張虹 陳穎平 陳圣文

白內(nèi)障是全球致盲和視力損害的重要原因[1]，其主要是由晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells，LECs)損傷引起的晶狀體混濁[2]。研究表明，miR-155-5p在結(jié)核性腦膜炎[3]、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)[4]和病毒性心肌炎[5]患者血漿或血清中的表達(dá)量均顯著升高，是RA潛在診斷指標(biāo)，可加重心肌細(xì)胞損傷并促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，說明miR-155-5p對細(xì)胞炎癥損傷有重要作用。本研究通過TargetScan預(yù)測發(fā)現(xiàn)，相對分子質(zhì)量為15 000的硒蛋白(15 000 Selenoprotein，SEP15)可能是miR-155-5p的靶基因。SEP15基因敲除的小鼠在出生1.5個(gè)月后就出現(xiàn)顯著的核性白內(nèi)障，表明SEP15為小鼠眼晶狀體正常發(fā)育和生長所必需[6]。SEP15基因沉默加劇了高糖在LECs分化過程中對整合素的影響，說明SEP15對LECs的分化具有相應(yīng)的保護(hù)作用[7]。SEP15基因敲減可促進(jìn)衣霉素誘導(dǎo)的HLECs的凋亡和氧化應(yīng)激[8]。但miR-155-5p及SEP15在H2O2誘導(dǎo)的人LECs(HLECs)中的表達(dá)、兩者關(guān)系及對HLECs細(xì)胞損傷的影響目前還不清楚。本研究通過建立HLECs細(xì)胞系HLE-B3的H2O2損傷模型，研究miR-155-5p對H2O2誘導(dǎo)的HLE-B3細(xì)胞損傷、凋亡的影響，并探討SEP15在此機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料HLE-B3購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和高糖DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胰蛋白酶Trypsin購自美國Sigma-Aldrich公司；丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)ELISA檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)購自美國Promega公司；Total RNA提取試劑盒、Real-time PCR 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；引物、miR-155-5p類似物、miR-155-5p抑制劑(anti-miR-155-5p)、SEP15干擾物(si-SEP15)、對照物(miR-NC、anti-miR-NC和si-NC)及pcDNA購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；抗SEP15、抗Bcl-2、抗Bax和抗Cleaved-caspase-3抗體購自英國Abcam公司；雙染色流式法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，發(fā)光儀、光學(xué)顯微鏡、全自動酶標(biāo)儀及Real-time PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)HLE-B3細(xì)胞培養(yǎng)于含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃含體積分?jǐn)?shù)5% CO2恒溫密閉培養(yǎng)箱中，飽和濕度。待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時(shí)，胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組和細(xì)胞H2O2模型構(gòu)建將細(xì)胞隨機(jī)分為3組，對照組：以正常DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；H2O2組：建立H2O2模型；H2O2+轉(zhuǎn)染組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后建立H2O2模型。H2O2模型建立方法：將對數(shù)生長期的HLE-B3細(xì)胞稀釋為1×106個(gè)·mL-1，接種于6孔板，加入100 μmol·L-1H2O2培養(yǎng)12 h。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染后進(jìn)一步分組為：H2O2+anti-miR-NC組、H2O2+anti-miR-155-5p組、H2O2+pcDNA組、H2O2+pcDNA-SEP15組、miR-NC組、miR-155-5p組、H2O2+anti-miR-155-5p+si-NC組、H2O2+anti-miR-155-5p+si-SEP15組，先用無血清OptiMEM培養(yǎng)液稀釋Lipofectamine 2000和各組載體或片段，將等體積的脂質(zhì)體和各組載體混合，室溫孵育20 min，將混合液加入培養(yǎng)好的HLE-B3細(xì)胞中，混合均勻，培養(yǎng)6 h后換成DMEM完全培養(yǎng)液，48 h后收集細(xì)胞，鑒定無誤后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 Real-time PCR檢測RNA的表達(dá)收集對照組、H2O2組、H2O2+轉(zhuǎn)染組的各組HLE-B3細(xì)胞，用Total RNA試劑盒提取細(xì)胞總RNA。然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，測定濃度和純度，-80 ℃保存。以cDNA為模板按照Real-time PCR試劑盒的說明書進(jìn)行反應(yīng)，miR-155-5p引物為5’-TTAATGC TAATCGTGATAGGGGT-3’；SEP15 上 游 引 物 為5’-GGGGTACCATGGCGGCTGGGCGAGT-3’，下 游 引 物 為5’-GCTCTAGAATGATCCTTTTAAATGGACTTTTCTG-3’；反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 2 min；95 ℃ 45 s、58 ℃ 40 s、72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。用2-ΔΔCt進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率將各組HLE-B3細(xì)胞接種于6孔板中(每孔100×103個(gè)細(xì)胞)，培養(yǎng)24 h，離心收集細(xì)胞，洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)·mL-1，根據(jù)凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，取100 μL標(biāo)記緩沖液重懸細(xì)胞，然后加入 5 μL 膜聯(lián)蛋白V-FITC和 10 μL碘化丙啶，室溫避光20 min，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 ELISA檢測細(xì)胞中MDA、SOD和GSH-Px的含量收集各組HLE-B3細(xì)胞，PBS緩沖液洗滌2次，加入細(xì)胞裂解液裂解20 min，離心取上清，按照MDA、SOD和GSH-Px的ELISA試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞內(nèi)MDA、SOD和GSH-Px的含量。

1.2.7 雙熒光素酶檢測實(shí)驗(yàn)根據(jù)雙熒光素酶檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，收集轉(zhuǎn)染后的HLE-B3細(xì)胞，消化稀釋，以每孔20×103個(gè)細(xì)胞接種于24孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合為一層時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將構(gòu)建的含有miR-155-5p與SEP15預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)的野生型(WT-SEP15)和突變型(MUT-SEP15)雙熒光素酶報(bào)告載體，分別共轉(zhuǎn)染miR-NC或miR-155-5p。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，室溫裂解20 min，離心收集上清，加入熒光素酶底物，以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參照，測定相對螢火蟲熒光素酶活性。

1.2.8 Western blot檢測SEP15和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)收集各組HLE-B3細(xì)胞，加入裂解液孵育20 min，冰浴超聲破碎細(xì)胞，收集蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE，PVDF轉(zhuǎn)膜，50 g·L-1脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗(抗SEP15抗體 11000，抗Bcl-2抗體 1400，抗Bax抗體 1800，抗Cleaved-caspase-3抗體1500)4 ℃孵育過夜，PBST洗膜2次，加入稀釋的二抗室溫孵育2 h，以GAPDH為內(nèi)參照，分析蛋白水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 SPSS 17.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn):α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 miR-155-5p和SEP15在H2O2誘導(dǎo)的HLE-B3中的表達(dá)Western blot和Real-time PCR檢測結(jié)果表明，與對照組相比，H2O2組HLE-B3中miR-155-5p表達(dá)量顯著升高(P=0.000)，SEP15的mRNA含量和蛋白表達(dá)量均顯著降低(均為P=0.000)。見表1。

表1 miR-155-5p和SEP15在H2O2誘導(dǎo)的HLE-B3中的表達(dá)

組別miR-155-5pSEP15 mRNA SEP15蛋白對照組1.02±0.091.01±0.080.53±0.05H2O2組2.93±0.280.41±0.040.18±0.02t值15.90811.61911.257P值0.0000.0000.000

2.2 抑制miR-155-5p表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的HLE-B3氧化損傷的影響Real-time PCR、ELISA檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，H2O2組HLE-B3細(xì)胞中miR-155-5p表達(dá)量、MDA含量均顯著升高(均為P<0.05)，SOD活性和GSH-Px含量均顯著降低(均為P<0.05)；與H2O2+anti-miR-NC組相比，H2O2+anti-miR-155-5p組的miR-155-5p表達(dá)量、MDA含量均顯著降低(均為P<0.05)，SOD活性和GSH-Px含量均顯著升高(均為P<0.05)。說明H2O2處理后，HLE-B3顯著損傷；抑制miR-155-5p表達(dá)可減輕H2O2誘導(dǎo)的HLE-B3的損傷，提高細(xì)胞的抗氧化能力。見表2。

2.3 抑制miR-155-5p表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的HLE-B3凋亡的影響Western blot和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對照組相比，H2O2組的抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，凋亡蛋白Bax和Cleaved-caspase-3表達(dá)量及細(xì)胞凋亡率均顯著升高(均為P<0.05)；與H2O2+anti-miR-NC組相比，H2O2+anti-miR-155-5p組的抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，凋亡蛋白Bax和Cleaved-caspase-3表達(dá)量及細(xì)胞凋亡率均顯著下降(均為P<0.05)。說明H2O2可促進(jìn)HLE-B3凋亡，抑制miR-155-5p可抑制HLE-B3的凋亡。見表3。

表2 抑制miR-155-5p表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的HLE-B3氧化損傷的影響

組別miR-155-5p相對表達(dá)量MDA/nmol·mL-1SOD/U·mL-1GSH-Px/U·mL-1對照組1.02±0.0945.21±4.2581.42±8.34169.37±8.67H2O2組2.93±0.28?91.56±9.27?39.68±3.57?72.65±7.28?H2O2+anti-miR-NC組2.91±0.2996.73±8.7736.92±3.6568.28±7.37H2O2+anti-miR-155-5p組1.68±0.17#59.64±5.36#68.84±6.37#143.69±8.72#F值53.861215.445169.091479.430P值0.0000.0000.0000.000

注：與對照組比較，*P<0.05；與H2O2+anti-miR-NC組比較，#P<0.05

表3 抑制miR-155-5p表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的HLE-B3凋亡的影響

組別細(xì)胞凋亡率/%表達(dá)量Bcl-2蛋白Bax蛋白Cleaved-caspase-3蛋白對照組8.16±0.830.68±0.060.28±0.030.26±0.03H2O2組23.41±2.11?0.32±0.03?0.72±0.07?0.64±0.06?H2O2+anti-miR-NC組25.68±2.340.29±0.030.74±0.060.66±0.07H2O2+anti-miR-155-5p組12.69±1.28#0.54±0.05#0.42±0.04#0.38±0.04#F值277.061209.165224.582169.164P值0.0000.0000.0000.000

注：與對照組比較，*P<0.05；與H2O2+anti-miR-NC組比較，#P<0.05

2.4 SEP15過表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的HLE-B3損傷的影響與對照組相比，H2O2組的SEP15蛋白表達(dá)量、Bcl-2蛋白表達(dá)量均顯著下降(均為P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)量和細(xì)胞凋亡率均顯著升高(均為P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)，SOD活性和GSH-Px含量均顯著降低(均為P<0.05)；與H2O2+pcDNA組相比，H2O2+pcDNA-SEP15組的SEP15蛋白表達(dá)量、Bcl-2蛋白表達(dá)量均顯著升高(均為P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)量和細(xì)胞凋亡率均顯著下降(均為P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)，SOD活性和GSH-Px含量均顯著升高(均為P<0.05)。見表4。

表4 SEP15過表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的HLE-B3損傷的影響

組別表達(dá)量SEP15蛋白Bcl-2蛋白Bax蛋白MDA/nmol·mL-1SOD/U·mL-1GSH-Px/U·mL-1細(xì)胞凋亡率/%對照組0.53±0.050.69±0.060.27±0.0342.65±4.1387.31±8.25174.65±9.347.65±0.74H2O2組0.18±0.02?0.31±0.03?0.71±0.07?93.51±9.39?34.69±3.43?69.34±6.71?21.49±2.07?H2O2+pcDNA組0.19±0.030.29±0.030.73±0.0798.52±8.9331.37±3.5263.49±6.8723.65±2.17H2O2+pcDNA-SEP15組0.51±0.05#0.48±0.04#0.41±0.04#67.93±3.21#58.63±5.34#126.98±9.34#14.67±1.52#F值226.593215.494183.772163.100266.635496.554212.168P值0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.000

注：與對照組比較，*P<0.05；與H2O2+pcDNA組比較，#P<0.05

2.5 miR-155-5p靶向調(diào)控SEP15的表達(dá)通過Targetscan預(yù)測發(fā)現(xiàn)，SEP15的3’UTR序列中含有與miR-155-5p互補(bǔ)的核苷酸序列。雙熒光素酶檢測結(jié)果顯示，與miR-NC組野生型WT-SEP15的螢火蟲熒光素酶相對活性1.02±0.09相比，miR-155-5p組野生型WT-SEP15的螢火蟲熒光素酶相對活性顯著下降，為0.39±0.03(P=0.000)；而miR-155-5p組突變型MUT-SEP15的螢火蟲熒光素酶相對活性為1.03±0.09，與miR-NC組的1.05±0.08相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.407)。Western blot檢測結(jié)果顯示，與miR-NC組的SEP15蛋白相對表達(dá)量0.54±0.05相比，miR-155-5p組的SEP15蛋白相對表達(dá)量顯著下降，為0.21±0.03(P<0.05)；與anti-miR-NC組的SEP15蛋白相對表達(dá)量0.52±0.05相比，anti-miR-155-5p組的SEP15蛋白相對表達(dá)量顯著上升，為 0.91±0.08(P<0.05)。說明miR-155-5p靶向負(fù)調(diào)控SEP15的表達(dá)。

2.6 抑制SEP15表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制miR-155-5p表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的HLE-B3損傷的影響與H2O2+anti-miR-NC組相比，H2O2+anti-miR-155-5p組的SEP15、Bcl-2蛋白表達(dá)量均顯著升高(均為P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)量和細(xì)胞凋亡率均顯著下降(均為P<0.05)，細(xì)胞中MDA含量顯著下降(P<0.05)，SOD活性和GSH-Px含量均顯著升高(均為P<0.05)。與H2O2+anti-miR-155-5p+si-NC組相比，H2O2+anti-miR-155-5p+si-SEP15組的SEP15、Bcl-2蛋白表達(dá)量均顯著下降(均為P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)量和細(xì)胞凋亡率均顯著上升(均為P<0.05)，細(xì)胞中MDA含量顯著升高(P<0.05)，SOD活性和GSH-Px含量均顯著降低(均為P<0.05)。說明抑制SEP15表達(dá)可逆轉(zhuǎn)抑制miR-155-5p對H2O2誘導(dǎo)的HLE-B3的損傷作用。見表5。

表5 抑制SEP15表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制miR-155-5p表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞損傷的影響

組別表達(dá)量SEP15蛋白Bcl-2蛋白Bax蛋白MDA/nmol·mL-1SOD/U·mL-1GSH-Px/U·mL-1細(xì)胞凋亡率/%H2O2+anti-miR-NC組0.19±0.020.25±0.030.73±0.0797.15±9.2434.39±3.5265.39±6.4224.37±2.32H2O2+anti-miR-155-5p組0.58±0.05?0.59±0.06?0.38±0.04?55.34±5.41?69.34±6.25?151.65±9.47?11.65±1.18?H2O2+anti-miR-155-5p+si-NC組0.61±0.060.63±0.060.36±0.0352.67±5.3672.81±7.11159.37±10.2410.84±1.13H2O2+anti-miR-155-5p+si-SEP15組0.39±0.04#0.62±0.06#0.32±0.03#76.68±6.27#49.65±4.28#78.37±7.33#18.35±1.69#F值269.189156.206144.400113.517128.540392.866177.138P值0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.000

注：與H2O2+anti-miR-NC組比較，*P<0.05；與H2O2+anti-miR-155-5p+si-NC組比較，#P<0.05

3 討論

白內(nèi)障是最常見的眼部疾病，老年性白內(nèi)障大約占白內(nèi)障的80%[9-10]。目前的研究結(jié)果表明，白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制是氧化損傷、細(xì)胞凋亡和晶狀體蛋白變性等[11]，HLECs的氧化損傷和細(xì)胞凋亡機(jī)制是這一領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，對預(yù)防和治療白內(nèi)障具有指導(dǎo)意義。有研究表明，miRNA，如miR-34a、miR-15a、miR-16-1-5p、miR-16-1-3p、miR-125b、Let-7等，通過調(diào)控HLECs凋亡和衰老參與白內(nèi)障的發(fā)生和發(fā)展[12]。miR-155參與眼部組織的生長發(fā)育和功能調(diào)節(jié)等過程，與角膜病、干眼癥、葡萄膜炎、視網(wǎng)膜疾病、甲狀腺相關(guān)眼病及眼腫瘤等均有關(guān)[13]。Derrick等[14]發(fā)現(xiàn)，在濾泡沙眼中miR-155表達(dá)上調(diào)，與沙眼炎癥嚴(yán)重程度相關(guān)。Wolf 等[15]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF2誘導(dǎo)的大鼠LECs分化過程晚期，高表達(dá)的miR-155靶向下調(diào)分化因子c-Maf的表達(dá)，在晶狀體纖維細(xì)胞終末分化后期發(fā)揮作用。以上結(jié)果均表明，miR-155在眼病中具有重要作用，但miR-155-5p在H2O2誘導(dǎo)的HLECs損傷中的表達(dá)情況及作用尚不清楚。本研究通過H2O2誘導(dǎo)HLECs細(xì)胞系HLE-B3的結(jié)果表明，miR-155-5p在H2O2誘導(dǎo)后的HLE-B3細(xì)胞中表達(dá)顯著升高，與Derrick 等[14]研究結(jié)果一致，抑制miR-155-5p表達(dá)可降低MDA含量，升高SOD活性和GSH-Px含量，減輕H2O2誘導(dǎo)的HLE-B3細(xì)胞損傷，抑制細(xì)胞凋亡，說明miR-155-5p在HLECs氧化損傷中發(fā)揮重要作用。

本研究通過Targetscan預(yù)測發(fā)現(xiàn)，SEP15的3’UTR 中含有與miR-155-5p互補(bǔ)的核苷酸序列，提示miR-155-5p與SEP15可能存在結(jié)合位點(diǎn)或調(diào)控關(guān)系。SEP15是一種含硒半胱氨酸氧化還原酶，存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，與糖基化蛋白糖苷轉(zhuǎn)移酶形成11復(fù)合物，參與糖基化蛋白的氧化折疊和結(jié)構(gòu)成熟[16]。Yin等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在鼠白內(nèi)障模型中，SEP15通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制衣霉素誘導(dǎo)的HLECs細(xì)胞凋亡。Dai等[18]研究表明，SEP15在半乳糖誘導(dǎo)的白內(nèi)障大鼠晶狀體中表達(dá)顯著降低，補(bǔ)充亞硒酸鹽和依布硒啉(消炎鎮(zhèn)痛藥)30 d后SEP15表達(dá)上調(diào)，晶狀體氧化損傷減輕。說明SEP15在眼病中也發(fā)揮保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，SEP15在H2O2誘導(dǎo)后的HLE-B3細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)，與Dai等[18]研究結(jié)果一致；過表達(dá)SEP15可降低MDA含量，升高SOD活性和GSH-Px含量，降低細(xì)胞凋亡率，減輕H2O2對HLE-B3細(xì)胞的損傷，抑制細(xì)胞凋亡，驗(yàn)證了SEP15在白內(nèi)障的發(fā)展中具有重要作用。雙熒光素酶檢測結(jié)果也顯示，miR-155-5p靶向負(fù)調(diào)控SEP15的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，抑制SEP15表達(dá)可逆轉(zhuǎn)抑制miR-155-5p對H2O2誘導(dǎo)的HLE-B3細(xì)胞損傷的影響，驗(yàn)證了兩者在HLECs中存在調(diào)控關(guān)系。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，在H2O2誘導(dǎo)的HLECs細(xì)胞系HLE-B3中，miR-155-5p可通過靶向抑制SEP15表達(dá)進(jìn)而減輕HLE-B3細(xì)胞氧化損傷，抑制細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果也間接表明，miR-155-5p和SEP15有望成為HLECs氧化損傷的分子靶點(diǎn)，對預(yù)防和治療白內(nèi)障提供了新的思路。