江艷艷，粟桂嬌，馬 麗,，黃秋容，于 唱，李麗麗

（1.廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004）

天然香料以其綠色、安全、環(huán)保等特點(diǎn)，日益受到消費(fèi)者的青睞。采用物理提取的方法從動(dòng)、植物體內(nèi)獲取的天然香料遠(yuǎn)不能滿足人們的消費(fèi)需求。利用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得的香料可視為“天然品”[1-3]，附加值高，是天然香精香料研究領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)[4-6]。在微生物轉(zhuǎn)化以應(yīng)中，高效生產(chǎn)菌株的篩選是開(kāi)展微生物轉(zhuǎn)化研究的前提，可以通過(guò)監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)化體系實(shí)現(xiàn)，但工作量非常繁重。因此，建立用于監(jiān)測(cè)生物轉(zhuǎn)化體系的簡(jiǎn)便、快捷、有效的分析方法，對(duì)于實(shí)驗(yàn)菌株的高效篩選具有非常重要的意義。

肉桂醇是風(fēng)信子香精的主香劑，在香石竹、玫瑰、茉莉、鈴蘭、葵花、紫丁香等香精中也經(jīng)常使用，還可用于杏子、桃子、草莓、檸檬等食品及白蘭地酒用香精中[7]。通過(guò)肉桂醛選擇性加氫制備肉桂醇，一直以來(lái)是催化領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[8-9]，但通過(guò)化學(xué)催化法得到的肉桂醇不能視為“天然品”，產(chǎn)品附加值低。利用微生物轉(zhuǎn)化可以實(shí)現(xiàn)由肉桂醛選擇加氫制備肉桂醇，開(kāi)辟了天然肉桂醇的新來(lái)源[10-12]。篩選高活性菌株是提高轉(zhuǎn)化以應(yīng)轉(zhuǎn)化率和以應(yīng)選擇性的有效手段。在微生物轉(zhuǎn)化肉桂醛的以應(yīng)中，肉桂醛容易被氧化成肉桂酸，與產(chǎn)物肉桂醇同時(shí)存在。文獻(xiàn)報(bào)道同時(shí)測(cè)定肉桂醇、肉桂醛和肉桂酸3 個(gè)組分的分析方法主要為色譜法[13-15]。雖然色譜法靈敏度高、可信度強(qiáng)，但設(shè)備價(jià)格昂貴，樣品需要進(jìn)行前分離處理，操作繁瑣耗時(shí)，在生物轉(zhuǎn)化的前期篩菌工作中需要投入較高的成本和精力。

紫外分光光度法操作簡(jiǎn)便、迅速，廣泛應(yīng)用于食品、藥品及精細(xì)化學(xué)品等的分析[16-18]。但是直接掃描肉桂醇、肉桂醛、肉桂酸3 個(gè)組分得到的紫外光譜相互重疊，而且由于生物轉(zhuǎn)化液含有多種有機(jī)培養(yǎng)基及無(wú)機(jī)鹽，成分復(fù)雜，對(duì)產(chǎn)物的測(cè)定會(huì)造成一定的干擾，因此，紫外分光光度法不能直接用于實(shí)驗(yàn)菌株的篩選。

導(dǎo)數(shù)光譜是通過(guò)對(duì)吸收光譜進(jìn)行一階或多階求導(dǎo)變換獲得，是紫外吸收光譜派生的一個(gè)分支。導(dǎo)數(shù)光譜法能從重疊的吸收光譜中分離出多組分樣品各自對(duì)應(yīng)的吸收峰，排除背景和基質(zhì)的干擾，提高重疊譜帶及平坦譜帶的分辨率，可用于定性鑒別和定量分析[19-21]。復(fù)雜的多組分試樣可不經(jīng)分離直接用導(dǎo)數(shù)光譜法進(jìn)行測(cè)定，方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可大大節(jié)省試劑、時(shí)間和人力，被廣泛用于藥品[22-25]、食品[26-29]和生物質(zhì)[30]的分析。但其用于篩選微生物轉(zhuǎn)化菌株的研究還鮮有報(bào)道。本研究利用導(dǎo)數(shù)光譜法的特點(diǎn)，對(duì)3 個(gè)組分的紫外吸收光譜進(jìn)行二階或三階導(dǎo)數(shù)處理，不僅解決了肉桂醇、肉桂醛、肉桂酸3 個(gè)組分紫外光譜相互重疊的問(wèn)題，還消除了轉(zhuǎn)化液培養(yǎng)基對(duì)檢測(cè)的干擾，實(shí)現(xiàn)了3 個(gè)組分的快速測(cè)定。利用該方法對(duì)微生物轉(zhuǎn)化樣品直接進(jìn)行測(cè)定，操作簡(jiǎn)便快捷、成本低、實(shí)用性強(qiáng)，可大大提高利用微生物轉(zhuǎn)化肉桂醛制備天然肉桂醇前期篩菌工作的效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉桂醇標(biāo)準(zhǔn)品（98%）、肉桂酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.5%） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；肉桂醛標(biāo)準(zhǔn)品（98%） 上海麥克林生化科技有限公司；無(wú)水乙醇（分析純） 廣東光華科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

8453紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)Agilent公司；Precisa XB120A分析天平 上海精科天美儀器有限公司；3-18K臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

培養(yǎng)液空白溶液：以培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)菌株的液體培養(yǎng)基作為培養(yǎng)液空白溶液；單一標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取肉桂醇、肉桂醛和肉桂酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，以無(wú)水乙醇為溶劑，配制成質(zhì)量濃度分別為109.4、103.0、102.7 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)液，將其作為儲(chǔ)備液備用。

1.3.2 樣品的制備

在肉桂醛生物轉(zhuǎn)化后的以應(yīng)液中加入等體積的無(wú)水乙醇，充分振蕩混勻后，8 000 r/min離心20 min，取上清液稀釋到一定濃度后用于紫外光譜的測(cè)定。

1.3.3 紫外光譜的采集

準(zhǔn)確移取肉桂醇、肉桂醛和肉桂酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL分別置于10 mL容量瓶中，無(wú)水乙醇作溶劑，配制成系列不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)液。于200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)分別測(cè)定各組分的紫外吸收光譜。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將所測(cè)紫外光譜數(shù)據(jù)導(dǎo)出，然后采用Origin軟件對(duì)數(shù)據(jù)作多階求導(dǎo)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組分檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

2.1.1 多組分紫外吸收光譜

將肉桂醇、肉桂醛、肉桂酸、培養(yǎng)液空白以及各組分的混合物進(jìn)行紫外掃描，其紫外吸收光譜如圖1所示。

圖1 紫外吸收光譜Fig. 1 UV absorption spectra

由圖1可看出，以應(yīng)體系中各組分的紫外吸收光譜相互之間均有部分重疊，難以分辨。

2.1.2 肉桂醛、肉桂酸檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

紫外吸收光譜的導(dǎo)數(shù)光譜能夠有效消除被測(cè)組分與共存組分因重疊所帶來(lái)的吸收干擾。為此，對(duì)肉桂醇、肉桂醛、肉桂酸及培養(yǎng)液空白的紫外吸收光譜進(jìn)行二階求導(dǎo)得到相應(yīng)的二階導(dǎo)數(shù)光譜，如圖2所示。

圖2 二階導(dǎo)數(shù)光譜Fig. 2 Second-order derivative spectra

由圖2可看出，在230～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，培養(yǎng)液空白的吸光度二階導(dǎo)數(shù)值為零，對(duì)樣品中其余3 個(gè)組分肉桂醛、肉桂酸和肉桂醇的檢測(cè)沒(méi)有干擾。

在300～350 nm波長(zhǎng)范圍，進(jìn)一步考察不同質(zhì)量濃度肉桂酸、肉桂醛和肉桂醇3 個(gè)組分的二階導(dǎo)數(shù)光譜圖，如圖3所示。

圖3 不同質(zhì)量濃度下肉桂酸、肉桂醛和肉桂醇二階導(dǎo)數(shù)光譜Fig. 3 Second-order derivative UV spectra of cinnamaldehyde and cinnamic acid at different concentrations

由圖3可知，在300～350 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，不同質(zhì)量濃度肉桂醇的二階導(dǎo)數(shù)值始終趨近于0，肉桂醇的紫外吸光度二階導(dǎo)數(shù)值不會(huì)干擾肉桂醛和肉桂酸的測(cè)定；在306 nm波長(zhǎng)處，不同質(zhì)量濃度的肉桂醛二階導(dǎo)數(shù)光譜都相交于一點(diǎn)，且該點(diǎn)的二階導(dǎo)數(shù)值為零，因此，在306 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)肉桂酸，其紫外吸收的二階導(dǎo)數(shù)值不受肉桂醛的干擾，故選取306 nm作為肉桂酸的檢測(cè)波長(zhǎng)；在320 nm波長(zhǎng)處，不同質(zhì)量濃度肉桂酸所對(duì)應(yīng)的吸光度趨于零，同理可選取320 nm作為肉桂醛的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.3 肉桂醇的檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

由于培養(yǎng)液空白、肉桂醇、肉桂醛和肉桂酸的二階導(dǎo)數(shù)光譜在200～300 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)均有吸收，且吸收峰相互重疊，無(wú)法定量分析肉桂醇含量。因此，對(duì)4 種物質(zhì)的紫外吸收光譜進(jìn)行三階求導(dǎo)，得到的三階導(dǎo)數(shù)光譜如圖4所示。

圖4 三階導(dǎo)數(shù)光譜Fig. 4 Third-order derivative UV spectra

由圖4可知，在235～275 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，培養(yǎng)液空白、肉桂醛和肉桂酸的紫外吸收三階導(dǎo)數(shù)值都趨于零，對(duì)肉桂醇的紫外吸收三階導(dǎo)數(shù)值的測(cè)定無(wú)干擾，故實(shí)驗(yàn)選取干擾最小且有最大紫外吸收三階導(dǎo)數(shù)值的256 nm作為肉桂醇的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 工作曲線線性回歸方程

按2.1.2節(jié)所述方法獲得肉桂酸和肉桂醛的二階導(dǎo)數(shù)光譜，分別選取肉桂酸在306 nm和肉桂醛在320 nm波長(zhǎng)處的二階導(dǎo)數(shù)值為定量指標(biāo)，分別建立肉桂酸和肉桂醛的紫外吸收二階導(dǎo)數(shù)值YII對(duì)質(zhì)量濃度C（mg/L）的工作曲線的線性回歸方程；按2.1.3節(jié)所述方法獲得肉桂醇的三階導(dǎo)數(shù)光譜，選取肉桂醇在256 nm波長(zhǎng)處的三階導(dǎo)數(shù)值為定量指標(biāo)，建立肉桂醇的紫外吸收三階導(dǎo)數(shù)值YIII對(duì)質(zhì)量濃度C（mg/L）的工作曲線的線性回歸方程，結(jié)果如表1所示。

表1 線性回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)Table 1 Linear regression equations, linear ranges and correlation coefficients

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

在低、中、高不同質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，取不同質(zhì)量濃度的肉桂酸、肉桂醛和肉桂醇溶液各3 份。在306 nm和320 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定肉桂酸和肉桂醛的吸光度二階導(dǎo)數(shù)值，在256 nm波長(zhǎng)處測(cè)定肉桂醇的吸光度三階導(dǎo)數(shù)值，并分別計(jì)算測(cè)量結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果如表2所示，各組分的RSD（n=6）均不超過(guò)5%，具有良好的重復(fù)性。

表2 精密度測(cè)定（n=6）Table 2 Precision of the presented method (n= 6)

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)

模擬肉桂醛轉(zhuǎn)化體系，在培養(yǎng)液空白液中分別加入一定量的肉桂醛（3.78 mg/L）、肉桂酸（1.93 mg/L）、肉桂醇（2.16 mg/L），分別按低、中、高3 個(gè)質(zhì)量濃度加入各組分的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。肉桂醛、肉桂酸和肉桂醇平均回收率分別為103.3%、104.1%和98.0%，RSD分別為4.1%、2.1%和3.5%。

表3 回收率測(cè)定（n=3）Table 3 Recoveries of the method (n= 3)

2.5 樣品的測(cè)定

按1.3.2節(jié)方法處理3 批不同質(zhì)量濃度的樣品，并按1.3.3節(jié)方法對(duì)樣品進(jìn)行紫外掃描和分析處理，平行測(cè)定6 次，結(jié)果如表4所示，其RSD（n=6）均小于4%，表明該方法穩(wěn)定可靠。

表4 樣品測(cè)定結(jié)果（n=6）Table 4 Quantitative results for actual samples (n= 6)

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)表明，通過(guò)對(duì)紫外吸收光譜進(jìn)行數(shù)學(xué)變換為多階導(dǎo)數(shù)光譜測(cè)定生物轉(zhuǎn)化液中的肉桂醛、肉桂酸和肉桂醇，不僅能夠消除在生物催化以應(yīng)中的媒介（培養(yǎng)液空白）對(duì)樣品測(cè)定的干擾，同時(shí)也能消除各組分樣品相互影響所帶來(lái)的測(cè)定誤差。該方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、適用性強(qiáng)，相比于傳統(tǒng)的色譜法，避免了萃取、分離等繁瑣操作以及價(jià)格昂貴、成本高、分析時(shí)間過(guò)長(zhǎng)所帶來(lái)的不便，適合頻繁和大量的前期篩菌工作的測(cè)量，能夠廣泛使用。