范曉偉，冉 露，郭 箐，李 迪，孫穎迪，周宋蕊，陳 寧，許美琳，易倫朝，任達(dá)兵

（昆明理工大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品學(xué)院，云南 昆明 650500）

柑橘是世界產(chǎn)量第一的水果種類，也是我國產(chǎn)量第二的水果[1]。柑橘加工過程中，會(huì)產(chǎn)生大量的果皮和果渣，約占濕質(zhì)量的40%～50%。然而，除少數(shù)柑橘果皮用于中藥生產(chǎn)和香精油提取外，大部分柑橘皮渣被當(dāng)作廢料直接丟棄。值得指出的是，柑橘廢棄皮渣中含有黃酮、果膠、天然色素等多種有效成分[2-3]。張玉等[4]測定了宮川溫州蜜柑、衢州椏柑、哈姆林甜橙、常山胡柚和蕉柑果皮中橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷3 種黃烷酮化合物，其含量在4.730 4～8.798 1 mg/g之間。其中，黃酮類化合物如橙皮苷和蕓香柚皮苷具有抗氧化、抗炎、抗癌等重要的生物活性[5-7]，在食品、化妝品及醫(yī)藥等領(lǐng)域具有重要的開發(fā)價(jià)值。提取、分離和純化對(duì)柑橘黃酮的開發(fā)利用具有重要意義。傳統(tǒng)的柑橘黃酮提取分離技術(shù)有冷凝回流提取法[8]、超聲波輔助提取法[9]、水浴浸提法[10]、微切變-助劑互作技術(shù)輔助提取法[11]等。

離子液體被認(rèn)為是21世紀(jì)的綠色溶劑之一，其主要由有機(jī)陽離子和無機(jī)陰離子構(gòu)成，具有蒸汽壓低、熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性高、潛在回收率高等特點(diǎn)[12-14]。目前，離子液體作為提取溶劑已經(jīng)成功應(yīng)用在醫(yī)藥、化妝品以及食品領(lǐng)域[15]。Gutowski等[16]基于離子液體提出了一種新型的液液萃取分離技術(shù)，即離子液體雙水相萃取技術(shù)。雙水相萃取技術(shù)是近年來出現(xiàn)的一種極有前途的新型分離技術(shù)，具有分相時(shí)間短、條件溫和、易于工藝放大和連續(xù)操作等優(yōu)點(diǎn)[17]?；陔x子液體的各種優(yōu)點(diǎn)，離子液體雙水相溶液酸度范圍較寬、不易乳化、界面清晰、黏度小、不需要揮發(fā)性有機(jī)溶劑、生物相容性好、離子液體經(jīng)簡單處理可重復(fù)再利用[18-21]。鑒于離子液體的不易揮發(fā)性，很難像傳統(tǒng)有機(jī)溶劑一樣通過蒸發(fā)手段回收離子液體提取液中的目標(biāo)化合物。目前，離子液體雙水相體系已經(jīng)成功應(yīng)用于萃取分離不同類型的化合物，如蛋白質(zhì)、抗菌素、金屬離子、醫(yī)藥生物分子等[22-25]。

由于離子液體在萃取分離領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，本研究擬采用離子液體作為提取溶劑，結(jié)合超聲輔助提取技術(shù)以及雙水相萃取技術(shù)對(duì)柑橘果皮中的黃酮類化合物進(jìn)行提取、分離及純化。本研究不僅為水果加工副產(chǎn)物中活性成分的回收提供一種技術(shù)支持，還可為實(shí)現(xiàn)水果加工副產(chǎn)物的高值化利用研究提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜜橘 浙江市購；正丁醇、氯仿、異丙醇、乙酸乙酯（均為分析純） 天津市大茂化學(xué)試劑廠；甲醇、乙腈（均為質(zhì)譜級(jí)） 德國默克公司；橙皮苷（純度＞98%）、蕓香柚皮苷（純度＞99%） 成都曼思特生物科技有限公司；三丁基己基溴化膦（[P4446]Br）、三丁基乙基溴化膦（[P2444]Br）、四丁基溴化膦（[P4444]Br）、氯化三甲基羥乙基胺（[HOEtN1,1,1]Cl）、三甲基羥乙基胺高氯酸鹽（[HOEtN1,1,1][ClO4]）、三甲基羥乙基胺硝酸鹽（[HOEtN1,1,1][NO3]）、三甲基羥乙基胺雙腈銨鹽（[HOEtN1,1,1][C(CN)2]）、三甲基羥乙基氫氧化銨（[HOEtN1,1,1][OH]）、三甲基羥乙基胺四氟硼酸鹽（[HOEtN1,1,1][BF4]）（純度均＞99%） 上海成捷化學(xué)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

NexeraXR超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）儀 日本島津公司；LGJ-12型真空干燥冷凍機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；HSZ-A型水浴恒溫振蕩器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TGL-16M高速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；HU-20500B超聲波清洗器 天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；FAMO-10F超濾型超純水機(jī)南京權(quán)坤生物科技有限公司；FE28 pH計(jì) 上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的收集與前處理

將購買回的蜜橘進(jìn)行果皮和果肉的分離后，蜜橘果皮進(jìn)行冷凍干燥48 h。干燥后的果皮打粉并過80 目篩后放置于干燥陰涼處備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取蕓香柚皮苷和橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品各2 mg，用純甲醇溶解后定容至10 mL，獲得質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的混標(biāo)溶液。標(biāo)準(zhǔn)溶液用于柑橘果皮提取物中主要黃酮類化合物的定量分析。

1.3.3 離子液體-超聲輔助提取

準(zhǔn)確稱取0.100 g柑橘果皮粉末于5 mL離心管中，隨后按照特定的料液比加入一定量的離子液體溶液，渦旋混合均勻后進(jìn)行超聲波輔助提取（100 W，10 min）。提取結(jié)束后，將提取液進(jìn)行離心（8 000 r/min，10 min），收集上清液。取1 mL上清液，加入50%乙腈溶液稀釋5 倍，過0.22 μm微孔濾膜后進(jìn)行UPLC分析。根據(jù)UPLC定量分析結(jié)果，計(jì)算柑橘果皮中黃酮類化合物的提取率。由于蕓香柚皮苷和橙皮苷是柑橘果皮提取物中的重要成分，本實(shí)驗(yàn)利用兩者的含量之和代替總黃酮含量考察各試驗(yàn)因素。每個(gè)樣品需做3 次平行。提取率（Y）通過式（1）進(jìn)行計(jì)算：

式中：mt為體系中加入的柑橘果皮粉末總質(zhì)量/g；C為提取液中黃酮類化合物質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為提取液的體積/mL。

1.3.4 相圖的繪制及系線的測定

本研究采用檸檬酸鈉和離子液體[P4446]Br構(gòu)建雙水相體系，在常溫常壓下采用濁點(diǎn)滴定法測定和繪制雙水相體系的相圖[26]。操作方法簡單說明如下：1）于5 mL離心管中加入0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%檸檬酸鈉溶液，然后向離心管中逐滴加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%的[P4446]Br溶液，記錄離心管中溶液變渾濁時(shí)所用[P4446]Br的溶液質(zhì)量；2）繼續(xù)逐滴加入純水至溶液變澄清，記錄所用水的質(zhì)量。重復(fù)上述步驟，直至獲得足夠的數(shù)據(jù)，以檸檬酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，[P4446]Br的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)作圖，即可獲得雙水相體系的雙結(jié)線。

相圖中的系線根據(jù)Salamanca等[27]提出的重量分析法進(jìn)行測定。在雙水相相圖的兩相區(qū)域選擇合適的點(diǎn)，根據(jù)離子液體和有機(jī)鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)配制兩相體系。待兩相體系靜置2 h完全平衡后，離心分層，分別稱取上、下相的質(zhì)量，最后根據(jù)杠桿原理計(jì)算系線的組成。系線長度按式（2）計(jì)算：

式中：TLL為系線長度；W1t、W1b分別代表離子液體在上相和下相中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；W2t、W2b分別代表鹽在上相和下相中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.5 雙水相萃取分離柑橘果皮中的黃酮類化合物

在含有[P4446]Br提取液的離心管中加入一定量的檸檬酸鈉溶液，充分混合后8 000 r/min離心10 min。離心分層后，記錄上、下相體積，并取上、下相各1 mL進(jìn)行UPLC分析。利用UPLC分析獲得黃酮類化合物的質(zhì)量濃度后，通過式（3）、（4）計(jì)算體系的相比（R）和萃取率（EE）。

式中：Vt和Vb分別代表上相和下相的體積/mL。Ct和Cb分別代表上相和下相中黃酮類化合物的質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.6 UPLC分析

色譜柱：C18柱（2.0 mm×75 mm，2.2 μm），柱溫35 ℃。流動(dòng)相A為0.1%（V/V）甲酸溶液，B為乙腈溶液，流速0.2 mL/min，進(jìn)樣量1 μL，檢測波長280 nm。洗脫梯度為0～4 min，20%～30% B；4～4.1 min，30%～50% B；4.1～10 min，50%～60% B；10～11 min，60%～20% B。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

顯著性差異采用IBM SPSS Statistics 21.0進(jìn)行分析，P＜0.05，差異顯著。響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行分析。Origin 2018軟件用于所有的圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液和柑橘果皮樣品的UPLC分析

本研究首先通過UPLC分析柑橘果皮提取物的成分，結(jié)果如圖1所示。根據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間相比，共鑒定出蕓香柚皮苷與橙皮苷2 種主要化合物。峰面積結(jié)果表明蕓香柚皮苷與橙皮苷的峰面積之和占到總峰面積的90%以上，因此使用蕓香柚皮苷與橙皮苷作為柑橘黃酮的代表，用于評(píng)價(jià)后續(xù)試驗(yàn)因素。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液（a）和柑橘果皮樣品（b）的UPLC圖Fig. 1 UPLC of mixed standard solution (a) and flavonoids extracted from citrus peel (b)

2.2 離子液體-超聲輔助提取

2.2.1 離子液體的篩選

本研究對(duì)6 種膽堿類離子液體和3 種季鏻鹽類離子液體的提取率進(jìn)行了比較，結(jié)果如圖2所示。方差分析結(jié)果表明，除[HOEtN1,1,1][NO3]外，3 種季鏻鹽類離子液體對(duì)柑橘果皮黃酮的提取率顯著高于其余膽堿類離子液體（P＜0.05）。其中，[P4446]Br的提取率最高，對(duì)柑橘果皮黃酮的提取率達(dá)到56.15 mg/g。與[P4444]Br和[P2444]Br相比，[P4446]Br具有更長的碳鏈長度。碳鏈長度的增加能夠增強(qiáng)離子液體的疏水性，有利于其與疏水性黃酮類化合物間的相互作用，提高黃酮類化合物提取率[28]。因此，選擇[P4446]Br作為提取溶劑進(jìn)行后續(xù)研究。

圖2 離子液體類型對(duì)柑橘果皮黃酮提取率的影響Fig. 2 Effects of IL types on the extraction yield of flavonoids from citrus peel

2.2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖3 離子液體質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）、提取溫度（D）和pH值（E）對(duì)柑橘果皮黃酮提取率的影響Fig. 3 Effects of IL concentration (A), solid-to-liquid ratio (B),ultrasonication time (C), extraction temperature (D), and pH (E) on the extraction yield of flavonoids from citrus peel

本研究對(duì)離子液體質(zhì)量分?jǐn)?shù)（30%～70%）、料液比（1∶10～1∶50（g/mL））、提取時(shí)間（5～40 min）、提取溫度（20～60 ℃）、pH值（3～11）共5 個(gè)單因素進(jìn)行考察。不同單因素條件下，柑橘果皮中黃酮類化合物的提取率如圖3所示。方差分析結(jié)果表明，離子液體濃度、料液比、提取時(shí)間以及提取溫度均對(duì)柑橘果皮黃酮的提取率存在顯著性影響（P＜0.05），而pH值無顯著性影響。如圖3A所示，當(dāng)離子液體質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于40%時(shí)，隨著離子液體質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，提取率有明顯的提升，當(dāng)離子液體質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于50%時(shí)，提取率開始下降。離子液體質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加會(huì)導(dǎo)致溶劑體系的黏度增加，降低溶劑滲透到植物組織的能力，從而阻礙了黃酮類化合物在溶液中的溶解[29]。如圖3B所示，當(dāng)料液比為1∶20（g/mL）時(shí)，溶劑可能滲透不完全，使得其提取率低[30-31]。隨著液體使用量的增加，樣品和溶劑之間的接觸面積隨之增加，提高了溶劑對(duì)目標(biāo)黃酮的提取量。然而，料液比低于1∶20時(shí)，可能存在稀釋效應(yīng)導(dǎo)致提取率緩慢下降。因此，最優(yōu)料液比為1∶20（g/mL）。如圖3C所示，超聲時(shí)間在10 min時(shí)達(dá)到最好的提取效果。超聲時(shí)間越長，溶劑與柑橘果皮粉末中的組織接觸越徹底，然而黃酮類化合物在較長的超聲時(shí)間下可能會(huì)降解，從而導(dǎo)致提取率降低[32]。如圖3D所示，隨著溫度從20 ℃升至40 ℃，柑橘果皮中的黃酮類化合物的提取率隨著溫度升高而增加。這是因?yàn)檫m當(dāng)?shù)母邷乜梢越档碗x子液體溶液的黏度，加速溶質(zhì)的傳質(zhì)[33]。但是，當(dāng)溫度高于40 ℃時(shí)，提取率下降，可能是由于較高的溫度導(dǎo)致黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)受到破壞。

2.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化離子液體-超聲輔助提取條件

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇離子液體質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比以及提取溫度為考察因素，根據(jù)響應(yīng)面分析法Box-Behnken原理進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 Arrangement and results of three-factors/three-level Box-Behnken design

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)表1中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，得到黃酮提取率（Y）與離子液體質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）和提取溫度（C）的二次回歸方程為：Y＝60.67-0.39A+0.11B+3.63C+0.33AB+2.30AC-4.74BC-2.16A2-0.46B2+0.67C2。

對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，由表2可知，該回歸模型影響極為顯著（P＜0.000 1），且失擬項(xiàng)不顯著（P=0.196 0＞0.05），模型的回歸系數(shù)R2為0.984 7，表明模型對(duì)實(shí)驗(yàn)值擬合結(jié)果良好。因此，可以利用擬合得到的模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測，獲得最佳試驗(yàn)條件[34]。分別對(duì)各因素進(jìn)行顯著性分析，發(fā)現(xiàn)C、AC、BC、A2對(duì)應(yīng)的P＜0.05，說明這幾個(gè)因素對(duì)柑橘果皮中黃酮類化合物的提取率產(chǎn)生顯著性影響。

表2 響應(yīng)面二次回歸模型的方差分析Table 2 Analysis of variance for the response surface quadratic regression model

圖4 各因素交互作用對(duì)黃酮類化合物提取率的響應(yīng)面分析Fig. 4 Response surface plots for the interactive effect of various factors on the extraction yield of flavonoids

圖4 為以黃酮提取率為響應(yīng)值，離子液體質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比和提取溫度之間交互作用的三維響應(yīng)面圖。通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化出離子液體-超聲輔助提取柑橘果皮黃酮的最佳條件為離子液體質(zhì)量分?jǐn)?shù)53.68%、料液比1∶10（g/mL）、提取溫度50 ℃，在此條件下柑橘果皮中黃酮的提取率理論上可達(dá)69.42 mg/g。實(shí)際提取時(shí)，調(diào)整試驗(yàn)條件為離子液體質(zhì)量分?jǐn)?shù)54%、料液比1∶10（g/mL）、提取溫度50 ℃，在此條件下柑橘果皮黃酮的實(shí)際提取率為69.13 mg/g，與理論值非常接近，說明模型預(yù)測結(jié)果比較準(zhǔn)確。

2.3 離子液體雙水相萃取分離柑橘果皮黃酮

2.3.1 雙水相體系相圖的繪制

本研究采用雙水相萃取對(duì)[P4446]Br提取液中的黃酮類化合物進(jìn)行進(jìn)一步的分離和純化。檸檬酸鈉屬于有機(jī)鹽，易于生物降解，對(duì)環(huán)境污染小。因此，采用檸檬酸鈉和[P4446]Br構(gòu)建雙水相體系，并測定其相圖，結(jié)果如圖5所示?？梢钥闯?，檸檬酸鈉能夠很好地和[P4446]Br形成兩相體系，具有較寬的兩相區(qū)域，該雙水相能夠應(yīng)用于[P4446]Br提取液中黃酮類化合物的萃取分離。

圖5 [P4446]Br檸檬酸鈉水ATPS體系相圖（25 ℃）Fig. 5 Phase diagram of ATPS composed of [P4446]Br, sodium citrate and water at 25 ℃

2.3.2 系線長度對(duì)萃取率的影響

不同的系線對(duì)應(yīng)著不同的溶劑組成，因此系線長度是影響雙水相萃取率的重要參數(shù)。通過控制上、下相體積比約為1，本研究考察了4 種不同系線長度（58.63、71.95、80.29和83.88）對(duì)黃酮萃取率的影響。如圖6A所示，當(dāng)相比相等或相近時(shí)，黃酮類化合物的回收率隨著系線長度的增加呈現(xiàn)先增加后幾乎不變的趨勢。具體而言，系線長度由58.63增加到71.95時(shí)，黃酮類化合物的回收率顯著增加（P＜0.05），系線長度超過71.95，黃酮類化合物的回收率沒有明顯變化（P＞0.05）。根據(jù)雙水相相圖，系線長度增加表明檸檬酸鈉含量增加，因此鹽析能力增強(qiáng)，有利于化合物分配到離子液體相，提高萃取效率。因此，選取系線長度為71.95的雙水相體系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3.3 相比對(duì)萃取率的影響

如圖6A所示，系線相同時(shí)，系線所有的點(diǎn)均具有相同的上、下相溶劑組成，但它們的相比不同。為了考察上、下相溶劑組成相同時(shí)相比對(duì)萃取率的影響，本研究在系線長度為71.95的系線上選擇5 個(gè)不同的點(diǎn)進(jìn)行測試。如圖6B所示，黃酮類化合物的萃取率隨著相比的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。當(dāng)相比由0.34增加到1.13時(shí)，黃酮類化合物的萃取率隨相比增加而增加，相比在1.13時(shí)萃取率達(dá)到最大（98.20%），這是由于上相體積的增加能夠溶解更多的溶質(zhì)。而當(dāng)相比高于1.13達(dá)到1.46時(shí)，黃酮類化合物的萃取率有所降低，這主要是因?yàn)檫^多的上相可能存在稀釋效應(yīng)，不利于溶質(zhì)的萃取。因此，選擇系線長度為71.95且相比為1.13的雙水相體系對(duì)黃酮類化合物進(jìn)行萃取分離，萃取率最終達(dá)到98.20%。

圖6 系線長度（A）和相比（B）對(duì)黃酮萃取率的影響Fig. 6 Effects of tieline length (A) and phase ratio (B) on the extraction efficiency of flavonoids

2.4 黃酮類化合物的分離以及離子液體的回收

以萃取是一種從離子液體溶液中分離溶質(zhì)的有效方法。Bogdanov等[35]曾報(bào)道了一種用疏水有機(jī)溶劑分離和回收離子液體的方法。本研究考察了正丁醇、氯仿、乙酸乙酯、正己烷和乙醚5 種以萃取溶劑的以萃取效果。如圖7所示，正己烷和乙醚沒有以萃取能力（回收率為0.00%），氯仿和乙酸乙酯均具有一定的以萃取效果，但兩者的回收率明顯低于正丁醇的回收率。最終，選擇正丁醇為以萃取溶劑對(duì)雙水相中的黃酮類化合物進(jìn)行分離，回收率能夠達(dá)到80.11%。將正丁醇萃取液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后干燥，測定出以萃取的黃酮類化合物純度為76.10%。收集以萃取后的離子液體溶液，循環(huán)使用其作為提取溶劑，可降低實(shí)驗(yàn)成本。

圖7 不同有機(jī)溶劑對(duì)黃酮類化合物的反萃取效果Fig. 7 Back-extraction efficiencies of flavonoids using different organic solvents

3 結(jié) 論

本研究利用離子液體-超聲輔助提取結(jié)合雙水相萃取，建立了一種提取、分離和純化柑橘果皮中黃酮類化合物的有效方法。首先，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化離子液體-超聲輔助提取條件，確定最佳提取條件為離子液體質(zhì)量分?jǐn)?shù)54%、料液比1∶10（g/mL）、提取溫度50 ℃、提取時(shí)間10 min，在此條件下，柑橘果皮黃酮的提取率為69.13 mg/g。其次，采用檸檬酸鈉和離子液體提取液構(gòu)建雙水相體系對(duì)提取液中黃酮類化合物進(jìn)行萃取分離，當(dāng)系線長度為71.95且相比為1.13時(shí)，萃取率高達(dá)98.20%。最后，利用正丁醇作為以萃取溶劑，對(duì)離子液體富集相中的黃酮進(jìn)行分離，回收率可達(dá)80.11%。本研究為柑橘加工副產(chǎn)物中活性成分的制備分離提供了一種新的方法。