徐 念, 熊美華, 邵 科, 闕延福, 李鍵庸

水利部中國(guó)科學(xué)院水工程生態(tài)研究所， 水利部水工程生態(tài)效應(yīng)與生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&湖北省水生態(tài)保護(hù)與修復(fù)工程技術(shù)研究中心， 湖北 武漢 430079

淡水生態(tài)系統(tǒng)為人類(lèi)文明發(fā)展提供了重要資源，然而面臨著比陸地和海洋生態(tài)系統(tǒng)更嚴(yán)重的威脅[1-2]，是全球生物多樣性喪失最嚴(yán)重的區(qū)域之一，卻缺乏足夠的調(diào)查研究[3-5]. 物種是生物多樣性的核心組成部分，對(duì)物種資源的調(diào)查和監(jiān)測(cè)是生物多樣性保護(hù)的重要基礎(chǔ)[6-7]，在全球生物多樣性喪失日益嚴(yán)重的背景下，對(duì)生物多樣性現(xiàn)狀全面了解的需求尤為緊迫[8].

長(zhǎng)江是我國(guó)淡水資源的寶庫(kù)，但多年來(lái)受人類(lèi)活動(dòng)影響，長(zhǎng)江生物多樣性持續(xù)下降，水生態(tài)保護(hù)形勢(shì)嚴(yán)峻. 2018年4月，生態(tài)環(huán)境部、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部和水利部聯(lián)合發(fā)布了《重點(diǎn)流域水生生物多樣性保護(hù)方案》，明確提出開(kāi)展長(zhǎng)江等重點(diǎn)流域水生生物多樣性本底調(diào)查的主要目標(biāo)，以及在流域干流等水域開(kāi)展魚(yú)類(lèi)及水生哺乳動(dòng)物等物種的組成、分布和種群數(shù)量進(jìn)行調(diào)查觀測(cè)的重點(diǎn)任務(wù). 同年9月，國(guó)務(wù)院辦公廳發(fā)布了《關(guān)于加強(qiáng)長(zhǎng)江水生生物保護(hù)工作的意見(jiàn)》，要求到2020年長(zhǎng)江流域重點(diǎn)水域?qū)崿F(xiàn)常年禁捕，強(qiáng)調(diào)提升監(jiān)測(cè)能力，全面開(kāi)展水生生物資源與環(huán)境本底調(diào)查，提高監(jiān)測(cè)系統(tǒng)自動(dòng)化智能化，加強(qiáng)大數(shù)據(jù)集成分析. 生物多樣性研究是一項(xiàng)工作量巨大的長(zhǎng)期任務(wù)，過(guò)去零散的調(diào)查數(shù)據(jù)已無(wú)法滿足當(dāng)前的研究和管理需求[7]，需要在流域范圍內(nèi)獲取更全面更系統(tǒng)的資料，因此對(duì)調(diào)查方法的科學(xué)性和有效性、調(diào)查結(jié)果的全面性和準(zhǔn)確性，以及對(duì)大數(shù)據(jù)的綜合分析能力提出了更高的要求.

環(huán)境DNA宏條形碼(environmental DNA metabarcoding)指從環(huán)境樣本中提取DNA，利用高通量測(cè)序分析獲得大量DNA序列，通過(guò)序列檢索比對(duì)檢測(cè)環(huán)境中的多個(gè)物種[8]，因其簡(jiǎn)單高效、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)獲得廣泛關(guān)注[9]. 環(huán)境DNA宏條形碼對(duì)物種及其豐度的檢測(cè)在微生物中已形成標(biāo)準(zhǔn)化的流程，如16S和18S擴(kuò)增子多樣性分析，有力地補(bǔ)充了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的缺失[10]. 進(jìn)入21世紀(jì)初以來(lái)，通過(guò)環(huán)境DNA檢測(cè)大型生物的技術(shù)逐漸興起，水樣環(huán)境DNA被用于魚(yú)類(lèi)和兩棲類(lèi)的特異性物種檢測(cè)[11-12]. Thomsen等[13]于2012年首次報(bào)道了利用水樣環(huán)境DNA高通量測(cè)序進(jìn)行人工池塘兩棲類(lèi)和魚(yú)類(lèi)多物種檢測(cè)，此后環(huán)境DNA宏條形碼成為水生態(tài)系統(tǒng)生物多樣性研究的熱點(diǎn)，在海洋、湖泊、河流等生境得到應(yīng)用[14-16]. 國(guó)內(nèi)研究中，單一物種的環(huán)境DNA檢測(cè)已針對(duì)鰱[17]、中華鱘[18]和長(zhǎng)江江豚[19-20]在長(zhǎng)江流域得到應(yīng)用，已有通過(guò)水樣環(huán)境DNA克隆測(cè)序進(jìn)行的少數(shù)魚(yú)類(lèi)物種檢測(cè)初步研究[21]，水樣環(huán)境DNA宏條形碼研究已在海洋環(huán)境[22]開(kāi)展，淡水生態(tài)系統(tǒng)環(huán)境DNA宏條形碼研究在國(guó)內(nèi)引發(fā)關(guān)注但鮮見(jiàn)報(bào)道.

長(zhǎng)江中下游具有獨(dú)特的江湖生態(tài)系統(tǒng)，分布有多種重要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)[23]，也是瀕危水生動(dòng)物的重要棲息地[24]，而長(zhǎng)江中下游因流量大、泥沙含量高、物種資源衰退等因素對(duì)環(huán)境DNA檢測(cè)提出了巨大挑戰(zhàn)[20-21]. 該研究在長(zhǎng)江中下游3個(gè)江段(新灘、安慶和蕪湖)采集水樣，利用通用分子標(biāo)記建立長(zhǎng)江水樣環(huán)境DNA宏條形碼物種檢測(cè)體系，分析該方法在長(zhǎng)江水生物種種類(lèi)組成和資源量評(píng)估中的有效性，旨在探索高敏感度非入侵式的長(zhǎng)江生物多樣性監(jiān)測(cè)新方法，以期為長(zhǎng)江水生態(tài)監(jiān)測(cè)體系建設(shè)提供技術(shù)支撐.

1 研究方法

1.1 環(huán)境DNA樣本采集

于2016年1月在長(zhǎng)江中下游干流新灘、安慶、蕪湖3個(gè)江段各設(shè)置1個(gè)采樣點(diǎn)，每個(gè)采樣點(diǎn)用全新2 L可密封廣口瓶(Nikko，日本亞速旺公司)采集3個(gè)2 L表層水樣，用0.45 μm聚醚砜濾膜(Pall，美國(guó)頗爾公司)真空抽濾，玻璃抽濾漏斗在每次使用前用10%次氯酸鈉消毒液浸泡30 min并充分沖洗干凈. 抽濾完成后，濾膜冷凍保存并盡快送回實(shí)驗(yàn)室. 用強(qiáng)力水樣DNA提取試劑盒(Mobio，美國(guó)Mobio實(shí)驗(yàn)室)提取濾膜DNA，DNA溶液于-20 ℃下保存.

1.2 目的基因片段擴(kuò)增

利用線粒體細(xì)胞色素B簡(jiǎn)并引物L(fēng)14912-CYB (5′-TTCCTAGCCATACAYTAYAC-3′; Y=C或T)和H15149-CYB (5′-GGTGGCKCCTCAGAAGGACATTTG KCCYCA-3′; K=G或T, Y=C或T)[25]對(duì)環(huán)境DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度在285 bp左右. 該引物的目標(biāo)位點(diǎn)是在脊椎動(dòng)物中廣泛存在的保守區(qū)域，用于河流水樣環(huán)境DNA魚(yú)類(lèi)物種克隆測(cè)序檢測(cè)[21,26]. 總體積50 μL的反應(yīng)體系包括4 μL的10×PCR Buffer、1 μL的dNTP (10 mmol/L)、1 μL的正向引物(10 pmol/μL)、1 μL的反向引物(10 pmol/μL)、5 μL的DNA模板和36.5 μL的滅菌雙蒸水. 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min、50 ℃ 退火1 min、72 ℃延伸1.5 min (45個(gè)循環(huán))；72 ℃最后延伸7 min.

1.3 擴(kuò)增子高通量測(cè)序

采用PCR產(chǎn)物進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，用Illumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序(深圳華大基因科技服務(wù)有限公司)，下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)過(guò)濾，濾除低質(zhì)量的讀長(zhǎng)序列，得到有效序列. 使用軟件FLASH v1.2.11進(jìn)行序列拼接，利用重疊關(guān)系將雙末端測(cè)序得到的成對(duì)有效序列組裝成一條拼接序列，去除沒(méi)有重疊關(guān)系的序列. 利用軟件USEARCH v7.0.1090將拼接好的序列聚類(lèi)為OTU(operational taxonomic unit，操作分類(lèi)單元)，獲得OTU代表序列.

1.4 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析

該研究利用美吉生物云生物信息分析云平臺(tái)(www.majorbio.com)對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析. 首先將OTU代表序列在Genbank的核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行物種注釋?zhuān)瑫r(shí)利用序列相似性在線檢索工具BLAST進(jìn)行人工校核，除去兩端引物序列，核心目標(biāo)片段100%匹配則被認(rèn)定為該物種DNA. 然后利用分析平臺(tái)的生物多樣性云分析流程v3.0進(jìn)行交互分析，對(duì)注釋OTU進(jìn)行篩選，統(tǒng)計(jì)不同分類(lèi)水平的物種數(shù)量、OTU數(shù)量、序列數(shù)量，計(jì)算物種序列相對(duì)豐度.

2 結(jié)果與討論

2.1 水樣環(huán)境DNA物種注釋

2.1.1種類(lèi)組成

長(zhǎng)江中下游干流新灘、安慶、蕪湖3個(gè)江段水樣環(huán)境DNA宏條形碼檢測(cè)共得到有效拼接序列 334 623 條，平均序列長(zhǎng)度為285 bp，聚類(lèi)得到425個(gè)OTU，其中在數(shù)據(jù)庫(kù)中達(dá)到匹配的OTU為54個(gè)(總序列數(shù) 162 398)，共注釋10目13科32種(見(jiàn)表1)，其中魚(yú)類(lèi)20種、水生哺乳動(dòng)物1種、鳥(niǎo)類(lèi)4種、陸生哺乳動(dòng)物7種. 魚(yú)類(lèi)包括鯉形目、鲇形目、鱸形目和鯡形目物種，其中鯉形目物種數(shù)最多(見(jiàn)圖1)；水生哺乳動(dòng)物為國(guó)家一級(jí)保護(hù)動(dòng)物長(zhǎng)江江豚，是長(zhǎng)江中唯一現(xiàn)存的水生哺乳動(dòng)物，也是目前中國(guó)唯一的淡水豚類(lèi)；鳥(niǎo)類(lèi)包括家禽和野生物種；陸生哺乳動(dòng)物包括偶蹄目牲畜、褐家鼠和人.

所有注釋物種中，水生物種數(shù)占65.6%，其他為陸生動(dòng)物. 以無(wú)脊椎動(dòng)物為主要對(duì)象的環(huán)境DNA宏條形碼研究報(bào)道了河流水樣環(huán)境DNA包含水生和陸生生物群落的多樣性信息[27]. 該研究以脊椎動(dòng)物為主要對(duì)象，結(jié)果表明，長(zhǎng)江水樣環(huán)境DNA包含水生和陸生物種信息，通過(guò)環(huán)境DNA宏條形碼可檢測(cè)多類(lèi)群物種. 該研究采樣點(diǎn)位于人口密集的城鎮(zhèn)江段，水樣中檢測(cè)到的陸生物種大多與人類(lèi)生產(chǎn)生活息息相關(guān)，水樣環(huán)境DNA物種組成體現(xiàn)出人類(lèi)活動(dòng)與河流生態(tài)系統(tǒng)的密切聯(lián)系.

2.1.2序列相對(duì)豐度

在所有注釋物種中，魚(yú)類(lèi)序列數(shù)占總序列數(shù)的78.5%，其中鯉形目序列數(shù)占魚(yú)類(lèi)總序列的96.2%，鯡形目占3.5%，鲇形目占0.2%，鱸形目占0.1%，各類(lèi)目序列數(shù)見(jiàn)表2. 在20種魚(yú)類(lèi)物種中，序列數(shù)排序前5位的依次為鰱、團(tuán)頭魴、青魚(yú)、短頜鱭和草魚(yú)，各物種序列數(shù)在魚(yú)類(lèi)中占比依次分別為52.5%、23.7%、17.0%、3.5%和1.3%. 水生哺乳動(dòng)物長(zhǎng)江江豚的序列數(shù)在所有注釋水生物種中占比約為 1/4 000. 陸生物種中，序列相對(duì)豐度最高的是雞，其序列數(shù)占陸生物種總序列數(shù)的96.0%，其次為人(占比為2.6%)、鴻雁(占比為0.8%)、牛(占比為0.6%)和綿羊(占比為0.2%). 綜合種類(lèi)數(shù)量和序列相對(duì)豐度，長(zhǎng)江中下游水樣環(huán)境DNA主要包含水生物種信息，魚(yú)類(lèi)是水生脊椎動(dòng)物的主要類(lèi)群，其中鯉形目占絕大多數(shù).

序列相對(duì)豐度受物種豐度的影響，在一定程度上序列相對(duì)豐度體現(xiàn)了物種在環(huán)境中可能具有的豐度相互關(guān)系[28]，但二者的相關(guān)性不太確定[13,29]. 從環(huán)境中物種DNA的釋放、運(yùn)輸和降解，到環(huán)境樣本的采集、目的片段的擴(kuò)增和測(cè)序，檢測(cè)結(jié)果中序列相對(duì)豐度受多種因素的影響，如環(huán)境DNA的來(lái)源、濃度分布、引物的擴(kuò)增偏向性等[30]. 環(huán)境樣本中特定物種的環(huán)境DNA檢測(cè)濃度也不一定與其物種豐度具有顯著相關(guān)關(guān)系[31]. 盡管在多變的自然環(huán)境中相關(guān)性較弱，物種環(huán)境DNA濃度依然體現(xiàn)了物種豐度的實(shí)質(zhì)性變化，利用環(huán)境DNA宏條形碼準(zhǔn)確評(píng)估物種數(shù)量或生物量則需要對(duì)采樣策略和檢測(cè)分析技術(shù)提出更高的要求[15,32].

表1 長(zhǎng)江中下游3個(gè)江段水樣環(huán)境DNA宏條形碼注釋物種

注： +表示采樣點(diǎn)水樣中檢測(cè)到物種環(huán)境DNA.

2.2 樣本聚類(lèi)分析

在OTU水平基于Bray-curtis距離算法的樣本進(jìn)行層級(jí)聚類(lèi)(hierarchical clustering)，根據(jù)不同的距離閾值可將樣本劃分為聚類(lèi)小組，結(jié)果如圖2所示. 由圖2可見(jiàn)，同一采樣點(diǎn)的樣本首先聚類(lèi)在一起，然后安慶采樣點(diǎn)和蕪湖采樣點(diǎn)的樣本聚類(lèi)為一支，新灘采樣點(diǎn)樣本則單獨(dú)聚類(lèi)為一支. 相似性分析結(jié)果顯示，新灘、安慶、蕪湖3個(gè)采樣點(diǎn)組間差異顯著大于其組內(nèi)差異(見(jiàn)圖3)(P=0.001)，置換多因素方差分析結(jié)果表明，分組對(duì)樣本差異具有可信的解釋度(R2=0.924 6，P=0.005). 綜上，同一采樣點(diǎn)樣本差異度較小，表明在一定范圍內(nèi)環(huán)境DNA的分布與組成具有穩(wěn)定性，而在河流中不同采樣點(diǎn)間的顯著差異可以為空間差異性研究提供基礎(chǔ). 河道間距較近的安慶和蕪湖采樣點(diǎn)聚類(lèi)距離也較近，推測(cè)河流水樣環(huán)境DNA的組成相似性可能與采樣點(diǎn)間的距離有關(guān). 不同江段物種組成的差異性會(huì)導(dǎo)致水樣中環(huán)境DNA的組成差異，但在該研究中檢測(cè)結(jié)果不排除其他因素的影響，環(huán)境DNA組成在河流中的空間差異性還需更多研究數(shù)據(jù)來(lái)證實(shí).

圖1 長(zhǎng)江中下游水樣環(huán)境DNA宏條形碼檢測(cè)種類(lèi)組成Fig.1 The number of species detected from water samples in the middle and lower reaches of the Yangtze River using environmental DNA metabarcoding

表2 長(zhǎng)江中下游水樣環(huán)境DNA宏條形碼檢測(cè)物種注釋序列數(shù)Table 2 The number of sequences for each order identified by environmental DNA metabarcoding of water samples in the middle and lower reaches of the Yangtze River

序號(hào)物種分類(lèi)序列數(shù)序號(hào)物種分類(lèi)序列數(shù)1鯉形目122 6326雁形目2792雞形目33 2267鲇形目2763鯡形目4 4468鱸形目1694靈長(zhǎng)目9239嚙齒目415偶蹄目37410鯨目32

注： 1、2、3表示采樣點(diǎn)樣本序號(hào). 下同.

圖2 基于OTU水平的樣本層級(jí)聚類(lèi)樹(shù)
Fig.2 Hierarchical clustering tree on OTU level

圖3 基于OTU水平的組間距離盒型圖Fig.3 Distance box plot on OTU level of each sample groups

2.3 水生物種分布和資源量

2.3.1魚(yú)類(lèi)

該研究通過(guò)水樣環(huán)境DNA檢測(cè)到的20種魚(yú)類(lèi)均為在長(zhǎng)江中下游傳統(tǒng)魚(yú)類(lèi)資源調(diào)查中出現(xiàn)過(guò)的物種[33-35]，包括構(gòu)成重要漁業(yè)資源的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)草魚(yú)、青魚(yú)、鰱、鳙、鯉、鯽等. 環(huán)境DNA檢測(cè)到的4個(gè)類(lèi)目是長(zhǎng)江中下游漁獲物中的主要類(lèi)目，在所有20種魚(yú)類(lèi)中，鯉形目種類(lèi)數(shù)占總種類(lèi)總數(shù)的60%，鲇形目占25%，鱸形目占10%，鯡形目占5%. 長(zhǎng)江魚(yú)類(lèi)資源的特點(diǎn)是鯉科魚(yú)類(lèi)種類(lèi)多[23,36]，該次環(huán)境DNA檢測(cè)結(jié)果也顯示，鯉科種類(lèi)占多數(shù). 在已報(bào)道的長(zhǎng)江中下游干流漁獲物調(diào)查中，鯉科種類(lèi)占52%～61%[33-35,37]，該次環(huán)境DNA檢測(cè)鯉科種類(lèi)占魚(yú)類(lèi)種類(lèi)總數(shù)的50%～60%. 在上述漁獲物調(diào)查中，鲇形目、鱸形目和鯡形目分別占11%～22%、12%～19%和3%～6%，該次環(huán)境DNA檢測(cè)結(jié)果顯示，其分別占18%～23%、0～12%和0～6%. 水利部中國(guó)科學(xué)院水工程生態(tài)研究所于2017年3月在蕪湖江段開(kāi)展了6 d漁獲物調(diào)查，記錄每日漁民單船漁獲物種類(lèi)，各類(lèi)目魚(yú)類(lèi)種類(lèi)數(shù)從多到少依次為鯉形目、鲇形目、鱸形目和鯡形目. 圖4顯示了安慶和蕪湖兩江段的漁獲物調(diào)查結(jié)果和該次環(huán)境DNA調(diào)查結(jié)果的各類(lèi)目種類(lèi)數(shù)量占比，從魚(yú)類(lèi)種類(lèi)組成來(lái)看，環(huán)境DNA檢測(cè)結(jié)果體現(xiàn)了漁獲物的主要類(lèi)目，且主要注釋類(lèi)目的種數(shù)比例與漁獲物組成相似.

注： 采樣次數(shù)=采樣點(diǎn)數(shù)×采樣天數(shù)；漁獲物數(shù)據(jù)來(lái)源于文獻(xiàn)[34-35,37]和調(diào)查記錄. eDNA表示環(huán)境DNA.

圖4 長(zhǎng)江中下游兩江段漁獲物調(diào)查和環(huán)境DNA宏條形碼檢測(cè)中目水平魚(yú)類(lèi)種數(shù)占比
Fig.4 Proportion of fish species of each phylum investigated in traditional survey and environmental DNA metabarcoding

鯉形目魚(yú)類(lèi)不僅在種類(lèi)數(shù)上占優(yōu)勢(shì)，在DNA序列數(shù)上也占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，而鯉形目在長(zhǎng)江中下游漁獲物調(diào)查中的尾數(shù)和重量均居首位. 對(duì)于鯉形目、鲇形目、鱸形目和鯡形目4個(gè)主要類(lèi)目，安慶江段4個(gè)類(lèi)目資源量總和占漁獲物總量的99%以上[33,37]，蕪湖江段4個(gè)類(lèi)目尾數(shù)總和占漁獲物總量的99%以上[34]. 但環(huán)境DNA序列相對(duì)豐度和漁獲物資源量百分比之間存在較大差異，如鯉形目序列在3個(gè)江段中均占90%以上，而在漁獲物中鯉形目資源量通常為漁獲物總量的60%～80%. 以安慶江段為例，根據(jù)2003年3月—2010年3月[33]和2015年4—6月[37]的漁獲物調(diào)查結(jié)果，發(fā)現(xiàn)鯉形目尾數(shù)和質(zhì)量分別占漁獲物總量的47%～72%和60%～77%，鲇形目尾數(shù)和質(zhì)量分別占17%～46%和12%～32%，鱸形目尾數(shù)和質(zhì)量分別占3%～12%和6%～11%，鯡形目尾數(shù)和質(zhì)量分別占>1%～6%和>1%～4%. 該研究環(huán)境DNA檢測(cè)安慶江段鯉形目序列占魚(yú)類(lèi)總序列的92%，鯡形目占7.7%，鲇形目和鱸形目均不足0.1%，與漁獲物反映的各類(lèi)目資源量相差較大. 一方面如2.1.2節(jié)所述序列相對(duì)豐度和物種資源量之間并不具有穩(wěn)定的對(duì)應(yīng)關(guān)系; 另一方面該研究每個(gè)江段單次調(diào)查獲取的數(shù)據(jù)有限，不能滿足準(zhǔn)確的資源量統(tǒng)計(jì)分析需求，但序列相對(duì)豐度體現(xiàn)出了其中的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群鯉形目魚(yú)類(lèi).

從調(diào)查取樣數(shù)量來(lái)看，對(duì)比安慶和蕪湖兩江段的已有報(bào)道[33-35,37]，將同一采樣點(diǎn)同一天內(nèi)的采樣記為1次采樣，該研究每個(gè)江段僅進(jìn)行了1次采樣，水樣的采集通常在幾分鐘內(nèi)完成，而漁獲物報(bào)道中魚(yú)類(lèi)標(biāo)本的采集在每個(gè)江段采樣次數(shù)(采樣點(diǎn)數(shù)×采樣天數(shù))為20～336次(部分?jǐn)?shù)據(jù)見(jiàn)圖4)，每個(gè)采樣點(diǎn)的總采樣時(shí)間(單次采樣時(shí)間×采樣次數(shù))最低為10 h，最高達(dá) 8 064 h，且多數(shù)調(diào)查在取樣時(shí)同時(shí)使用多個(gè)網(wǎng)具，實(shí)際工作量更大. 從單次調(diào)查種類(lèi)數(shù)量來(lái)看，在水利部中國(guó)科學(xué)院水工程生態(tài)研究所于2017年3月開(kāi)展的蕪湖江段6 d漁獲物調(diào)查中，每天調(diào)查種類(lèi)為9～21種，平均單次漁獲物調(diào)查種類(lèi)數(shù)為15.7種，網(wǎng)具數(shù)量4網(wǎng)，該研究蕪湖江段僅一次環(huán)境DNA調(diào)查種類(lèi)為17種，平行樣本3個(gè). 總的來(lái)說(shuō)，該次環(huán)境DNA調(diào)查檢測(cè)到的魚(yú)類(lèi)種數(shù)為各江段漁獲物種數(shù)的31%～49%，而采樣時(shí)間不足努力量最少漁獲物調(diào)查的1%，是努力量最多漁獲物調(diào)查的十萬(wàn)分之一. 可見(jiàn)，與傳統(tǒng)漁獲物調(diào)查相比，環(huán)境DNA調(diào)查方法在采樣效率方面具有明顯的優(yōu)勢(shì). 對(duì)比長(zhǎng)江中下游安慶江段4個(gè)不同年代的漁獲物調(diào)查報(bào)道[33,35,37-38]中出現(xiàn)的物種，環(huán)境DNA調(diào)查安慶江段檢測(cè)到17種魚(yú)類(lèi)，其中2種魚(yú)類(lèi)(團(tuán)頭魴、紅鰭原鲌)未在漁獲物調(diào)查中出現(xiàn)，2種魚(yú)類(lèi)(達(dá)氏鲌、寡鱗飄魚(yú))僅在1次漁獲物報(bào)道中出現(xiàn)，僅7種魚(yú)類(lèi)在4次漁獲物報(bào)道中均有出現(xiàn)，漁獲物調(diào)查時(shí)間跨度從短至長(zhǎng)依次分別為3個(gè)月、12個(gè)月、6 a和8 a，而環(huán)境DNA取樣僅用1 d完成，可見(jiàn)長(zhǎng)時(shí)間漁獲物調(diào)查結(jié)果仍然會(huì)受到捕撈方式的限制，甚至造成一些常見(jiàn)的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)(如草魚(yú)、青魚(yú)等)在漁獲物調(diào)查中未采集到[35]，環(huán)境DNA調(diào)查通過(guò)簡(jiǎn)單的取樣方式，可以對(duì)傳統(tǒng)調(diào)查結(jié)果進(jìn)行補(bǔ)充. 在國(guó)際同類(lèi)研究中，利用環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)在淡水生態(tài)系統(tǒng)的流水生境中檢測(cè)到的魚(yú)類(lèi)種數(shù)分別為8種[39]、12種[40]、16種[41]和19種[42]，這些研究均表明環(huán)境DNA宏條形碼和傳統(tǒng)調(diào)查方法相結(jié)合能調(diào)查到更多的魚(yú)類(lèi)物種，且環(huán)境DNA調(diào)查方法比傳統(tǒng)調(diào)查方法效率更高. 對(duì)于魚(yú)類(lèi)資源調(diào)查來(lái)說(shuō)，環(huán)境DNA宏條形碼需優(yōu)化采樣方案和檢測(cè)體系，如增加采樣點(diǎn)和采樣次數(shù)、使用更高效的分子標(biāo)記等，以檢測(cè)到更多物種，并對(duì)其進(jìn)行資源量評(píng)估.

注： 傳統(tǒng)調(diào)查分布密度來(lái)源于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的2017年長(zhǎng)江江豚科學(xué)考察結(jié)果[43].

圖5 長(zhǎng)江中下游干流3個(gè)采樣點(diǎn)位置和長(zhǎng)江江豚環(huán)境DNA序列相對(duì)豐度
Fig.5 Location of the three sampling sites in the middle and lower reaches of the Yangtze River mainstream and relative abundance of environmental DNA sequences of Neophocaena asiaeorientalis asiaeorientalis

2.3.2長(zhǎng)江江豚

安慶采樣點(diǎn)3個(gè)樣本，以及新灘采樣點(diǎn)1個(gè)樣本，均檢測(cè)到長(zhǎng)江江豚DNA序列，且安慶采樣點(diǎn)長(zhǎng)江江豚DNA序列相對(duì)豐度(物種序列數(shù)在總測(cè)序序列數(shù)中占比)約是新灘采樣點(diǎn)的36倍，蕪湖采樣點(diǎn)未檢測(cè)到江豚DNA序列(見(jiàn)圖5). 針對(duì)單一物種的環(huán)境DNA檢測(cè)技術(shù)對(duì)瀕危物種具有高敏感度[13]，其為長(zhǎng)江江豚監(jiān)測(cè)提供了有力工具[19-20]. 該研究結(jié)果顯示，以多物種為對(duì)象的水樣環(huán)境DNA宏條形碼對(duì)于瀕危物種也具有一定的敏感度.

綜合2006、2012和2017年3次長(zhǎng)江江豚考察結(jié)果[43-45]，發(fā)現(xiàn)安慶江段長(zhǎng)期以來(lái)均處于長(zhǎng)江干流長(zhǎng)江江豚密度最高的江段，而中下游鄂州以上和安慶以下江段則密度較低. 該研究中安慶采樣點(diǎn)位于皖河口下游約2 km處，皖河口是安慶市江豚自然保護(hù)區(qū)的重點(diǎn)水域，是長(zhǎng)江江豚群體的重要棲息地[35]，安慶采樣點(diǎn)的長(zhǎng)江江豚環(huán)境DNA檢出率和DNA序列相對(duì)豐度在3個(gè)采樣點(diǎn)中都是最高的，與傳統(tǒng)調(diào)查中長(zhǎng)江江豚密度最高的江段相一致. 與2017年江豚科學(xué)考察結(jié)果相比，新灘采樣點(diǎn)處于長(zhǎng)江江豚分布密度居中的江段，位于長(zhǎng)江新螺段白鱀豚國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)靠近下游邊界，該保護(hù)區(qū)也是長(zhǎng)江江豚的聚集地；而蕪湖采樣點(diǎn)處于江豚分布密度最低的江段，距離上游銅陵淡水豚國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)下游邊界約60 km[46]. 該次環(huán)境DNA檢測(cè)結(jié)果表明，長(zhǎng)江中下游干流長(zhǎng)江江豚環(huán)境DNA檢出率和序列相對(duì)豐度與其密度分布相符合，但利用環(huán)境DNA宏條形碼進(jìn)行長(zhǎng)江江豚群體分布和資源量的監(jiān)測(cè)還需要針對(duì)性的開(kāi)展進(jìn)一步研究.

2.4 淡水環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)應(yīng)用

該研究體現(xiàn)了環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)在長(zhǎng)江水生態(tài)系統(tǒng)生物多樣性研究領(lǐng)域的主要優(yōu)勢(shì)，采集水樣將調(diào)查研究過(guò)程對(duì)目標(biāo)物種和生態(tài)環(huán)境的影響降到極低，高效的采樣需要較少的人力和時(shí)間付出，且宏條形碼分析流程標(biāo)準(zhǔn)化，有利于不同樣本間的比較，結(jié)果可體現(xiàn)大尺度區(qū)域群落結(jié)構(gòu)，突出其中的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，對(duì)瀕危物種亦具有一定敏感度. 此外，高通量測(cè)序可以在同一樣本中快速獲得比克隆測(cè)序更多的序列作為物種注釋的基礎(chǔ)，在已報(bào)道的長(zhǎng)江魚(yú)類(lèi)環(huán)境DNA研究[21]中，通過(guò)水樣環(huán)境DNA克隆測(cè)序方法在24個(gè)采樣點(diǎn)共檢測(cè)到10種魚(yú)類(lèi)序列，每個(gè)采樣點(diǎn)檢測(cè)到1～3種魚(yú)類(lèi)，而該研究通過(guò)高通量測(cè)序在3個(gè)采樣點(diǎn)共檢測(cè)到20種魚(yú)類(lèi)，每個(gè)采樣點(diǎn)檢測(cè)到13～17種魚(yú)類(lèi)，比克隆測(cè)序方法效率大幅提高. 隨著高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法的快速發(fā)展，環(huán)境DNA宏條形碼將揭示更多水體中所包含的生物多樣性信息. 該研究中環(huán)境DNA宏條形碼方法在物種多樣性檢測(cè)方面也存在一定的局限性. 在所有測(cè)序得到的OTU中，成功注釋物種的OTU比例低，約有87.3%的OTU無(wú)法在數(shù)據(jù)庫(kù)中匹配到物種，這些未注釋的OTU包含總測(cè)序序列數(shù)量的51.5%，數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的DNA序列成為環(huán)境DNA宏條形碼物種注釋的重要限制因素[29]. 環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)極大程度上依賴于檢測(cè)中所選擇的分子標(biāo)記，不同的分子標(biāo)記可以針對(duì)不同的目標(biāo)類(lèi)群，同時(shí)分子標(biāo)記也可能存在一定的擴(kuò)增偏向性[30]，該研究檢測(cè)到的物種有限，后續(xù)研究可篩選更多通用分子標(biāo)記，以獲取足夠的序列信息用于生物多樣性研究. 在該研究中各物種序列相對(duì)豐度在不同采樣點(diǎn)各不相同，同一采樣點(diǎn)的樣本則相當(dāng)接近，表明水樣環(huán)境DNA宏條形碼檢測(cè)在一定范圍內(nèi)具有穩(wěn)定性和可重復(fù)性. 測(cè)序結(jié)果中存在某些物種的序列數(shù)量占比極大的現(xiàn)象，如在新灘采樣點(diǎn)，鰱的序列數(shù)占總注釋序列數(shù)的99.8%，而新灘采樣點(diǎn)注釋的物種總數(shù)最少，約為其他2個(gè)采樣點(diǎn)的62%，安慶和蕪湖采樣點(diǎn)物種數(shù)量則較為接近，其原因可能是，新灘采樣點(diǎn)水樣中鰱的DNA濃度較高，在有限的測(cè)序數(shù)量下相對(duì)豐度較低的物種無(wú)法檢出. 根據(jù)研究對(duì)象設(shè)計(jì)合理的采樣方案、設(shè)置足夠數(shù)量的采樣點(diǎn)有助于獲得更全面準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果.

近年來(lái)，利用環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)針對(duì)淡水生態(tài)系統(tǒng)脊椎動(dòng)物多樣性的研究日益發(fā)展，但其中環(huán)境樣本來(lái)源于大型河流的報(bào)道較少，尤其是長(zhǎng)江中下游干流這種流量巨大的流水生境，對(duì)水樣環(huán)境DNA物種檢測(cè)來(lái)說(shuō)存在相當(dāng)?shù)奶魬?zhàn). 河流是生物多樣性信息傳遞的紐帶[47]，水樣中包含的水陸物種信息可以用于景觀尺度的生物多樣性分析，以及人類(lèi)活動(dòng)對(duì)河流的影響研究. 該研究驗(yàn)證了在長(zhǎng)江水生態(tài)系統(tǒng)中通過(guò)水樣環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)進(jìn)行生物多樣性檢測(cè)分析的可行性，同時(shí)體現(xiàn)了通過(guò)對(duì)河流環(huán)境DNA檢測(cè)進(jìn)行景觀尺度的水陸復(fù)合生態(tài)系統(tǒng)生物多樣性綜合分析的可能性. 技術(shù)方法的發(fā)展和環(huán)保理念的革新是未來(lái)生態(tài)保護(hù)不可阻擋的趨勢(shì)，通過(guò)開(kāi)發(fā)高效分子標(biāo)記、發(fā)展測(cè)序分析技術(shù)，未來(lái)環(huán)境DNA所包含的物種條形碼還將被進(jìn)一步挖掘，環(huán)境樣本中展現(xiàn)出的大尺度復(fù)合生態(tài)系統(tǒng)的豐富信息將為生物多樣性研究開(kāi)拓更廣闊的發(fā)展前景.

3 結(jié)論

a) 長(zhǎng)江中下游干流新灘、安慶和蕪湖3個(gè)江段的水樣環(huán)境DNA宏條形碼分析共檢測(cè)到32個(gè)脊椎動(dòng)物物種，其中包括20種魚(yú)類(lèi)，1種水生哺乳動(dòng)物(長(zhǎng)江江豚)和11種陸生動(dòng)物，其中魚(yú)類(lèi)序列數(shù)占總注釋序列數(shù)的78.5%，表明長(zhǎng)江水樣環(huán)境DNA主要包含水生物種信息，同時(shí)承載了陸生物種信息，通過(guò)水樣環(huán)境DNA宏條形碼可檢測(cè)不同類(lèi)群物種.

b) 環(huán)境DNA檢測(cè)到的魚(yú)類(lèi)中，鯉形目種類(lèi)占60%，鲇形目占25%，鱸形目占10%，鯡形目占5%，為長(zhǎng)江中下游漁獲物調(diào)查的主要類(lèi)目，且各類(lèi)目包含的種類(lèi)數(shù)量比例與漁獲物調(diào)查結(jié)果具有相似性. 在漁獲物中尾數(shù)和質(zhì)量均居首位的鯉形目在環(huán)境DNA調(diào)查中序列數(shù)也最多，但4個(gè)類(lèi)目序列相對(duì)豐度與漁獲物種資源量組成差異較大.

c) 環(huán)境DNA調(diào)查用約占傳統(tǒng)漁獲物調(diào)查幾十至幾百分之一的調(diào)查次數(shù)，百分之一至十萬(wàn)分之一的調(diào)查時(shí)間，檢測(cè)到了31%～49%的魚(yú)類(lèi)種數(shù)，表明環(huán)境DNA調(diào)查效率更高，且環(huán)境DNA檢測(cè)到了在漁獲物調(diào)查中未出現(xiàn)的物種，可以對(duì)傳統(tǒng)調(diào)查結(jié)果進(jìn)行補(bǔ)充，將二者結(jié)合可獲得更全面的調(diào)查結(jié)果.

d) 在新灘和安慶采樣點(diǎn)均檢測(cè)到瀕危物種長(zhǎng)江江豚環(huán)境DNA，表明環(huán)境DNA宏條形碼對(duì)瀕危物種具有一定敏感度. 在中下游長(zhǎng)江江豚密度最高的安慶江段，長(zhǎng)江江豚環(huán)境DNA檢出率和序列相對(duì)豐度在3個(gè)采樣點(diǎn)中都是最高的，而位于長(zhǎng)江江豚密度最低的中下游下段的蕪湖采樣點(diǎn)，未檢測(cè)到長(zhǎng)江江豚環(huán)境DNA. 長(zhǎng)江江豚環(huán)境DNA檢出率和序列相對(duì)豐度可能主要受其分布密度的影響.

e) 長(zhǎng)江中下游水樣環(huán)境DNA宏條形碼分析結(jié)果體現(xiàn)了調(diào)查區(qū)域的部分群落結(jié)構(gòu)，顯示出了優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，注釋物種包含瀕危物種. 環(huán)境DNA宏條形碼在淡水生物多樣性研究中具有高效率和無(wú)損傷的優(yōu)勢(shì). 核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)和分子標(biāo)記體系是環(huán)境DNA宏條形碼物種檢測(cè)的主要限制因素，進(jìn)行全面的物種多樣性監(jiān)測(cè)和資源量估算需要對(duì)采樣方案和分析方法進(jìn)行科學(xué)設(shè)計(jì). 通過(guò)水樣環(huán)境DNA，可進(jìn)一步對(duì)河流水陸復(fù)合生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性信息進(jìn)行挖掘.