劉玥佳，韓業(yè)君，彭文君，牛慶生，方小明，趙亞周，田文禮,

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093；2.中國科學(xué)院過程工程研究所，北京 100190；3.吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所，吉林 吉林 132013）

蜂糧是蜜蜂將蜂花粉、蜂蜜、蜜蜂分泌物等充分混合，經(jīng)特定微生物充分發(fā)酵后，貯存于巢房中供蜜蜂食用的物質(zhì)。其營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨特，是一種極具開發(fā)潛力的發(fā)酵食品[1]。由于從蜂群中直接獲取量少且非常繁瑣，理想的方式是實現(xiàn)離群、工業(yè)化生產(chǎn)，而制約工業(yè)化生產(chǎn)的因素眾多，其中關(guān)鍵是發(fā)酵微生物的確定。對于研究食品中微生物的群落組成及變化，常用的傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法費時、費力，且無法真正解析微生物的組成、豐度及其變化情況。高通量測序技術(shù)可省去培養(yǎng)過程，直接從樣品中提取微生物基因組DNA后進(jìn)行測序分析，結(jié)合生物信息學(xué)工具，能夠檢測出傳統(tǒng)方法無法分離培養(yǎng)的微生物[2-3]。蜂糧發(fā)酵過程中的菌群一直處于動態(tài)變化中，因此，利用高通量測序技術(shù)研究和分析不同發(fā)酵周期的蜂糧菌群構(gòu)成及其演替規(guī)律，具有重要的理論意義和潛在的實用價值。

目前，在食品領(lǐng)域中已有大量將高通量測序技術(shù)用于微生物群落分析的研究[4-6]，例如對干酪、韓國泡菜[7]等發(fā)酵食品中微生物群落結(jié)構(gòu)的分析，揭示了發(fā)酵食品釀造過程中微生物群落結(jié)構(gòu)、豐度變化及其與代謝產(chǎn)物之間的聯(lián)系。蜂糧中菌群豐富，包括乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌、霉菌等，但關(guān)于蜂糧的菌群結(jié)構(gòu)研究還比較少。劉賽[8]從蜂糧中分離純化出39 株菌株，并從這些菌株中篩選出了3 株產(chǎn)酸性能較好的乳酸菌，經(jīng)鑒定分別為：Lactobacillus plantarum、L. casei ssp. casei、L. debrueckii ssp. delbrueckii。Gilliam[9]從人工采集花粉、蜜蜂采集蜂花粉以及貯存在蜂箱中1、2、6 周的（蜂糧）花粉中分離出了6 個屬，113 種酵母菌。此外，花粉中大部分的酵母菌種在蜂糧中并未發(fā)現(xiàn)，這說明蜂糧釀制過程中酵母菌群發(fā)生了變化。張言周等[10]從蜂糧樣品中分離出產(chǎn)芽孢的細(xì)菌，經(jīng)鑒定分別隸屬于Lysinibacillus fusiformis、Bacillus tequilensis、Fictibacillus nanhaiensis、B. aerophilus、B. invictus、B. sonorensis、L. xylanilyticus、B. methylotrophicus等芽孢桿菌；崔學(xué)沛[11]從意蜂蜂糧中篩選得到了B. amyloliquefaciens和B. licheniformis。Gilliam等[12]從蜂糧樣品中分離出了曲霉菌、青霉菌和毛霉菌等霉菌。蘇松坤[13]從不同釀制時期的蜂糧中亦分離出了曲霉菌、青霉菌和毛霉菌等霉菌，由于花粉源植物和地區(qū)的不同，其含量存在一定差異。

目前，通常把蜂糧的發(fā)酵過程分為4 個階段：1）異源微生物生長階段；2）厭氧發(fā)酵起始階段；3）酸化階段；4）穩(wěn)定階段[14]。開始的0.5 d，花粉中營養(yǎng)物質(zhì)豐富，乳酸菌和酵母菌大量繁殖。約在發(fā)酵開始7 d以后，基質(zhì)內(nèi)pH值達(dá)到4.0～4.5，高濃度的乳酸抑制乳酸菌和酵母菌等的生長，某些乳酸菌和酵母菌開始消失，蜂糧釀制完成[15]。乳酸菌在發(fā)酵第0.5天時豐度最高，發(fā)酵第4天時豐度下降，7 d以后乳酸菌含量下降明顯。

卡尼鄂拉蜂（Apis mellifera carnica）采蜜能力強，范圍廣，故本研究以卡尼鄂拉蜂的蜂糧為研究對象，采用Illunina MiSeq高通量測序平臺對細(xì)菌的16S rDNA V4-V5區(qū)進(jìn)行測序，分析蜂糧的微生物群落多樣性及各類微生物的構(gòu)成及變化，明確蜂糧發(fā)酵過程中的優(yōu)勢，為人工蜂糧的生產(chǎn)提供理論依據(jù)，以期更好地提高蜂糧品質(zhì)，推動其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗樣品采集于吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所。采集方法：首先，取樣的第1天，蜂箱中只保留一張大幼蟲脾外，其他脾全部抽出，加一張育過5～6 代蜜蜂的空脾（事先用75%乙醇溶液噴灑消毒）；用隔王柵將蜂王限制在子脾上，使工蜂給空脾裝花粉。5 h后將花粉脾抽出，均勻選取位于巢脾不同位置的蜂糧樣品收集于離心管（已滅菌）中，樣品采集完后置于-80 ℃冰箱凍存。10 h后取下多用器蓋板，第2天早上再蓋回。同時在寄放花粉脾的蜂群內(nèi)加一張大花粉脾供蜂群食用[16]。按照上述方法依次取得發(fā)酵0.5、4、7、12 d的蜂糧樣品。

PowerSoil DNA Isolation Kit （Cat# 12888-50）試劑盒 上海斯信生物科技有限公司；膠回收試劑盒德國Qiagen公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME104E精密天平 梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；Haier磁力攪拌器 常州邁科諾儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蜂糧樣品總DNA提取

由于每個巢房內(nèi)可獲取的蜂糧樣品較少，將若干個巢房的蜂糧樣品混勻進(jìn)行DNA提取以提高DNA濃度，同時使蜂糧樣品更具代表性。參照DNeasy PowerSoil Kit（Cat# 12888-50）試劑盒說明，分別提取不同發(fā)酵時間蜂糧細(xì)菌基因組DNA。所得DNA采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。

1.3.2 蜂糧16S rRNA基因V4-V5區(qū)的擴(kuò)增

利用瓊脂糖凝膠電泳對基因組DNA進(jìn)行初步檢測，即取適量的樣本DNA于離心管中，使用無菌水稀釋樣本至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)揭詰?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）測定。

1.4 蜂糧高通量測序和數(shù)據(jù)分析

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測；切下目的條帶并用膠回收試劑盒回收。委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司基于Illumina MiSeq技術(shù)測序平臺構(gòu)建文庫，進(jìn)行高通量雙末端測序。

得到下機數(shù)據(jù)后利用Barcode序列和PCR擴(kuò)增引物序列進(jìn)行拆分，截去Barcode和引物序列后，使用FLASH[17]對每個樣本的reads進(jìn)行拼接，得到的原始Tags數(shù)據(jù)需要經(jīng)過嚴(yán)格的過濾處理[18]得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)。參照QIIME（Version 1.9.1）[19]的Tags質(zhì)量控制流程，得到最終的有效數(shù)據(jù)。

利用UPARSE軟件（UPARSE v7.0.1001）[20]對所有樣本的全部 Effective Tags進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類成為可操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs），篩選出現(xiàn)頻率最高的OTUs序列作為代表序列。用Mothur方法與SILVA132的SSU rRNA方法將篩選到的OTUs序列進(jìn)行物種注釋并根據(jù)其分類學(xué)信息在各分類水平上進(jìn)行分類統(tǒng)計，分析各個樣本的群落組成[21-22]。

使用QIIME軟件（Version 1.9.1）計算Observed-OTUs、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、ACE指數(shù)、Coverage指數(shù)，使用R軟件（Version 2.15.3）繪制稀釋曲線，并進(jìn)行α多樣性指數(shù)組間差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂糧樣品總DNA的提取

提取蜂糧基因組總DNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測其DNA完整性，結(jié)果如圖1所示，可進(jìn)行后續(xù)測序。

圖1 蜂糧細(xì)菌基因組DNA提取Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of bacterial genomic DNA samples extracted from bee bread

2.2 蜂糧發(fā)酵過程中細(xì)菌群落的α多樣性分析

利用稀釋曲線評價蜂糧菌群的測序深度和物種豐富度。從圖2可以看出，隨著測序深度增加，稀釋曲線基本達(dá)到飽和，說明樣本的測序數(shù)據(jù)量足以以應(yīng)蜂糧中的微生物多樣性。

每個樣品的Coverage指數(shù)、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)分別用于評估物種的測序深度、豐度和多樣性。Coverage指數(shù)以映了樣本的真實情況，Coverage指數(shù)越高，則樣本中序列沒有被測出的概率越低；Chao1指數(shù)是群落豐度指數(shù)，Chao1指數(shù)越大，表明樣品微生物群落豐度越高；Shannon指數(shù)是群落分布多樣性指數(shù)，Shannon指數(shù)越大，表明樣品微生物多樣性越高；OTUs數(shù)量亦可以代表樣品物種的豐度[23]。由表1可知，不同發(fā)酵周期的蜂糧中微生物Coverage指數(shù)都大于0.99，說明樣品文庫中序列基本上都被測出，即樣本測序結(jié)果可以以映樣品的真實情況。隨著發(fā)酵時間的延長，Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)先升高后降低，發(fā)酵中期，物種豐富度達(dá)到最高。由圖3可知，4 個樣品共得到429 個OTUs，不同發(fā)酵周期共有OTUs數(shù)為99，各個時期獨有的OTUs數(shù)相對較少。

圖2 蜂糧測序樣品稀釋曲線Fig. 2 Rarefaction curves of bee bread

表1 α多樣性指數(shù)Table 1 α Diversity indices of different samples

圖3 OTUs分布Venn圖Fig. 3 Venn diagram showing the distribution of OTUs

2.3 蜂糧菌群多樣性

2.3.1 基于門分類水平的蜂糧菌群多樣性分析

圖4 蜂糧菌群基于門分類水平的分布Fig. 4 Bacterial distribution at the phylum level

如圖4所示，高通量測序分析表明蜂糧菌群主要由軟壁菌門（Tenericutes）、廣古菌門（Euryarchaeota）、（Acetothermia）、奇古菌門（Thaumarchaeota）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、生氧光細(xì)菌門（Oxyphotobacteria）、螺旋體門（Spirochaetes）等組成。隨著發(fā)酵時間的延長，基于門水平的微生物多樣性發(fā)生了變化。

不同發(fā)酵周期的蜂糧在門分類水平上，優(yōu)勢菌門所占比例相似，生氧光細(xì)菌和變形菌的含量最高，為優(yōu)勢菌群。發(fā)酵時間為0.5、4、7、12 d的蜂糧中生氧光細(xì)菌和變形菌的含量分別為：90.2%、89.0%、85.6%、92.2%；1.7%、4.2%、5.6%、1.5%。

衣原體門（C hla m y dia e）、梭桿菌門（Fusobacteria）、泉古菌門（Crenarchaeota）在發(fā)酵初期含量比較少，而在發(fā)酵4、7、12 d的蜂糧樣品中均未檢測出，可能是來自于蜂花粉，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，加上蜜蜂的轉(zhuǎn)化，這幾種菌逐漸消失。Calditrichaeota、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）在發(fā)酵0.5、4、7 d的蜂糧中均未檢測出，而在發(fā)酵12 d的蜂糧中少量存在，說明其產(chǎn)生于蜂糧的發(fā)酵后期。

2.3.2 基于綱分類水平的蜂糧菌群多樣性分析

如圖5所示，高通量測序分析表明蜂糧菌群主要由unidentified Oxyphotobacteria、α-變形桿菌綱（Alphaproteobacteria）、γ-變形桿菌綱（Gammaproteobacteria）、擬桿菌綱（Bacteroidia）、梭菌綱（Clostridia）、δ-變形菌綱（Deltaproteobacteria）、桿菌綱（Bacilli）、Nitrososphaeria、unidentified Actinobacteria、酸微菌綱（Acidimicrobiia）等組成。隨著發(fā)酵時間的延長，基于綱水平的微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。Nitrososphaeria和Acidimicrobiia在發(fā)酵第0.5天和12天時均為0，僅在發(fā)酵中期存在。

蜂糧中主要的菌群為生氧光細(xì)菌門Oxyphotobacteria，在蜂糧中占到了80%以上，但其只鑒定到了門分類水平，無法具體鑒定到門以下水平，可能是現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中關(guān)于此類菌群的信息較少，所以序列沒有得到高相似度的16S DNA比對結(jié)果。

2.3.3 基于目水平的蜂糧菌群多樣性分析

圖6 蜂糧菌群基于目分類水平的分布Fig. 6 Bacterial distribution at the order level

如圖6所示，測序結(jié)果表明蜂糧菌群主要由unidentified Oxyphotobacteria、unidentified Alphaproteobacteria、擬桿菌目（Bacteroidales）、假單胞菌目（Pseudomonadales）、梭菌目（Clostridiales）、腸桿菌目（Enterobacteriales）、unidentified Gammaproteobacteria、立克次氏體目（Rickettsiales）、互營桿菌目（Syntrophobacterales）、黃桿菌目（Flavobacteriales）等組成。這些菌均出現(xiàn)于整個發(fā)酵周期。

2.3.4 基于科水平的蜂糧菌群多樣性分析

圖7 蜂糧菌群基于科分類水平的分布Fig. 7 Bacterial distribution at the family level

如圖7所示，測序結(jié)果表明蜂糧菌群主要由unidentified Oxyphotobacteria、醋桿菌科（Acetobacteraceae）、unidentified Alphaproteobacteria、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、莫拉氏菌科（Moraxellaceae）、（Muribaculaceae）、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、unidentified Rickettsiales、unidentified Gammaproteobacteria、互營桿菌科（Syntrophobacteraceae）等組成。

2.3.5 基于屬水平的蜂糧菌群多樣性分析

圖8 蜂糧菌群基于屬分類水平的分布Fig. 8 Bacterial distribution at the genus level

如圖8所示，共鑒定出112 個屬：在發(fā)酵0.5 d的蜂糧中共鑒定出46 個屬，4 d的蜂糧中鑒定出個69 個屬，7 d的蜂糧中鑒定出77 個屬，12 d的蜂糧中鑒定出47 個屬，其中4 個樣品中有25 個共有菌屬。

基于屬水平，蜂糧最優(yōu)勢微生物為unidentified Oxyphotobacteria，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，unidentified Oxyphotobacteria受到抑制，發(fā)酵中期減少，發(fā)酵后期又增加。但unidentified Oxyphotobacteria始終是優(yōu)勢菌。此外，玫瑰單胞菌屬（Roseomonas）、unidentified Alphaproteobacteria、不動桿菌屬（Acinetobacter）、熱硫還原桿菌屬（Thermodesulforhabdus）、unidentified Gammaproteobacteria、短波單胞菌屬（Brevundimonas）均呈先增加后減少的趨勢，與unidentified Oxyphotobacteria基本一致。unidentified Alphaproteobacteria與unidentified Gammaproteobacteria在發(fā)酵第1天時，均為0，發(fā)酵中期才存在，很可能來自蜜蜂的腸道菌群。Gammaproteobacteria正是蜜蜂腸道的八大菌群；Stenotrophomonas、Sphingobacterium、Anaerobiospirillum、Odoribacter、Rhodococcus、Bacteroides、Geothermobacter、Calorithrix、Anaeromyxobacter在發(fā)酵第1天時，均為0，發(fā)酵后期才存在，說明這些菌產(chǎn)生于蜂糧的發(fā)酵后期；還有一些菌，如unidentified Gammaproteobacteria、念珠菌（Candidatus）、Nitrosopelagicus、SUP05 cluster、Candidatus Actinomarina、unidentified Bacteria、unidentifiedRhodospirillales、unidentifiedThermoplasmata、弧形菌屬（Vibrio）、Puniceispirillum、Aquibacter、嗜熱彎曲甲烷熱桿菌（Methanothermobacter）、Limnobacter、瘤胃梭菌屬（Ruminiclostridium）等在發(fā)酵初期和末期均不存在，只存在于發(fā)酵中期。

3 討 論

由于每個巢房內(nèi)可挖取的蜂糧樣品較少，小于0.1 g，進(jìn)行DNA提取的濃度太低，無法建庫進(jìn)行后續(xù)測序，故參考Vigneron等[24]的實驗方法，每次取樣時均勻選取位于巢脾不同位置的蜂糧樣品，將若干個巢房的蜂糧樣品混勻，進(jìn)行DNA的提取以提高DNA濃度，同時可以使蜂糧樣品更具代表性。

對不同發(fā)酵時間的蜂糧中的細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)和多樣性變化的研究表明，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，細(xì)菌物種多樣性和豐富度先升高后降低。但主要優(yōu)勢微生物并沒有改變，始終為生氧光細(xì)菌和變形菌，生氧光細(xì)菌是蜂糧中豐度最高的菌群。unidentified Oxyphotobacteria在發(fā)酵過程中豐度一直最高，為發(fā)酵過程的主要優(yōu)勢菌。

近年來，科研人員基于16S rRNA序列和宏基因組分析技術(shù)，對不同地區(qū)的西方蜜蜂的腸道菌群進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示有95%以上都屬于8大類群，分別是Gilliamella、Gammaproteobacteria、Snodgrassella、Bartonella、Acetobacteraceae、Lactobacillus、Lactobacillus acidophilus、Bifidobacterium[25-33]。本研究中發(fā)現(xiàn)的unidentified Alphaproteobacteria與unidentified Gammaproteobacteria在發(fā)酵第1天時均未被檢出，發(fā)酵中期才存在，很可能來自蜜蜂的腸道菌群。

Gilliamella、Lactobacillus、Bartonella、Bifidobacterium等幾種菌在蜂糧樣品中均被檢出。Gilliamella與Bifidobacterium均在第7天的樣品中含量最高；Lactobacillus在發(fā)酵初期含量最高，而后一直呈下降趨勢；Bartonella在發(fā)酵末期含量最高。Engel等[34]對西方蜜蜂腸道菌群宏基因組的分析發(fā)現(xiàn)：其腸道菌可能有多種功能，例如與宿主相互作用，形成生物膜，分解碳水化合物等，對病原菌的防御和免疫起著至關(guān)重要的作用。

Engel等[35]通過對Bartonella進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)：Bartonella含有VB12的合成系統(tǒng)，可以合成VB12供給蜜蜂；此外，Bifidobacterium、Lactobacillus和Gilliamella還具有合成果膠降解酶、糖苷水解酶和多糖水解酶等功能。而果膠纖維素是花粉內(nèi)壁的主要成分，果膠降解酶的合成表明這些菌群有助于蜂花粉釋放營養(yǎng)物質(zhì)。這些潛在的功能也從基因水平上以映了乳酸菌可能參與了蜜蜂體內(nèi)碳水化合物的代謝。

4 結(jié) 論

本實驗通過對卡尼鄂拉蜂不同發(fā)酵時間的蜂糧進(jìn)行高通量測序，分析和研究了蜂糧發(fā)酵過程中細(xì)菌群落的組成及其豐度變化，考察不同發(fā)酵時間對蜂糧發(fā)酵過程中菌群的影響，共27 個門、112 個屬的細(xì)菌被鑒定出?；陂T水平，Oxyphotobacteria和Proteobacteria是優(yōu)勢菌群?；趯偎剑浼Z最優(yōu)勢微生物為unidentified Oxyphotobacteria，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，unidentified Oxyphotobacteria受到抑制，發(fā)酵中期減少，發(fā)酵后期又增加，但unidentified Oxyphotobacteria始終是優(yōu)勢菌。生氧光細(xì)菌與光合作用有關(guān)[36]，從而推斷本實驗的優(yōu)勢菌unidentified Oxyphotobacteria可能與植物的光合作用有關(guān)，說明這種菌有可能來自于花粉源植物。此外，一些菌如unidentified Alphaproteobacteria與unidentified Gammaproteobacteria等，在發(fā)酵第1天時，均為0，發(fā)酵中期才存在，很可能來自蜜蜂的腸道菌群。進(jìn)一步驗證了Mattila等[37]認(rèn)為蜂糧中的菌群一部分來自于蜜蜂腸道菌群的研究結(jié)果。

蜂糧中主要的菌群為生氧光細(xì)菌門Oxyphotobacteria，在蜂糧中占到了80%以上，但其只鑒定到了門分類水平，無法具體鑒定到門以下水平，可能是現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中關(guān)于此類菌群的信息較少，所以序列沒有得到高相似度的16S DNA比對結(jié)果。研究結(jié)果對于蜂糧中該類微生物的分離鑒定具有重要意義。本研究為實現(xiàn)蜂糧工業(yè)化生產(chǎn)過程中發(fā)酵菌株的確定及發(fā)酵條件確定、進(jìn)一步篩選優(yōu)勢發(fā)酵菌株提供一定的參考依據(jù)。