陰性組、低表達(dá)組及高表達(dá)組患者的年齡、PSA水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，不服從正態(tài)分布的計量資料以M（Q1～Q3）表示，組間比較行Kruskal-Wallis H檢驗，兩兩比較采用Bonferroni校正法。Ki-67蛋白表達(dá)與造影定量參數(shù)的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析。繪制超聲造影參數(shù)診斷Ki-67蛋白表達(dá)的受試者工作特征（ROC）曲線，確定其截斷值并計算其診斷效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、超聲造影表現(xiàn)和異常增強區(qū)域的時間-強度曲線分析

95例前列腺癌超聲造影患者中，55例造影模式為不均質(zhì)增強，表現(xiàn)為前列腺內(nèi)外腺分界不清，呈彌漫不均勻性增強，內(nèi)可見不規(guī)則低增強或無增強的區(qū)域；20例為結(jié)節(jié)性增強，表現(xiàn)為前列腺局部區(qū)域呈高增強，呈快進(jìn)快退模式；20例為彌漫性增強，表現(xiàn)為前列腺內(nèi)外腺分界不清，呈彌漫均勻性增強，呈快進(jìn)快退模式。異常增強區(qū)域的時間-強度曲線形態(tài)：48例表現(xiàn)為快速上升，快速下降；43例表現(xiàn)為快速上升，緩慢下降；4例表現(xiàn)為低增強緩慢上升，緩慢下降。

二、各組超聲造影異常增強區(qū)域的時間-強度曲線參數(shù)比較

各組間超聲造影參數(shù)AUC、PI、HT、MTT、WIS比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；RT、TTP比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。組間兩兩比較，低表達(dá)組PI、AUC、HT高于陰性組，高表達(dá)組PI、MTT、AUC、HT、WIS高于陰性組，高表達(dá)組MTT、AUC、HT、WIS高于低表達(dá)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見圖1～3和表1。

三、超聲造影參數(shù)與Ki-67蛋白表達(dá)相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，超聲造影參數(shù)AUC、PI、HT、MTT與Ki-67蛋白表達(dá)均呈正相關(guān)（r=0.657、0.537、0.503、0.407，均P＜0.05），其中AUC相關(guān)性最高，隨Ki-67蛋白表達(dá)增加呈上升趨勢；WIS、RT、TTP與Ki-67蛋白表達(dá)均無相關(guān)性。見表2。

圖1 陰性表達(dá)組異常增強區(qū)域超聲造影時間-強度曲線圖和免疫組化圖

圖2 低表達(dá)組異常增強區(qū)域超聲造影時間-強度曲線圖和免疫組化圖

圖3 高表達(dá)組異常增強區(qū)域超聲造影時間-強度曲線圖和免疫組化圖

四、ROC曲線分析

超聲造影參數(shù)AUC、PI、HT診斷Ki-67蛋白陽性表達(dá)的截斷值分別為479.44 dBs、7.71 dB、49.48 s，其ROC曲線下面積分別為0.848、0.793、0.752，其中AUC和PI的診斷敏感性較高，分別為83.64%、85.45%，特異性分別為73.24%、60.56%，見圖4和表3。

表1 超聲造影異常增強區(qū)域的時間-強度曲線參數(shù)比較［M（Q1～Q3）］

表2 超聲造影參數(shù)與Ki-67蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

圖4 超聲造影參數(shù)診斷Ki-67蛋白陽性表達(dá)的ROC曲線圖

表3 超聲造影參數(shù)鑒別Ki-67蛋白陰陽性表達(dá)的效能

討 論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜、多步驟、多因素相互作用的動態(tài)過程，腫瘤血管的形成是前列腺癌生長與轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，與患者預(yù)后密切相關(guān)［4］。超聲造影能客觀反映組織灌注情況，敏感地顯示與前列腺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的新生血管［5］。前列腺癌疾病的局部控制取決于腫瘤的增殖活性和血管生成的程度［6］，既往實驗和臨床數(shù)據(jù)［7-8］表明，腫瘤細(xì)胞的增殖與血管生成有關(guān)。Ki-67蛋白可作為判定腫瘤增殖活性的主要標(biāo)記，指數(shù)越高則其腫瘤分化程度、浸潤、轉(zhuǎn)移及預(yù)后越差［9］。本研究通過分析超聲造影參數(shù)與Ki-67蛋白表達(dá)的相關(guān)性，旨在初步判斷腫瘤的增殖活性和腫瘤血管生成情況。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陰性組、低表達(dá)組和高表達(dá)組PI、MTT、AUC、HT比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），且均與Ki-67蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，尤以PI和AUC相關(guān)性最高（r=0.537、0.657，均P＜0.05）。分析原因可能是由于Ki-67與血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中的協(xié)同作用，腫瘤的增殖能力越強，VEGF分泌越多，則形成更多的新生血管，隨之促進(jìn)了腫瘤的增殖；隨著腫瘤惡性程度的增加，腫瘤新生血管增多，局部形成動靜脈瘺、滋養(yǎng)血管［10］，注入造影劑后微泡迅速到達(dá)腫瘤部位血管內(nèi)，使造影劑在短時間內(nèi)大量聚集于病灶，速度快且單位時間造影劑流入量明顯增多，故時間-強度曲線形態(tài)表現(xiàn)為快速上升，快速下降。另外，不同部位腫瘤增殖程度不同，導(dǎo)致超聲造影模式表現(xiàn)不同，前列腺癌是顯著的異質(zhì)性腫瘤，主要以不均質(zhì)增強為主，由于腫瘤細(xì)胞增生引起的前列腺內(nèi)血管壓力增高、細(xì)胞形態(tài)和排列不規(guī)則引起的結(jié)構(gòu)異常、器官高度壓縮及腫瘤新生血管與正常血管不同，新生血管中無平滑肌，降低了管壁的彈性，呈不規(guī)則的分支，迂曲擴張、粗細(xì)不均，易形成癌栓，增加回流的阻力［10-11］，可能導(dǎo)致造影劑在這些部位中的停留時間延長，時間-強度曲線形態(tài)則表現(xiàn)為快速上升，緩慢下降。超聲造影參數(shù)WIS、RT、TTP與Ki-67蛋白表達(dá)均無相關(guān)性，這可能與本研究樣本量少，且前列腺癌是顯著異質(zhì)性腫瘤有關(guān)。綜合以上分析，本研究結(jié)果提示超聲造影可以作為預(yù)測前列腺癌惡性程度的一項潛在性指標(biāo)，與既往研究［12-14］結(jié)果基本一致。

本研究篩選出各組具有相關(guān)性的造影參數(shù)，并繪制其鑒別Ki-67蛋白陽性表達(dá)的ROC曲線，結(jié)果提示AUC、PI、HT的ROC曲線下面積分別為0.848、0.793、0.752，截斷值分別為479.44 dBs、7.71 dB、49.48 s，說明超聲造影參數(shù)AUC、PI、HT在截斷值范圍內(nèi)，可以反映其對應(yīng)的時間-強度曲線形態(tài)特征，對于鑒別前列腺癌Ki-67蛋白陽性表達(dá)有較高的準(zhǔn)確率，提示超聲造影參數(shù)可為無創(chuàng)評估前列腺癌腫瘤細(xì)胞增殖程度及腫瘤血管生成提供一定的影像學(xué)依據(jù)。

綜上所述，超聲造影時間-強度曲線定量參數(shù)AUC、PI、HT與Ki-67蛋白表達(dá)均有相關(guān)性，為無創(chuàng)評估前列腺癌的腫瘤細(xì)胞增殖程度及腫瘤血管生成提供一定的依據(jù)，可為預(yù)測腫瘤惡性程度及預(yù)后提供影像學(xué)補充，具有一定的臨床應(yīng)用價值。