王 璐，王偉偉，王艷霞，張 瑤,，宋元達

（1.山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，山東 淄博 255000；2.淄博市中心醫(yī)院，山東 淄博 255020）

乳酸菌是指能發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸并在自然界中廣泛分布的一類革蘭氏陽性細菌的通稱[1-3]。由于乳酸菌具有營養(yǎng)、健康的特殊功效，風(fēng)靡在歐、美、日、韓等市場，并被廣泛應(yīng)用于保健食品、飲料、肉制品、乳制品等食品及預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[4-10]。近年來關(guān)于乳酸菌發(fā)酵水果蔬菜飲料的研究日益增多。果蔬經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵后營養(yǎng)成分得到很好的保留和細化，不僅風(fēng)味極佳，酸甜可口，營養(yǎng)價值也更高[11-14]。目前研究者對多種果蔬原料如南瓜、雪蓮果、蘋果、梨、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、番茄、龍眼、火龍果等單一果蔬或混合果蔬進行乳酸菌發(fā)酵工藝研究[14-20]。如今國內(nèi)市場用于果蔬發(fā)酵的乳酸菌種多為商業(yè)化牛乳發(fā)酵菌種，雖然也有研究者從泡菜、果蔬醬、水果發(fā)酵液中分離篩選乳酸菌[21-23]，但篩選的菌株仍存在利用果蔬能力有限及對發(fā)酵材料和發(fā)酵環(huán)境適用性差的問題。因此，開發(fā)具有優(yōu)良發(fā)酵性能的果蔬發(fā)酵專用菌株至關(guān)重要。本研究采用強酸、高鹽和高糖的MRS培養(yǎng)基從自然發(fā)酵蘋果原漿樣品中分離篩選出乳酸菌種并進行生理生化和分子生物學(xué)鑒定，同時通過測定菌體干質(zhì)量、活菌數(shù)、pH值和酸度等指標對乳酸菌在MRS培養(yǎng)基和果蔬原漿中的發(fā)酵性能進行分析。該研究有望為豐富果蔬發(fā)酵專用菌種庫以及開發(fā)新型果蔬發(fā)酵產(chǎn)品提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

沂源山地蘋果產(chǎn)區(qū)自然發(fā)酵蘋果原漿樣品。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS分離培養(yǎng)基：牛肉膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，吐溫80 1 g/L，葡萄糖50 g/L，乙酸鈉5 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，檸檬酸二銨2 g/L，溴甲基酚紫0.4 g/L，酵母提取物5 g/L，瓊脂15～20 g/L，pH 6.3～6.7，121 ℃濕熱滅菌30 min。

初篩培養(yǎng)基：在MRS分離培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加0.5%碳酸鈣，乳酸調(diào)pH 2.0。

高鹽復(fù)篩培養(yǎng)基：在MRS分離培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加10%氯化鈉和0.5%碳酸鈣。

高糖復(fù)篩培養(yǎng)基：在MRS分離培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上將葡萄糖質(zhì)量分數(shù)提高到30%，添加0.5%碳酸鈣。

明膠培養(yǎng)基：蛋白胨25 g/L，牛肉膏7.5 g/L，氯化鈉 5 g/L，明膠100 g/L，pH 7.0～7.2，121 ℃濕熱滅菌15 min。

果蔬發(fā)酵培養(yǎng)基：將蘋果、胡蘿卜、西瓜、西紅柿等水果、蔬菜清洗去皮切分后分別榨汁除渣制得發(fā)酵果醬，然后按1∶1∶1∶1比例混合經(jīng)巴氏滅菌后4 ℃冷藏。按照混合果蔬汁33.3%、葡萄糖5%、蔗糖5%、氯化鈣0.5%、磷酸氫二鈉0.05%、磷酸二氫鈉0.05%、硫酸鎂0.03%、檸檬酸0.1%的配比配制，除果蔬和檸檬酸外其余成分于115 ℃濕熱滅菌15 min。

菌種生理生化鑒定用培養(yǎng)基見文獻[24-25]。

1.2 儀器與設(shè)備

QHZ-12A隔水式恒溫培養(yǎng)箱 江蘇盛藍儀器制造有限公司；紫外分光光度計 島津企業(yè)管理（中國）有限公司；高溫高壓滅菌鍋 廈門森態(tài)儀器儀表有限公司；分析天平 德國Mettler-Toledo公司；TH-YJ-1450A/B型凈化工作臺 蘇州華科凈化設(shè)備有限公司；PHS-25數(shù)顯pH計 上海雷磁儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離篩選

取沂源山地蘋果產(chǎn)區(qū)自然發(fā)酵蘋果原漿，用0.9%滅菌生理鹽水進行10 倍梯度稀釋后，吸取適宜稀釋度溶液涂布至MRS分離培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)24 h，挑取菌落黃色范圍大并具有乳酸菌典型特征的單菌落，進行革蘭氏染色觀察菌體形態(tài)。將革蘭氏染色陽性菌落接種于MRS培養(yǎng)基，37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)24 h，重復(fù)劃線培養(yǎng)，連續(xù)傳代培養(yǎng)不少于3 次，直至得到單菌種純培養(yǎng)物，作為乳酸菌備選菌株。

將備選菌株分別接種在初篩培養(yǎng)基，37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)24 h，然后挑選目標菌落繼續(xù)在高鹽復(fù)篩培養(yǎng)基中進行篩選，挑選黃色鈣圈明顯的單菌落繼續(xù)點接在高糖復(fù)篩培養(yǎng)基，37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)24 h，挑取明顯變黃的菌落轉(zhuǎn)至MRS固體斜面，低溫保藏備用。

1.3.2 乳酸菌的鑒定

1.3.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

菌落形態(tài)：將菌株活化后接種在MRS固體平板上培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)；革蘭氏染色：將菌株進行革蘭氏染色觀察菌體細胞形態(tài)。

1.3.2.2 耐受性分析

將菌株甘油凍存管分別活化至菌體濃度調(diào)至2.5×108CFU/mL，然后分別接種于pH 2.0～3.0、NaCl質(zhì)量分數(shù)5.0%～10.0%或葡萄糖質(zhì)量分數(shù)10.0%～30.0%的MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)，于0 h和3 h分別取樣進行活菌計數(shù)，以0 h樣品為對照，按式（1）計算樣品中菌株的存活率：

1.3.2.3 生理生化鑒定

對分離菌株進行過氧化氫酶以應(yīng)、硫化氫、明膠液化、吲哚產(chǎn)生、石蕊牛乳、乳酸紙層析以及碳水化合物利用等實驗，結(jié)果對照《伯杰細菌鑒定手冊》[26]進行綜合評定。

過氧化氫酶以應(yīng)：將篩選菌株接于MRS斜面培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h后，滴加幾滴過氧化氫溶液，觀察是否產(chǎn)生氣泡。

硫化氫實驗：將篩選菌株接種于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基中，20 ℃培養(yǎng)7 d觀察是否變黑。

明膠液化實驗：將篩選菌株接種于明膠培養(yǎng)基試管，20 ℃培養(yǎng)觀察菌生長情況及明膠是否融化。

吲哚實驗：將篩選菌株接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，后加入乙醚和吲哚試劑，觀察液層界面呈現(xiàn)玫瑰色則為陽性，否則為陰性。

石蕊牛乳實驗：將篩選菌株接種于石蕊牛乳試管中，37 ℃培養(yǎng)1、3、5、7、14 d觀察有無酸凝、酶凝、胨化、還原等現(xiàn)象。

乳酸紙層析實驗：將篩選菌株的發(fā)酵培養(yǎng)液、2%乳酸及空白培養(yǎng)液點在濾紙上，放入裝有展層劑（水-正丁醇-苯甲醇體積比為1∶5∶5）的層析缸，約10 h后，取出濾紙風(fēng)干。向濾紙均勻噴灑0.04%溴酚藍乙醇溶液顯色，對比樣品與乳酸所出現(xiàn)黃色斑點位置，計算Rf值以判斷樣品中是否含有乳酸。

碳水化合物利用實驗：將篩選菌株接入各種碳水化合物培養(yǎng)試管，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察試管中培養(yǎng)物顏色變化及有無氣體產(chǎn)生。

1.3.2.4 菌株的16S rRNA分子鑒定

將篩選菌株送至生工生物工程（上海）股份有限公司測定16S rRNA序列。

1.3.3 乳酸菌發(fā)酵性能測定

將篩選出的耐酸、耐鹽、耐糖菌株進行活化、擴培后，按5%接種量分別接種于果蔬發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)，定時取樣，測定各發(fā)酵時間點的生物量、活菌數(shù)、pH值、酸度等（自發(fā)酵始每隔3 h測定生物量、pH值和酸度，每隔12 h測定活菌數(shù)），每次測定重復(fù)3 次。

生物量：測定樣品在600 nm波長處的OD值，根據(jù)時間和OD600nm值繪制菌株生長曲線；菌體干質(zhì)量：定量取5 mL菌體烘干至質(zhì)量恒定，稱質(zhì)量計算；pH值：采用pH計直接測定；活菌數(shù)：采用伊紅美藍活菌數(shù)快速測定方法[27]測定；酸度（以乳酸濃度計）：采用酸堿滴定法測定[25,28]，具體步驟如下：吸取果蔬發(fā)酵液10 g，用0.1 mol/L NaOH標準溶液滴定并邊滴定邊攪拌測定pH值，滴定至pH值為8.2，記錄標準NaOH用量，同時做空白對照，按式（2）計算發(fā)酵液酸度：

式中：C為NaOH標準溶液的濃度/（mol/L）；V為滴定至pH 8.2時消耗的NaOH溶液的用量/mL；K為乳酸轉(zhuǎn)化系數(shù)，0.09；m為吸取發(fā)酵液體積/mL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均設(shè)置3 次重復(fù)，實驗結(jié)果采用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析。圖表采用Origin Pro 8.0進行處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌篩選及形態(tài)學(xué)鑒定

在以溴甲基酚紫為指示劑的MRS分離培養(yǎng)基上，從蘋果樣品中分離出36 株變黃明顯，且具有乳酸菌典型菌落形態(tài)特征的菌株（圖1a）。其中有10 株產(chǎn)酸較強，菌株編號見表1，其菌體形態(tài)特征和鏡檢結(jié)果見圖1b和表1。

圖1 MRS分離培養(yǎng)基上菌落形態(tài)（a）和菌體形態(tài)（b）Fig. 1 Colony morphology (a) and bacterial morphology (b) on MRS medium

表1 菌落及菌體形態(tài)特征Table 1 Colony and bacterial morphology characteristics

溶鈣圈可以作為衡量產(chǎn)酸能力的重要指標[25]。10 株疑似菌中有4 株在初篩培養(yǎng)基生長良好，產(chǎn)生較大的溶鈣圈，表明這4 株菌耐酸能力強產(chǎn)酸多，將這4 株菌在含高鹽和高糖的復(fù)篩培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)僅有2 株生長較好，能夠耐受高鹽高糖環(huán)境，這2 株菌分別為S3-10和R10。將這2 株菌分別接種于不同pH值（pH 2.0～3.0）、鹽質(zhì)量分數(shù)（5.0%～10.0%）或葡萄糖質(zhì)量分數(shù)（10.0%～30.0%）的MRS培養(yǎng)基中進行耐受性驗證（表2），結(jié)果表明2 株菌的存活率都能保持在85%以上，均能耐受較低的pH值環(huán)境和高鹽、高糖環(huán)境。

表2 菌株耐受性實驗的存活率Table 2 pH, NaCl and glucose tolerance (survival rate) of two strains%

2.2 乳酸菌生理生化鑒定

由表3可得，2 株菌在過氧化氫酶實驗、硫化氫實驗、明膠液化實驗、吲哚實驗等生化以應(yīng)均呈陰性。石蕊牛乳實驗中，2 株菌培養(yǎng)后使石蕊褪色，并且大量產(chǎn)酸使得牛乳凝固。乳酸紙層析實驗中，2 株菌的發(fā)酵液與乳酸對照相比，Rf值相近，說明兩菌株發(fā)酵產(chǎn)物中含有乳酸。碳水化合物利用實驗結(jié)果表明，2 株菌對多種糖醇如葡萄糖、乳糖、麥芽糖、山梨醇、甘露醇、蔗糖、纖維二糖、甘露糖、半乳糖、核糖等都能夠利用，且發(fā)酵葡萄糖均產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。這與前期有關(guān)乳酸菌糖醇利用的實驗結(jié)果一致[25,29]。

表3 菌株部分生理生化鑒定實驗結(jié)果Table 3 Partial physiological and biochemical properties of two strains

2.3 菌株16S rRNA鑒定

將篩選菌株S3-10和R10送至生工生物工程（上海）股份有限公司測定16S rRNA序列。將測定的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)S3-10菌株與植物乳桿菌同源性高達99%。結(jié)合S3-10菌株的形態(tài)特征及生理生化指標測定等表型鑒定結(jié)果，將S3-10菌株鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，菌種保藏號CGMCC No.16750）。同理，將R10菌株鑒定為干酪乳桿菌（L. casei，菌種保藏號CGMCC No.16750）。

2.4 乳酸菌發(fā)酵性能分析

2.4.1 乳酸菌生長情況分析

圖2 2 株乳酸菌在MRS培養(yǎng)基上的生長曲線及活菌數(shù)變化Fig. 2 Growth curves and viable cell counts of two strains cultured on MRS medium

由圖2可知，2 株乳酸菌生長趨勢大致相同，均無延滯期，很快進入對數(shù)生長期，并在發(fā)酵20 h進入穩(wěn)定期，隨后生長速率逐漸放慢并達到飽和。植物乳桿菌S3-10比干酪乳桿菌R10生長速率略快，最終獲得的最大菌體干質(zhì)量S3-10為3.68 g/L，R10為3.49 g/L。發(fā)酵基質(zhì)中活菌數(shù)變化以映菌種利用發(fā)酵基質(zhì)性能的強弱[25]。圖2顯示，植物乳桿菌S3-10在發(fā)酵12 h時活菌數(shù)增加且在36 h之前活菌數(shù)均達到109CFU/mL，之后活菌數(shù)略有下降，但在84 h內(nèi)活菌數(shù)始終保持在108CFU/mL以上。干酪乳桿菌R10發(fā)酵活菌數(shù)變化趨勢與植物乳桿菌S3-10大體一致，但活菌數(shù)在發(fā)酵36 h后低于S3-10，發(fā)酵72 h內(nèi)活菌數(shù)保持在108CFU/mL。

圖3 2 株乳酸菌在MRS培養(yǎng)基上發(fā)酵的pH值和酸度變化Fig. 3 Changes in pH and acidity of two strains cultured on MRS medium

發(fā)酵液中pH值的變化幅度也可以映菌株發(fā)酵性能的優(yōu)劣。pH值的降低不僅說明菌株對發(fā)酵基質(zhì)的利用率高，還能影響一些不耐酸的微生物的生長繁殖。如圖3所示，2 株乳酸菌的發(fā)酵過程中pH值的下降趨勢大致相似。發(fā)酵前期（前24 h）pH值下降迅速，這與發(fā)酵前期乳酸菌大量增殖有關(guān)；發(fā)酵后期，由于代謝產(chǎn)物、pH值等因素抑制，乳酸菌活菌數(shù)降低漸進入穩(wěn)定期，此時pH值下降緩慢直至趨于穩(wěn)定，pH值分別達到2.15（S3-10）和3.0（R10）。植物乳桿菌S3-10 pH值下降速率明顯比干酪乳桿菌R10快，說明植物乳桿菌S3-10受條件抑制影響較小，生長情況較好。酸度值是衡量菌株發(fā)酵產(chǎn)酸能力的重要指標。由圖3可以看出，2 株乳酸菌酸度趨勢大致相同，在發(fā)酵10～36 h產(chǎn)酸速率最快，之后酸度增幅不大。植物乳桿菌S3-10酸度明顯高于干酪乳桿菌R10，最終發(fā)酵結(jié)束獲得的最大酸度約為35 μmol/L，是干酪乳桿菌R10產(chǎn)酸量的1.75 倍。

2.4.2 乳酸菌果蔬發(fā)酵性能分析

將2 株乳酸菌接入天然果蔬原漿中進行發(fā)酵，由圖4可知，2 株乳酸菌無論在果蔬原料還是MRS培養(yǎng)基上生長趨勢均大致相同，接種后立即進入對數(shù)生長期，并在發(fā)酵24 h進入穩(wěn)定期直至發(fā)酵結(jié)束。植物乳桿菌S3-10生長速率仍略高于干酪乳桿菌R10，最終獲得的最大菌體干質(zhì)量S3-10為5.4 g/L，R10為5.08 g/L。對發(fā)酵液中活菌數(shù)測定結(jié)果（圖4）表明，2 株乳酸菌發(fā)酵果蔬過程中均保持較高的活菌數(shù)，且活菌數(shù)變化趨勢大體一致。植物乳桿菌S3-10在發(fā)酵第12小時活菌數(shù)增加且在48 h之前活菌數(shù)均達到109CFU/mL，之后活菌數(shù)略有下降，但在72 h內(nèi)活菌數(shù)始終保持在108CFU/mL以上。干酪乳桿菌R10發(fā)酵活菌數(shù)在發(fā)酵24 h后略低于S3-10，發(fā)酵60 h內(nèi)活菌數(shù)保持在108CFU/mL。已有研究結(jié)果表明[19,30]，多數(shù)乳酸菌發(fā)酵果蔬24 h后活菌數(shù)明顯下降，且48 h就已降到105CFU/mL以下。而本研究所篩選的2 株乳酸菌發(fā)酵果蔬均能保持較長時間的高活菌數(shù)，更適用于果蔬汁的發(fā)酵。

圖4 2 株乳酸菌發(fā)酵果蔬過程中菌體干質(zhì)量及活菌數(shù)變化Fig. 4 Changes in dry cell mass and viable cell counts of two strains during fermentation of fruits and vegetables

圖5 2 株乳酸菌發(fā)酵果蔬過程中pH值和酸度變化Fig. 5 Changes in pH and acidity during fermentation of fruits and vegetables by two strains

混合果蔬原料中酸度、糖度相比于普通培養(yǎng)基都較高。如圖5所示，2 株乳酸菌在果蔬發(fā)酵過程中pH值的下降趨勢和產(chǎn)酸趨勢大致相似。發(fā)酵前期（前24 h）pH值下降迅速，之后pH值下降緩慢直至趨于穩(wěn)定，最終pH值分別達到2.81（S3-10）和2.98（R10）。已有研究結(jié)果表明[19,25,30]，多數(shù)乳酸菌發(fā)酵果蔬pH值變化趨勢和本研究一致，且發(fā)酵結(jié)束pH值均降到3左右。本研究pH值在24 h后即已降到3以下，而此時仍能保持較高的活菌數(shù)，說明這2 株乳酸菌受條件抑制影響較小。在發(fā)酵10～24 h產(chǎn)酸速率最快，之后酸度增幅不大。與MRS培養(yǎng)基發(fā)酵結(jié)果相同，植物乳桿菌S3-10產(chǎn)酸量明顯高于干酪乳桿菌R10，最終發(fā)酵結(jié)束獲得的最大酸度約為22.6 μmol/L，是干酪乳桿菌R10酸度的1.26 倍。以上結(jié)果說明2 株乳酸菌對果蔬原料的利用率都較高，在果蔬發(fā)酵液中生長良好。

3 結(jié) 論

本研究從沂源山地蘋果產(chǎn)區(qū)自然發(fā)酵蘋果原漿樣品中分離篩選出2 株具有良好的耐酸、耐鹽、耐糖特性的乳酸菌，經(jīng)生理生化及分子生物學(xué)鑒定分別為植物乳桿菌S3-10和干酪乳桿菌R10。乳酸菌S3-10和R10均能較好地適應(yīng)果蔬發(fā)酵基質(zhì)，生長繁殖旺盛、產(chǎn)酸速率快，其中植物乳桿菌S3-10生長量和產(chǎn)酸量顯著高于干酪乳桿菌R10，在發(fā)酵果蔬汁、開發(fā)功能益生產(chǎn)品方面有更廣闊的應(yīng)用前景。植物乳桿菌和干酪乳桿菌是果蔬乳酸發(fā)酵的常用菌種，菌株S3-10和R10發(fā)酵果蔬性能優(yōu)異，可進一步嘗試將2 株菌混合或與其他乳酸菌協(xié)同發(fā)酵果蔬原料，開發(fā)出營養(yǎng)保健功能更強的果蔬汁或功能益生產(chǎn)品。